Khóa luận Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhận hợp chất Anthraquinone

ng điều kiện sinh trƣởng nhƣ môi trƣờng dinh dƣỡng, ánh sáng, nhiệt độ hay thành phần các chất kích thích cũng tƣơng tự nhƣ lúc tạo mô sẹo hoặc nếu có thay đổi thì chỉ thay đổi rất ít. Trong môi trƣờng lỏng, từ mô sẹo có thể phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào từ vài chục đến cả trăm tế bào giúp tăng diện tích hấp thu các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài ra hoạt động của máy lắc cũng giúp cho sự trao đổi khí giữa môi trƣờng và tế bào đƣợc thuận lợi hơn. Một huyền phù tế bào đƣợc cho là lý tƣởng khi nó là một dịch mịn, hầu nhƣ gồm những yếu tố có khả năng sinh phôi, nói cách khác là những tế bào cô lập hay 20 hợp thành từng nhóm nhỏ từ vài đến khoảng 20 tế bào có khả năng duy trì tính toàn năng và tiến hóa thành phôi soma trên môi trƣờng tái sinh trong điều kiện thích hợp. 2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào [7] - Hệ thống nuôi cấy. - Ánh sáng, nhiệt độ. - Mật độ tế bào khởi đầu. - Môi trƣờng nuôi cấy. - Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật - Sự tăng trƣởng và cấy chuyền huyền phù tế bào. - Điều kiện môi trƣờng. - Cụm tế bào trong dịch huyền phù. 2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay [6], [20] Có nhiều phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù tế bào khác nhau đã đƣợc phát triển, nhƣng có hai phƣơng pháp chính :  Nuôi cấy gián đoạn Tế bào thực vật đƣợc nuôi trong một thể tích (100 ml - 10 lít) hỗn hợp môi trƣờng. Trong giai đoạn phát triển của tế bào, số lƣợng tế bào ban đầu gia tăng cho đến khi dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt hoặc có sự tích lũy chất trao đổi đến mức kìm hãm. Các môi trƣờng nuôi cấy quy mô nhỏ đƣợc chuyển động liên tục trên máy lắc hay trong bình phản ứng đƣợc phối trộn đều. Môi trƣờng trong bình chứa thƣờng chiếm 1/5 thể tích. Máy lắc đƣợc điều chỉnh ở vận tốc 30 - 180 vòng/phút biên độ 3 cm. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là không sử dụng trong nghiên cứu dài hạn về sự phát triển tế bào và sự trao đổi chất, khó nhận đƣợc sự ổn định trong sản xuất. Các tế bào nuôi cấy gián đoạn không đồng nhất về kích thƣớc và cấu tạo. Để đảm bảo yêu cầu nuôi cấy phải cấy chuyền thƣờng xuyên quần thể tế bào vào môi trƣờng mới sau những khoảng thời gian bằng nhau. 21 Hình 2.7: Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc [44].  Nuôi cấy liên tục Đây là một phƣơng pháp quan trọng đƣợc dùng để sản xuất hợp chất sơ cấp hay thứ cấp trên quy mô lớn. Kỹ thuật này đòi hỏi phải có hệ thống thiết bị phức tạp. Sự chuyển động của môi trƣờng nuôi cấy lớn trong các bồn phản ứng sinh học đƣợc thực hiện bằng cách khuấy với một turbin và (hoặc) sục không khí vô trùng vào môi trƣờng từ dƣới đáy. Phƣơng pháp nuôi cấy này cho phép giữ vô trùng cả hệ thống trong một thời gian dài. Hình 2.8: Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm [45]. 22 2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp - Chất điều hòa sinh trƣởng (hormone thực vật) bao gồm các auxin nhƣ: IAA, NAA, 2,4-D ; các cytokinin nhƣ: BAP, kinetin… - Nguồn đạm. - Nguồn carbon. - Ánh sáng. - Các yếu tố khác: pH môi trƣờng, nồng độ phosphate, các loại khí (O2, CO2, …) 2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù [22] Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù có thể kể đến: 2.2.4.1. Tối ƣu hoá điều kiện nuôi cấy Khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào có thể chịu ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố vật lý (nhƣ nhiệt độ, độ thông khí, tốc độ lắc, ánh sáng, pH…) và hoá học (nhƣ chất điều hoà tăng trƣởng thực vật), thành phần các chất trong môi trƣờng nuôi cấy…Tuỳ từng loại tế bào mà sự đáp ứng với các yếu tố kể trên sẽ khác nhau. Khi xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu thì sự sản xuất và tích luỹ các hợp chất thứ cấp trong tế bào in vitro sẽ cao hơn so với cây trồng ngoài thiên nhiên. Phƣơng pháp này đã đạt đƣợc thành công lớn trong trƣờng hợp của shikonin và berberine [31]. 2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thể tế bào có nhiều kiểu gen khác nhau, do đó các đặc tính sinh lý của tế bào sẽ khác nhau. Phƣơng pháp chọn lọc dòng tế bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng sản lƣợng các hợp chất thứ cấp. 2.2.4.3. Bổ sung tiền chất Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng những hợp chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đƣờng sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp nào đó. Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh 23 tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn vào môi trƣờng nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả sản xuất của tế bào trong một số trƣờng hợp xác định. Phƣơng pháp này sẽ có giá trị khi giá thành của các tiền chất không quá đắt. 2.2.4.4. Cố định tế bào Trong li ̃nh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận các sản phẩm thứ cấp, việc cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử dụng, đặc biệt là trong các hệ thống phản ứng sinh học. Mặt khác, những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi trƣờng hơn so với tế bào tự do. Tế bào cố định thƣờng là những tế bào có khả năng tiết các sản phẩm thứ cấp ra môi trƣờng ngoài. Tế bào ở trạng thái cố định đôi khi tạo ra đƣợc các hợp chất thứ cấp có sản lƣợng cao hơn tế bào ở trạng thái lơ lững tự do. Các chất đƣợc sử dụng để cố định tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar, các sợi propylen,… Sự cố định tế bào giúp tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp nhƣng cũng không loại trừ khả năng chính những chất cố định lại là tác nhân kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp. 2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hoá mô Dịch treo tế bào thƣờng đƣợc sử dụng để thu nhận các sản phẩm thứ cấp. Tuy nhiên, gần đây, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc nuôi cấy những mô đã phân hoá nhƣ nuôi cấy thân, chồi, hay rễ tơ,…nhằm thu nhận hợp chất thứ cấp. Các nghiên cứu chứng minh rằng có mối quan hệ mật thiết giữa sự sản xuất các hợp chất thứ cấp với sự phân hoá tế bào và sự phát sinh hình thái của thực vật. 2.2.4.6. Nhân tố cảm ƣ́ng (elicitor) Theo Rhoberts và Shuler (1999), tiến trình cảm ứng biểu hiện gene của các enzyme xúc tác tổng hợp các chất biến dƣỡng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật đƣợc biết đến nhƣ là sự cảm ứng (elicitation) [26]. Elicitation trong sản suất hợp chất thứ cấp của tế bào thực vật xảy ra do sự tiếp xúc giữa tế bào thực vật với các biotic và abiotic elicitor. Thuật ngữ “elicitor” đƣợc sử dụng đầu tiên cho các tác nhân kích thích bất kỳ dạng phản ứng phòng vệ nào của cây với các bệnh lý xuất hiện trên đồng ruộng. Thực vật có thể sản xuất ra các chất kháng sinh biến dƣỡng thứ cấp nhƣ các phytoalexin trong các phản ứng chống lại sự tấn công của vi khuẩn. 24 Hình 2.9: Sắc ký côṭ [47]. Do đó, các vi sinh vật (đặc biệt là nấm và các thành phần của chúng) đã đƣợc sử dụng rộng rãi để cảm ứng sản xuất hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật [18]. 2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn 2.3.1. Phƣơng pháp ly trích - thu nhận hợp chất [8] 2.3.1.1. Sắc ký cột Luận văn sử dụng hệ thống sắc ký cột hở với chất hấp thụ là silica gel trong qui trình ly trích và thu nhận hợp chất anthraquinone (Hình 2.9).  Khái niệm Sắc ký cột hở là một hệ thống vật lý trong đó có một cột đƣợc nạp chặt chẽ bởi một chất hấp thụ và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua. Tùy thuộc và loại chất hấp thu để nạp cột và pha động, ngƣời ta phân biệt một số cơ chế tách: sắc ký hấp thu, sắc ký phân chia, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực…  Nguyên tắc của sắc ký cột Sắc ký cột căn cứ trên khả năng mà phân tử chất tan có thể tƣơng tác với pha tĩnh. Những tƣơng tác này sẽ lần lƣợt làm chậm sự di chuyển của những chất tan khác nhau, khi chúng di chuyển xuyên qua chất hấp thụ để ra khỏi cột. Các 25 tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể là nối hydrogen, nối Val der Waal, tƣơng tác lƣỡng cực - lƣỡng cực, tƣơng tác acid - bazơ, sự tạo phức. . .  Chất hấp thụ silica gel Silica gel là polimer ba chiều của những tứ diện oxid silicon SiO2.H2O. Đây là những nguyên liệu có lỗ rỗng. Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cột có diện tích bề mặt khoảng 100 - 800 m2/g, đƣờng kính hạt trung bình là 40 - 200 m và các lỗ rỗng trên bề mặt có đƣờng kính trung bình 40 - 300 A0. Trên bề mặt các hạt silica gel có mang những nhóm silanol-OH. Đây là trung tâm hoạt động có thể tạo nên những nối hydrogen mạnh với những hợp chất đƣợc sắc ký. Vì thế, những hợp chất nào có khả năng tạo nối hydrogen mạnh hợp chất đó sẽ bị silica gel giữ mạnh lại trong cột. Nhƣ vậy những hợp chất phân cực mạnh có chứa nhóm chức acid carboxilic, amin, amid sẽ hấp thụ mạnh vào silica gel trong khi những hợp chất kém phân cực nhƣ alkan, terpen (những hợp chất không chứa các nhóm chức có thể tạo nối hydrogen) sẽ ít bị giữ. Ngoài ra một hợp chất có thể bị silica gel giữ lại mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi ly giải.  Nguyên tắc cơ bản khi sử dụng sắc ký cột Lựa chọn dung môi giải ly: trong loại sắc ký cột hấp thu, hợp chất không phân cực sẽ đƣợc ly giải khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Thông thƣờng ngƣời ta bắt đầu bằng dung môi không phân cực để loại tƣơng đối các hợp chất không phân cực ra khỏi cột và tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly để đuổi các hợp chất có tính phân cực mạnh hơn. Nhƣng nếu thay đổi dung môi phân cực hơn một cách đột ngột sẽ làm gãy cột. Kích thƣớc cột và lƣợng mẫu chất: Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lƣợng mẫu chất cần phân tách. Kích thƣớc cột cần đạt tỷ lệ về chiều cao – đƣờng kính là 8:1. Trọng lƣợng chất hấp thụ và trọng lƣợng mẫu phải tuân theo một tỷ lệ tƣơng ứng. Trung bình thì trọng lƣợng chất hấp thụ phải lớn hơn 25 - 50 lần trọng lƣợng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lƣợng). Tuy nhiên, với những hỗn hợp mà các hợp chất không dễ dàng tách riêng thì cần sử dụng cột lớn hơn với số lƣợng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100 - 500 lần). 26 Hình 2.10: Mô hình sắc ký nhanh côṭ khô [8]. 2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry – Column Flash Chromatography) [8]  Khái niệm Sắc ký nhanh cột khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất kém để gia tăng vận tốc ly giải của pha động. Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là cột sắc ký đƣợc rút khô sau mỗi phân đoạn thu đƣợc.  Chất hấp thụ Sử dụng silica gel loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (Merk 60H hoặc 60 G; tức 40 - 15 m hoặc alumina loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (10 m, diện tích bề mặt riêng lớn: 500 m2.g-1).  Mô tả hệ thống - Phễu lọc xốp bằng thủy tinh. Độ xốp của lỗ thuộc loại 3 hoặc loại D. Phễu có đủ kích cỡ lớn nhỏ (loại 100; 150; 250; 500 ml…) thích hợp với lƣợng mẫu cần sắc ký (Bảng 1.4). - Bình tam giác. - Hệ thống tạo áp suất bằng vòi nƣớc (20 - 70 mmHg; chỉ cần áp suất vừa phải). 27 2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế [8]  Khái niệm Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng, trong đó pha động là chất lỏng đƣợc cho đi ngang qua một lớp chất hấp thụ trơ (ví dụ silica gel hay alumina) chất hấp thu này đƣợc tráng thành một bản mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thụ đƣợc tráng thành một lớp mỏng nên phƣơng pháp này gọi là sắc ký bản mỏng. Một hợp chất tinh chất khi sắc ký bản mỏng sẽ cho một vết, với giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi ly giải xác định, bởi bảng sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Với: Khoảng cách di chuyển của hợp chất Rf = Khoảng đƣờng di chuyển của dung môi Giá trị Rf không bao giờ lớn hơn 1 và thay đổi tùy theo: loại chất hấp thu dùng để tráng bản mỏng, thành phần dung môi giải ly, độ bão hòa dung môi, kỹ thuật ly giải. Hình 2.11: Sắc ký lớp mỏng [46]. 28  Ƣu điểm Ƣu điểm của sắc ký bản mỏng điều chế với sắc ký cột là: nhanh, dễ tìm đƣợc dung môi thích hợp để giải ly tách tốt các chất; các vùng có chứa chất cần thiết sẽ tụ lại thành lớp mỏng dễ dàng phát hiện, dễ dàng cô lập chất. Sở dĩ sắc ký lớp mỏng tách tốt là nhờ tỷ lệ lớn giữa “chất tách : chất hấp thụ silica gel” (1:1000 đến 1: 10.000) trong khi tỷ lệ này ở sắc ký cột là 1:50.  Nhƣợc điểm Chỉ sử dụng đƣợc sắc ký điều chế khi hỗn hợp chất cần tách chỉ chứa khoảng 4 thành phần chính và có trọng lƣợng nhỏ vài trăm miligram; còn nếu có một mẫu chất vài gram thì nên sử dụng sắc ký cột vì các bảng sắc ký điều chế rất đắt tiền. 2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp  Nguyên tắc Nguyên tắc của kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng không trộn lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua một chất lỏng đứng yên (pha tĩnh). Pha tĩnh bị hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang). Thông thƣờng pha tĩnh là dung môi phân cực, pha động thƣờng là nƣớc hoặc dung môi hữu cơ. Đôi khi pha tĩnh là các chất lỏng ít phân cực lúc đó pha động phải là dung môi ít phân cực hơn. 29  Các bộ phận chính của máy HPLC  Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp Phƣơng pháp HPLC có khả năng tách các chất đặc thù nhƣ: - Các hợp chất cao phân tử, ion thuộc đối tƣợng nghiên cứu y học, sinh học. - Các hợp chất tự nhiên không bền, các chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ. - Tách các acid nucleic, dƣợc phẩm, steroit, vitamine, chất bảo quản thực phẩm, chất bảo vệ thực vật, các phenol, các hydrocacbon trong dầu mỏ… Sơ đồ 2.2: Sơ đồ hoạt động các bộ phận của máy HPLC 30  Ƣu điểm Ngoài những ứng dụng rộng rãi đã nêu ở trên, HPLC còn có những ƣu điểm hơn sắc ký lỏng cổ điển nhƣ tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng đƣợc nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ dàng vì hầu hết các detector không phá hủy mẫu.  Nhƣợc điểm Xét về đầu tƣ trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kỹ thuật đắt tiền. 31 Chƣơng 3 3. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP  Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: từ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007. Địa điểm: các thí nghiệm nuôi cấy mô đƣợc thực hiện tại trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đaị hoc̣ Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Các thí nghiệm định lƣợng hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl đƣợc thực hiện tại phòng sắc ký, Viêṇ Công nghê ̣Sinh học và Công nghệ môi trƣờng, Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. 3.1. Nuôi cấy mô seọ, tạo dịch huyền phù 3.1.1. Vật liệu  Nguồn giống Nguyên liệu dùng cho thí nghiệm là cây Drosera burmanni Vahl, do phòng công nghệ sinh học thực vật, Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Các mẫu thí nghiệm đồng nhất về mặt di truyền (Hình 3.1). Hình 3.1: Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro. 32  Môi trƣờng - Môi trƣờng muối khoáng MS (Murashige Skoog, 1962) (Phụ lục 1) với thành phần khoáng đa lƣợng giảm 1/2 (ký hiệu là MS 1/2) bổ sung: - Đƣờng: 30 g/l. - Agar: 7 g/l. - Than hoạt tính: 1 g/l. - Casein hydrosylate: 100 mg/l. - pH = 5,8 ± 0,1 (trƣớc khi hấp khử trùng). - Hấp khử trùng bằng autoclave ở 1210 C, 1 atm, 20 phút. - Môi trƣờng muối khoáng Gamborg’s B5 (phụ lục) bổ sung : - Vitamin B1= 0,4 mg/l. - Vitamin B6 = 0,5 mg/l. - Vitamin PP = 0,5 mg/l. - PVP = 1,25 mg/l. - Casein hydrosylate: 100 mg/l. - Hormone tăng trƣởng thực vật: NAA, 2,4-D, BA, IBA có nồng độ thay đổi.  Điều kiện nuôi cấy - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày. - Cƣờng độ chiếu sáng: 3000 lux. - Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 22 – 250 C. - Độ ẩm trung bình: 70 %.  Trang thiết bị và dụng cụ - Trang thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, máy đo pH, cân phân tích. - Dụng cụ: chai nƣớc biển, đĩa petri, dao, kẹp cấy,… 33 3.1.2. Phƣơng pháp 3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Mục đích thí nghiệm Xác định thành phần khoáng và nồng độ đƣờng thích hợp để duy trì sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng TCL. Bố trí nghiệm thức Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, gồm 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 20 mẫu và đƣợc lập lại ba lần. Kết quả là trị số trung bình của 3 lần lập lại. Bảng 3.1: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển mẫu cấy lớp mỏng Loại môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l) 5 10 20 30 MS A1 A2 A3 A4 MS 1/2 A5 A6 A7 A8 Gamborg’s B5 A9 A10 A11 A12 Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi kết quả sau 14 ngày dựa trên chỉ tiêu là tỷ lệ (%) số mẫu còn sống. Chỉ tiêu này đƣợc xác định theo công thức: Số mẫu còn sống Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Phƣơng pháp tiến hành Các bộ phận gồm thân, lá non (lớp lá thứ nhất hay thứ hai) và phát hoa của cây Drosera burmanni Vahl in vitro đƣợc cắt thành các lớp mỏng (từ 0,2 - 0,5 mm), cấy vào các nghiệm thức nhƣ đã bố trí. 34 3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo Mục đích thí nghiệm Tìm sự kết hợp của các loại hormone thích hợp nhất cho việc tạo mô sẹo. Bố trí nghiệm thức Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức tiến hành trên 45 mẫu và đƣợc lập lại 3 lần, kết quả là trị số của 3 lần lập lại. Bảng 3.2: Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo Các loại hormone kết hợp (mg/l) NAA (0,2) 2,4-D (0,1) [12], [23] NAA (0,5) IBA (1) [28] NAA (1) BA (0,2) [5] Nghiệm thức B1 B2 B3 Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi kết quả sau 14 ngày nuôi cấy dựa trên chỉ tiêu là tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo, với: Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Cách thực hiện - Mẫu cắt lớp mỏng cây D. burmanni Vahl đƣợc đƣa vào các nghiệm thức trong đó môi trƣờng có thành phần khoáng và nồng độ đƣờng tối ƣu với mẫu cấy lớp mỏng đã tìm đƣợc từ thí nghiệm 1. - Ủ tối trong các thùng carton. 35 3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo Mục đích thí nghiệm Tìm nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo bằng phƣơng pháp lớp mỏng tế bào TCL. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 6 nghiệm thức trên mỗi loại vật liệu, mỗi nghiệm thức thực hiện trên 12 mẫu và đƣợc lập lại 3 lần. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại. Bảng 3.3: Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo Vật liệu đầu Nồng độ 2,4-D (mg/l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Phát hoa TCL C1 C2 C3 C4 C5 C6 Thân TCL C1’ C2’ C3’ C4’ C5’ C6’ Lá TCL C1” C2” C3” C4” C5” C6” Chỉ tiêu theo dõi Ghi nhận kết quả sau 21 ngày nuôi cấy với các chỉ tiêu sau: - Tỷ lệ mô sẹo tạo thành - Hình thái mô sẹo Với Số mẫu tạo sẹo Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Phƣơng pháp tiến hành Mẫu cắt lớp mỏng của phát hoa, thân, lá non đƣợc đƣa vào môi trƣờng có nồng độ 2,4-D thay đổi và ủ tối 21 ngày trong các thùng carton. 36 3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo Mục đích Tìm kiểu nuôi cấy thích hợp cho việc tăng sinh khối mô sẹo. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố và gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức tiến hành trên 1 bình, 3 lần lập lại. Kết quả là giá trị trung bình của 3 lần lập lại. Bảng 3.4: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo Kiểu nuôi cấy Rắn Bán rắn Lỏng tĩnh Lỏng lắc Nghiệm thức D1 D2 D3 D4 Chỉ tiêu theo dõi Chỉ tiêu theo dõi là khối lƣợng mô sẹo gia tăng sau 21 ngày nuôi cấy quy về 1 mg. Chỉ tiêu này đƣợc tính bằng công thức: Δm = [(m21 - m0)/m0] (mg) Trong đó : Δm: khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1mg ban đầu. m0: khối lƣợng mô sẹo ban đầu. m21: khối lƣợng mô sẹo sau 21 ngày nuôi cấy. Phƣơng pháp tiến hành Mô sẹo đƣợc cấy vào môi trƣờng với các kiểu nuôi cấy khác nhau, bổ sung hormone tăng trƣởng là 2,4-D và NAA với sự kết hợp hai nồng độ tối ƣu ở thí nghiệm 3. Các mô sẹo này đều đƣợc cân khối lƣợng trƣớc khi cấy. Sau 21 ngày nuôi cấy cân lại khối lƣợng mô sẹo và ghi nhận kết quả. Các kiểu nuôi cấy gồm: - Kiểu nuôi cấy dạng rắn: môi trƣờng có bổ sung agar (7 g/l). 37 - Kiểu nuôi cấy bán rắn: môi trƣờng lỏng, có bông gòn làm giá thể, không lắc. - Kiểu nuôi cấy lỏng tĩnh: môi trƣờng lỏng, không lắc. - Kiểu nuôi cấy lỏng lắc: môi trƣờng lỏng, lắc với tốc độ 150 vòng/phút. 3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hiǹh thành sắc tố đỏ của mô sẹo Mục đích: Bƣớc đầu ghi nhận ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố gồm 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 10 mẫu mô sẹo, lập lại 3 lần. Kết quả là trị số trung bình của 3 lần lập lại. Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo Điều kiện nuôi cấy Chiếu sáng 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn Nghiệm thức E1 E2 Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận tỷ lệ hình thành sắc tố đỏ ở mô se ̣ o sau 21 ngày nuôi cấy. Số mô sẹo hình thành sắc tố đỏ Tỷ lệ mô sẹo hình thành sắc tố đỏ (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Phƣơng pháp tiến hành Các mô sẹo đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung hormone NAA và 2,4-D ở nồng độ kết hợp tối ƣu (Thí nghiệm 3) trong hai điều kiện ủ tối hoàn toàn và chiếu sáng 16 giờ/ ngày. 38 3.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl 3.2.1. Vật liệu  Nguồn mẫu - Cây D. burmanni Vahl in vitro.  Hóa chất - Silica gel (Merck) - Benzene (Trung Quốc) - Chloroform (Trung Quốc) - Ether dầu hỏa (Trung Quốc) - Diethyl ether (Trung Quốc) - Methanol (Trung Quốc) - Thuốc thử Borntraeger ( KOH 5% trong methanol).  Trang thiết bị và dụng cụ - Thiết bi:̣ máy cô quay chân không , tủ hút hóa chất, tủ sấy, côṭ sắc ký, sắc ký bản mỏng (Merck) … - Dụng cụ: giấy lọc, ống vi quản, chai bi, đũa thủy tinh, bao tay, khẩu trang,.. 39 3.2.2. Phƣơng pháp tiến hành Hợp chất anthraquinone đƣợc ly trích và cô lập theo quy trình của Hồ Thị Bích Tuyền (2006) [3]. Sơ đồ 3.1: Quy trình ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone. Hơp̣ chất anthraquinone sau khi ly trích và tinh chế đƣơc̣ sƣ̉ duṇg làm chất tham chiếu trong các thí nghiêṃ điṇh lƣơṇg bằng HPLC . Cây tƣơi Cây khô Bột cây Cao thô ethanol Sấy ở 500C Nghiền Ngâm dầm trong ethanol ít nhất 24 giờ, Lọc, cô quay chân không. Sắc ký nhanh cột khô với đơn dung môi benzene Sắc ký cột ƣớt với hệ dung môi ether dầu hỏa:chloroform (95:5) Phân đoạn cao benzene Phân đoạn chứa hợp chất anthraquinone Sắc ký bản mỏng điều chế nhiều lần Hệ dung môi benzene:chloroform (3:7) Hợp chất anthraquinone tinh khiết tƣơng đối 40 3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC 3.3.1. Vâṭ liêụ  Nguồn mẫu - Cây D. burmanni Vahl các loaị. - Dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl taọ đƣơc̣ từ thí nghiệm 4.  Hóa chất - Methanol (Prolabo) - Acid acetic (Merck) - Triethylamine (Merck) - Anthraquinone (đa ̃đƣơc̣ ly trích và tinh chế trong phần 3.2.)  Trang thiết bi ̣ và duṇg cu ̣ - Thiết bi :̣ máy sắc ký l