Khóa luận Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập trên nem chua

ctic là quá trình chuyển hóa đường trong điều kiện kị khí (bắt buộc hay tùy nghi) thành acid lactic. Người ta tìm thấy các vi khuẩn (vi khuẩn lactic, Bacillus), các tảo (Chlorella), một vài loại nấm mốc thủy sinh, các protozoa, cũng như các cơ bắp của động vật đều có khả năng lên men lactic (Vương Thị Việt Hoa, 2006). Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm là lên men đồng hình và lên men dị hình.  Lên men đồng hình Phân giải glucose theo con đường EMP để chuyển thành pyruvat, sau đó khử trực tiếp hầu hết các pyruvat thành lactat nhờ vào enzyme lactat dehydrogenase. Sản phẩm chính là acid lactic chiếm 90%. Ngoài ra còn có các sản phẩm phụ chiếm tỉ lệ không đáng kể như acid acetic, ethanol, glycerin, CO2,… Các vi khuẩn tham gia như Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lb. delbruikii, Lb. acidophilus,… (Vương Thị Việt Hoa, 2006).  Lên men dị hình Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EMP. Chúng phân giải kị khí đường glucose chủ yếu theo con đường pentophosphat (PP). Ngoài sản phẩm là acid lactic (40%) còn tạo ra một lượng lớn các sản phẩm khác như acid succunic và ethanol (20%), acid acetic (10%), CO2 và H2 (20%). Các vi khuẩn tham gia bao gồm Bacterium pentoaceticum, Lactobacterium casei, Lb. plantarum, Lb. bifrementans, Leuconostoc casei, Le. cremoris. - 16 - 2.4 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN LACTIC Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn Gram (+), có dạng trực khuẩn, cầu khuẩn hay cầu trực khuẩn, nhìn chung không di động, không sinh bao tử và các đặc tính sinh hóa âm tính khác như catalase, nitrate reductase và cytorome oxydase (Lý Ngọc Quí, 2006). Chúng có thể hô hấp kỵ khí hoặc kỵ khí tùy ý. Khoảng nhiệt độ thích hợp cho các vi khuẩn lactic hoạt động khá rộng. Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ tối thích từ 25 - 37oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích từ 50 - 65oC, nhóm ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ 5oC hoặc thấp hơn (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008). Vi khuẩn lactic được ứng dụng lâu đời trong nhiều loại thực phẩm lên men có nguồn gốc động hoặc thực vật vì các tác động có lợi của chúng về dinh dưỡng, cảm quan và cải thiện tuổi thọ sản phẩm. Vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các hợp chất kháng khuẩn. Trong đó, việc sản sinh acid lactic và acid acetic là quan trọng nhất. Tuy nhiên một số chủng vi khuẩn lactic còn được biết đến bởi việc sản sinh các phân tử có hoạt tính sinh học như ethanol, acid formic, các acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin,… Nhiều giống cũng sản sinh các bacteriocin và những phân tử thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương tự bacteriocin (De Vuyst và Leroy, 2007). 2.5 MỘT SỐ VI KHUẨN LACTIC THƯỜNG DÙNG TRONG THỰC PHẨM Một số giống vi khuẩn lactic nồng cốt liên quan đến quá trình lên men thực phẩm như Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus. 2.5.1 Lactobacillus Lactobacillus là giống lớn nhất trong LAB với hơn 80 loài và phân loài được công nhận (Limsowtin và ctv, 2002). Đây cũng là nhóm loài rất hỗn tạp với sự đa dạng về các đặc tính lý hóa, sinh hóa và kiểu hình nhưng chủ yếu là dạng que (Axelsson, 2004). Các Lactobacillus là những vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, thỉnh thoảng cặp đôi hoặc tạo thành chuỗi, không di dộng và catalsae âm tính. Phân bố rất nhiều trong tự nhiên và nhiều loài đã được ứng dụng trong thực phẩm, nhóm vi khuẩn này được ghi nhận là chịu acid cao nhất, có mặt trong cơ thể người (khoang miệng, đường tiêu hóa,...), và trong một số thực phẩm lên men như thịt, sữa, rau quả, ngũ cốc,... (Axelsson, 2004). Một số loài như Lb. casei, Lb. plantarum, - 17 - Lb. brevis,… tham gia trong quá trình làm chín phô mai; Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus là một trong hai loài vi khuẩn cho phép sử dụng trong lên men yogurt (Limsowtin và ctv, 2002). 2.5.2 Lactococcus Lactococcus có dạng hình cầu hoặc hình trứng, thường bắt cặp hoặc thành chuỗi. Có 5 loài Lactococcus (Lactococcus lactis, Lc. garvieae, Lc. plantarum, Lc. piscium và Lc. raffinolactis) hiện đang được công nhận. Tuy nhiên, chỉ có Lc. lactis subsp. lactis và Lc. lactis subsp. cremoris mới được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm (Limsowtin và ctv, 2002). Lactococcus lactis được phân lập từ sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa. Có khả năng vi khuẩn này nhiễm vào sữa trong quá trình vắt sữa và cho ăn. Lc. raffinolactis được phân lập từ sữa chưa tiệt trùng, từ đường ruột động vật và từ các môi trường trang trại nuôi bò. Lc. garvieae và Lc. piscium gây bệnh ở các loài cá, Lc. garvieae cũng liên quan tới bệnh viêm vú bò và nhiễm trùng ở người. Một số chủng Lc. lactis. subsp. lactis có khả năng chuyển hóa citrate, sản sinh CO2, diacetyl và các chất trung gian khác tạo hương thơm cho sản phẩm (ví dụ như bơ và phô mai Gouda). Nisin, một bacteriocin peptide sản sinh bởi các giống Lactococcus có sẵn trong thương mại được coi như là một phụ gia bền acid, được sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản thông qua việc ức chế hệ vi sinh vật Gram dương trong thực phẩm (Limsowtin và ctv, 2002). 2.5.3 Leuconostoc Leuconostoc có dạng hình cầu xếp chuỗi hoặc bắt cặp, lên men dị hình. Chúng thường được tìm thấy trên lá, ngũ cốc, nho và các cụm hoa. Những vi khuẩn này phát triển ở 20 - 30oC và không phát triển ở 45oC. Leuconostoc (đặc biệt là Ln. lactis và Ln. mesenteroides) có vai trò quan trọng trong việc lên men sữa do chúng có khả năng sinh CO2 và một lượng đáng kể diacetyl từ citrate trong sữa (Axelsson, 2004). Diacetyl là hợp chất chính tạo hương cho bơ chua, kem chua và phô mai tươi, còn CO2 thì đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mắt phô mai. Ngoài ra, nhóm vi khuẩn này còn đóng vai trò chủng khởi động trong việc lên men tự nhiên của rau quả (ví dụ như dưa cải). - 18 - 2.5.4 Streptococcus Nhóm vi khuẩn này có dạng hình cầu hoặc hình trứng, kết đôi hay dạng chuỗi, lên men đồng hình. Hiện đã có trên 50 loài Streptococus được nhận biết, những vi khuẩn này phân bố chủ yếu trong xoang miệng và ở đường hô hấp. Một số Streptococcus như Sp. mutans là tác nhân gây bệnh sâu răng và viêm màng tim (Axelsson, 2004). Về cơ bản, chỉ có Sp. thermophilus là được sử dụng trong sản xuất yogurt (cùng với Lb. delbrueckii. subsp. bulgaricus) và phô mai. Vi khuẩn này được sử dụng như một tác nhân acid hóa để đông tụ lactic. 2.5.5 Pediococcus Pediococcus có dạng tứ cầu, vi hiếu khí, phát triển từ 20 - 30oC và không phát triển ở 45oC, ưa acid và lên men đồng hình. Hiện có 7 loài Pediococcus được nhận biết. Những vi khuẩn này thường được tìm thấy với một lượng lớn trên lá nho, dưa bắp cải lên men, trái oliu và bia. Pediococcus quan trọng trong thực phẩm về cả hai mặt tiêu cực và tích cực. Pe. damnosus là vi sinh vật gây hư hỏng chính trong sản xuất bia, vì sự sinh trưởng của chúng có thể dẫn đến việc hình thành diacetyl/acetoin tạo ra vị bơ. Pe. acidilactici và Pe. pentosaceus được sử dụng như các chủng khởi động cho việc làm xúc xích lên men. Pediococcus cũng tham gia vào quá trình làm chín phô mai góp phần làm tăng hương vị cho phô mai (Axelsson, 2004). 2.6 BACTERIOCIN 2.6.1 Khái niệm chung Bacteriocin là các peptide được sản sinh tự nhiên bởi một vài vi khuẩn để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật cạnh tranh khác, chúng có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu là ức chế các loài gần với các chủng sản sinh bacteriocin (Parada và ctv, 2007). Những hợp chất này được tìm thấy trong hầu hết các loại vi khuẩn nhưng chỉ có một số loài trong chúng được nghiên cứu kĩ. Hiện nay các bacteriocin sản sinh bởi LAB được quan tâm nhiều nhất vì LAB được coi là vi khuẩn an toàn cho người tiêu dùng do chúng và các chất chuyển hóa của chúng không tạo nên những tác dụng phụ khi được sử dụng trong các thực phẩm lên men (Ruiz-Larrea và ctv, 2005). Các - 19 - bacteriocin sản sinh bởi LAB có những ứng dụng quan trọng trong bảo quản thực phẩm. Những vi khuẩn lactic này tạo ra các protein miễn dịch đặc hiệu để tự bảo vệ, chống lại tác động kháng khuẩn của bacteriocin của chúng (Cintas và ctv, 2001). Có thể nói nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên cứu của Gratia và ctv vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của Escherichia coli (colicin V) (Desriac và ctv, 2010; Ruiz-Larrea và ctv, 2005). Thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vi khuẩn Gram (+) được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.; Listeria sp. và Staphylococcus sp. Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin. Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu về bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm (Desriac và ctv, 2010). 2.6.2 Phân loại Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại kết hợp với các tiêu chí khác nhau. Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là trình tự chuỗi amino acid (Desriac và ctv, 2010). Một cách tổng quát, bacteriocin được chia thành 3 lớp: lớp I, lớp II và lớp III. 2.6.2.1 Lớp I Bacteriocin lớp I hay còn được gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một thành viên nổi tiếng của nhóm này là nisin (Parada và ctv, 2007). Các Lanbiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc. a) Phân lớp Ia Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng hoạt động bằng cách hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhắm đến (Ouwehand và Vesterlund, 2004). - 20 - Nisin thuộc nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34 amino acid. Có 2 biến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z, chúng chỉ khác nhau bởi amino acid thứ 27: histidine trong nisin A được thay thế bởi asparagin trong nisin Z. Cấu trúc của nisin được thể hiện ở Hình 2.1. Hình 2.1: Cấu trúc của nisin (Nguồn: Ruiz-Larrea và ctv, 2005) Loại bacteriocin này, được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp. (Ouwehand và Vesterlund, 2004). Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium (Deegan và ctv, 2006; trích dẫn bởi Parada và ctv, 2007). Nisin cũng được ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra (Broadbent và ctv, 1989; trích dẫn bởi Parada và ctv, 2007). b) Phân lớp Ib Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm (Parada và ctv, 2007). 2.6.2.2 Lớp II Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng lượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các bacteriocin nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc. - 21 - a) Lớp IIa Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 và sakacin P. Các bacteriocin nhóm này hứa hẹn cho nhiều ứng dụng công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng Listeria mạnh của chúng. Thậm chí chúng còn là các tác nhân kháng Listeria được chú ý nhiều hơn là bacteriocin lớp I (nisin) vì chúng không có phổ ức chế rộng và vì vậy, chúng không tiêu diệt các giống khởi động (Ouwehand và Vesterlund, 2004). b) Lớp IIb Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, những peptide này ít hoặc không hoạt động. Các bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là lactococcin G, plantaricin EF và plantaricin JK (Parada và ctv, 2007). c) Lớp IIc Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không đồng nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Trong phân lớp này chỉ tìm thấy các bacteriocin như divergicin A và acidocin B (Parada và ctv, 2007). 2.6.2.3 Lớp III Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn 30 kDa, không bền nhiệt. Nhóm này có thể bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin. Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của giống Lactobacillus (Ouwehand và Vesterlund, 2004). 2.6.3 Cơ chế hoạt động Các bacteriocin thường có hiệu quả chống lại các vi khuẩn Gram (+) như Bacillus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium. Các bacteriocin của LAB có thể không hiệu quả khi ức chế vi khuẩn Gram (-) vì màng ngoài của chúng gây trở ngại cho hoạt động của bacteriocin. Những màng này ngăn cản các phân tử như chất kháng sinh, chất tẩy rửa và thuốc nhuộm xâm nhập tế bào chất (De Martinis và ctv, 2001). Tuy nhiên, có một vài nghiên cứu đã công bố hoạt động của bacteriocin chống lại các vi khuẩn nhóm này, ví dụ như plantaricin 35d sản xuất bởi Lactobacillus plantarum chống lại Aeromonas hydrophila (Messi và ctv, 2001), thermophylin sản - 22 - xuất bởi Streptococcus thermophillus hoạt động chống lại E. coli và Yersinia enterocolitica (Ivanova và ctv, 1998). Các cơ chế hoạt động khác nhau đã được đề ra cho các bacteriocin như thay đổi hoạt động enzyme, ức chế sự nảy mầm của bào tử và ngừng hoạt động của các chất mang anion thông qua sự hình thành của các lỗ (Abee, 1995). Các bacteriocin từ LAB có thể hoạt động thông qua các cơ chế khác nhau để phát huy tác dụng kháng khuẩn nhưng màng tế bào thường là đích được nhắm đến. Sự tương tác tĩnh điện ban đầu giữa màng tế bào và peptide của bacteriocin được cho là động lực cho các chuyển biến tiếp theo (Deegan, 2006) Các bacteriocin có thể có tính diệt khuẩn hoặc định khuẩn, tác động này chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi một số yếu tố như lượng bacteriocin và độ tinh khiết của nó, tình trạng sinh lý của các tế bào chỉ thị và các điều kiện thí nghiệm (Cintas, 2001) Có khả năng là lớp I và II sử dụng cùng các cơ chế hoạt động giống nhau. Các peptide liên kết màng huyết tương thông qua các tương tác tĩnh điện với các phospholipid tích điện âm. Vì vậy, việc thâm nhập của bacteriocin ngang qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng, được điều khiển bởi pH và phospholipid. Các đơn phân tử của bacteriocin hình thành các khối proteic dẫn đến việc hình thành lỗ kết quả là dẫn đến sự thất thoát của các ion (chủ yếu là K và Mg), tổn thất lượng proton trong tế bào chất, thất thoát ATP và acid amin. Lượng proton trong tế bào chất có vai trò cơ bản trong sự tổng hợp ATP và trong sự di chuyển của vi khuẩn; vì vậy, việc tổng hợp của các phân tử lớn cũng như sản xuất năng lượng bị ức chế, dẫn đến chết tế bào đích (Bruno và Montville, 1993). Phương thức hoạt động của các bacteriocin nhóm III không được biết đến. Do đó, đòi hỏi phải nghiên cứu nhiều hơn để làm sáng tỏ nó (Parada và ctv, 2007). 2.6.4 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin 2.6.4.1 Lợi ích của bacteriocin Ngày nay, áp dụng rộng rãi các bacteriocin trong lĩnh vực thực phẩm đã mang đến những lợi ích nhất định so với việc sử dụng những chất bảo quản hóa học truyền thống như: - 23 -  Bacteriocin chứng minh tính an toàn của chúng trong chuỗi thực phẩm dành cho người. Chúng có ít hạn chế hơn so với những chất bảo quản hóa học vì là các phân tử được sản sinh tự nhiên bởi vi sinh vật lên men trong thực phẩm lên men truyền thống (Ruiz-Larrea, 2005).  Không gây tác động đến môi trường vì chúng bị thoái biến nhanh chóng.  Các bacteriocin được sử dụng như nguồn thức ăn chủ yếu đối với các tác nhân gây bệnh mà không làm ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi (Ouwehand và Vesterlund, 2004).  Bacteriocin không làm thay đổi các tính chất cảm quan của thực phẩm (Ruiz-Larrea, 2005).  Chúng có phổ hoạt động rõ ràng.  Có tác dụng bổ sung cho các tác nhân kháng khuẩn. 2.6.4.2 Hạn chế của bacteriocin Với những lợi ích trên bacteriocin ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp như một loại kháng sinh an toàn. Tuy nhiên, chúng cũng có một số mặt bất lợi sau:  Ít được biết đến hơn so với các chất bảo quản hóa học.  Bị thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein.  Chi phí cao trong việc đáp ứng các tính năng kỹ thuật.  Chỉ có hiệu quả chống lại một số loại vi khuẩn nào đó. Trên thực tế, có những rào cản pháp lý yêu cầu sự công nhận và chấp thuận cụ thể đối với việc sử dụng chúng ở dạng tinh khiết và bán tinh khiết (Ruiz-Larrea, 2005). - 24 - Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Đề tài được thực hiện từ 5/4/2010 đến 10/7/2010 tại phòng thí nghiệm Vi sinh và Hóa sinh thuộc khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Môi trường và thiết bị phân tích  Môi trường và thuốc thử: - Thạch và canh MRS (Merck, pH= 5,7± 0,2) để phân lập, tăng sinh và giữ giống vi sinh vật. - Môi trường NB (Difco) để tăng sinh và giữ giống vi sinh vật gây bệnh. - Môi trường MRD dùng để pha loãng. - Môi trường TSA (Difco) dùng để thực hiện thí nghiệm khuếch tán trên đĩa thạch. - Môi trường carbohydrat dùng khảo sát khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn lactic phân lập. - Thuốc thử Uphenmen dùng khảo sát sự hiện diện của acid lactic. - Thuốc thử peroxyde hydrogene 10% để thử phản ứng catalase. - Thuốc nhuộm Gram: gential violet, lugol và fuschine.  Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, micropipet, que cấy, đèn cồn…  Thiết bị: Máy dập mẫu (Seward, Anh), máy li tâm (MSE Mistral 1000, Anh), autoclave (Sanyo, Nhật), cân điện tử (Ohaus, Mĩ), vortex (Velp, Ý), máy đo pH (Metrohm, Mỹ), tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi,… 3.2.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm Nem khảo sát được lấy sau 4 ngày lên men của 5 cơ sở: Bà Chín (Thủ Đức, tp. Hồ Chí Minh), Ninh Hòa (Nha Trang, Khánh Hòa), Giáo Thơ (Lai Vung, Đồng Tháp), - 25 - Vissan (tp. Hồ Chí Minh) và Năm Thu (Bình Định). Trong đó, nem Bà Chín, nem Ninh Hòa và nem Năm Thu là sản phẩm của quá trình lên men tự nhiên còn quá trình lên men của nem Giáo Thơ và nem Vissan là có sử dụng giống khởi động. Năm chủng gây bệnh được bảo quản đông lạnh (-20oC) được sử dụng làm chủng chỉ thị, bao gồm:  Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP 20256  E. coli ATCC 25922  Bacillus cereus CIP 6624T  Listeria monocytogenes CIP 82110 T  Salmonella indiana LMBA Thuốc kháng sinh Ofloxacin 200 mg được bán trên thị trường được sử dụng làm mẫu đối chứng cho thí nghiệm khuếch tán trên thạch. 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chúng tôi đã thực hiện các công việc như sau:  Khảo sát hệ vi khuẩn lactic của nem sau 4 ngày lên men của năm cơ sở.  Thực hiện các phản ứng sinh hóa tiền định danh vi khuẩn lactic.  Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được. 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các thao tác tiến hành nghiên cứu được tóm lược trong Hình 3.1. - 23 - Hình 3.1: Tiến trình thực hiện các khảo sát Lấy mẫu Đồng nhất mẫu Huyền phù mẹ Đo pH Pha loãng mẫu ở các nồng độ từ 10-2 đến 10-7 Cấy lên môi trường thạch MRS Ủ 30oC / 48 giờ - Đếm số lượng khuẩn lạc - Tính phần trăm dạng khuẩn lạc - Giữ giống. - Cấy chuyền. Kiểm tra các phản ứng sinh hóa - Nhuộm Gram - Catalase - Di động - Kiểu lên men - Khả năng sinh acid lactic Khảo sát khả năng kháng khuẩn Khảo sát sơ bộ Khuếch tán trên thạch - 24 - 3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên nem ngày bốn của năm cơ sở khảo sát 3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu Đối với mỗi cơ sở chế biến nem khảo sát, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lặp lại 3 lần ở những lô sản xuất khác nhau. Các mẫu nem chua được vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để tiến hành phân tích trong thời gian sớm nhất. 3.4.1.2 Đồng nhất mẫu Sau khi tiệt trùng dao kĩ bằng cồn, dao được hơ trên ngọn lửa đèn cồn cho bay hết hơi cồn và để nguội. Dùng dao cắt nhỏ mẫu nem và lấy khoảng 10 g mẫu nem cho vào bao PE vô trùng. Sau đó cho thêm dung dịch MRD vào bao theo tỉ lệ 9 MRD:1 nem. Việc đồng nhất mẫu được thực hiện với máy Stomacher trong 2 phút. Sau khi đồng nhất, thu được dung dịch huyền phù mẹ (S1). 3.4.1.3 Kỹ thuật đo pH Dung dịch S1 sẽ được đem đi đo pH. Trước khi đo, đầu pH kế được lau sạch; sau đó, được cắm vào dung dịch mẫu sao cho dung dịch ngập qua đầu dò của pH kế. Mỗi mẫu được đo lặp lại 3 lần và giá trị pH ghi nhận cho mỗi mẫu là trung bình của 3 lần đo lặp lại. 3.4.1.4 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic  Pha loãng mẫu và cấy đĩa Tiến hành pha loãng thập phân dung dịch S1 đến nồng độ 10-7 bằng dung dịch MRD. Dùng micropipet hút 0,1 mL dung dịch ở các nồng độ 10-5, 10-6 và 10-7 cho vào đĩa petri. Dùng que cấy trang đã khử trùng trang đều lên bề mặt thạch cho đến khi thấy bề mặt thạch khô. Ở mỗi nồng độ pha loãng chúng tôi tiến hành lặp lại 2 lần. Trình tự các thao tác được trình bày qua Hình 3.2. Hình 3.2: Trình tự pha loãng cho việc đếm vi khuẩn lactic - 25 -  Phương pháp ủ Các đĩa petri sau khi cấy xong sẽ được ủ kị khí ở 30oC trong 48 giờ. Việc ủ kị khí được tiến hành bằng cách để các đĩa petri vào trong các bình hút ẩm, đặt vào đó ngọn đèn cồn đã được thắp sáng, đậy chặt nắp, khi ngọn lửa đèn cồn tắt đồng nghĩa với việc oxy trong bình đã được tiêu thụ hết. 3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền Sau khi ủ ở 30oC trong 48 giờ, việc đếm khuẩn lạc được thực hiện trên các đĩa có số lượng khuẩn lạc từ 15 đến 300. Số lượng khuẩn lạc đếm được trong hai đĩa ở hai nồng độ liên tiếp được tính bởi công thức sau: ).1,0.(. 21 nndV C N    (CFU/g) Trong đó: N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g mẫu. C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n1: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ 1 n2: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ 2 V: thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa d: nồng độ pha loãng đầu tiên được nuôi cấy. Số lượng trung bình của khuẩn lạc được đếm cho 3 lần lặp lại của 1 mẫu thí nghiệm: 3 321 NNNN  (CFU/g) Với N1, N2, N3 là tổng số khuẩn lạc được tính trong lần lặp lại thứ nhất, thứ hai và thứ ba. Sau khi đếm khuẩn lạc, với quan sát bằng mắt thường, các dạng khuẩn lạc hiện diện được ghi nhận dựa trên hình dạng và kích thước của chúng. Đối với mỗi dạng khuẩn lạc chúng tôi tiến hành cấy chuyền và giữ giống bằng cách lấy khuẩn lạc cho vào ống eppendorf vô trùng có chứa 1 mL canh MRS và ủ ở 37oC trong 24 giờ trong tủ ấm. Sau đó, cấy chuyền lên môi trường thạch MRS và ủ ở 37oC trong 48 giờ để tiến hành các phản ứng sinh hóa tiếp theo. Những ống eppendorf được bổ sung glycerol tiệt trùng hai lần với thể tích 10% thể tích dịch khuẩn, sau đó được bảo quản đông lạnh để giữ giống. - 26 - 3.4.2 Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic phân lập 3.4.2.1 Nhuộm Gram Sau khi ủ ở 37oC trong 48 giờ, các chủng vi khuẩn phân lập, đại diện cho các dạng khuẩn lạc được nhuộm Gram. Việc quan sát dưới kính hiển vi sau đó cho chúng tôi khái niệm ban đầu về hình thái tế bào vi sinh vật như khả năng bắt màu (Gram (+) hay Gram (-)); dạng vi khuẩn (hình que, cầu hay hình trứng) cũng như cách sắp xếp của chúng (xếp chuỗi, bắt cặp hay riêng lẻ). 3.4.2.2 Phản ứng catalase Lấy khuẩn lạc cho lên trên miếng lame sạch, sau đó nhỏ một giọt H202 10% lên. Nếu thấy xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là dương tính còn không xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là âm tính. 3.4.2.3 Khảo sát khả năng di động Dùng que cấy vô trùng để lấy khuẩn lạc và cấy sâu vào trong ống nghiệm có chứa 10 mL môi trường thạch mềm MRS (4 g agar/L môi trường) và đem ủ ở 37oC trong 48 giờ trong điều kiện kị khí, tính di động của vi sinh vật được quan sát bởi sự phân tán vi sinh vật trong môi trường so với đường cấy: nếu vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động, nếu vi khuẩn mọc theo đường cấy thì chúng không có khả năng di động. 3.4.2.4 Kiểm tra kiểu lên men Cho khuẩn lạc vào trong ống nghiệm có chứa môi trường carbohydrat đã thêm bromocresol tía. Ủ các ống nghiệm này ở 37oC trong 24 giờ. Tiến hành kiểm tra khả năng sinh khí của vi sinh vật bằng cách dùng que cấy đã hơ thật nóng trên ngọn lửa đèn cồn rồi nhúng nhanh vào trong ống nghiệm. Nếu thấy xuất hiện những bọt khí nhỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh khí; ngược lại, vi khu