Khóa luận Khảo sát mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong các loại thực phẩm tại khu vực Thành phố Phan Thiết

mol 0,5%, acid fenic 3%. 2.2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên và độc tố  Cấu trúc kháng nguyên Salmonella có 3 loại kháng nguyên - Kháng nguyên O (kháng nguyên thân): có hơn 60 loại, đƣợc bao phủ bởi bề mặt vi khuẩn tạo thành một lớp không đồng đều, gồm chuỗi lipopolysaccharide – protein trên bề mặt tế bào. Loại kháng nguyên này đƣợc coi là độc tố của vi khuẩn, nó có đặc tính ổn định với nhiệt độ 100oC trong 2 giờ, không bị alcol và acid fenic phá hủy, rất độc, chỉ cần 1/20mg là đủ giết chết một con chuột sau vài giờ. Ngoài ra kháng nguyên này còn có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch làm thay đổi tạm thời sự thẩm thấu của mao quản. - Kháng nguyên H (kháng nguyên tiêm mao): có bản chất là protein, là loại protein không bền nhiệt, bị giết chết ở 70oC hay dƣới tác dụng của cồn 50%. - Kháng nguyên Vi (kháng nguyên bề mặt): là kháng nguyên bao phủ kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố, đƣợc cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, nó thƣờng kết hợp với tính chuyên biệt của vật chủ, ức chế sự ngƣng kết của kháng nguyên O khi nó phát triển nhiều, nó bị phá hủy bởi sức nóng trong vòng 120 phút. Kháng nguyên Vi chỉ có ở các kiểu huyết thanh: S. typhi, S. paratyphi, S. dublin.  Độc tố Salmonella sản sinh hai loại độc tố: độc tố ruột gây xung huyết, mụn loét và độc tố thần kinh gây ra các triệu chứng thần kinh. 2.2.5.8. Cơ chế gây bệnh Ngộ độc do Salmonella là loại ngộ độc thƣờng gặp và có thể gây tử vong. Điều kiện cần thiết để gây ngộ độc là TP phải nhiễm với số lƣợng lớn, vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lƣợng độc tố lớn, sức đề kháng của cơ thể bị suy giảm. Ngƣời tiêu dùng sử dụng TP bị nhiễm vi khuẩn, từ đó vi khuẩn sẽ vào trong ruột và phát triển làm phá hỏng tế bào niêm mạc ruột sau đó vào máu và tiết ra độc tố gây viêm ruột. Độc tố thấm qua thành ruột vào máu gây nên các triệu chứng liên quan đến dạ dày nhƣ: đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy, sốt cao kéo dài đến vài ngày. Ngoài ra, vi khuẩn Salmonella còn có thể theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng máu. 2.2.5.9. Triệu chứng Ngƣời ăn phải TP bị nhiễm Salmonella sau 12 – 24 giờ sẽ bị nôn mửa, đau bụng, nhứt đầu, choáng váng và tiêu chảy. Bên cạnh còn có một số triệu chứng khác nhƣ: sốt nhẹ, nhức mỏi cơ bắp, cơ thể mệt mỏi, triệu chứng này có thể kéo dài từ 2 – 3 ngày. 2.2.5.10. Phòng ngừa Để phòng ngừa ngộ độc do Salmonella gây ra thì chúng ta phải tuân thủ triệt để quy trình vệ sinh TP và cải thiện vệ sinh môi trƣờng trong quá trình chế biến. Phải ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn trong TP bằng cách bảo quản lạnh ở nhiệt độ thích hợp hoặc bằng phƣơng pháp khác. Hình 2.4: Hình dạng vi khuẩn Salmonella nhìn dƣới kính hiển vi 2.3. Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm [1] Theo Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT của Bộ Y tế vào ngày 31 tháng 8 năm 2001 thì quy định cho phép giới hạn VSV có mặt trong TP đƣợc tuân theo Bảng 2.1 ở dƣới đây. Bảng 2.1: Giới hạn cho phép vi sinh vật có mặt trong thực phẩm theo, Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT của Bộ Y tế Nhóm TP Giới hạn cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml TP) TVKHK COL ECO SAU SAL/25g * Nhóm thịt - Thịt tƣơi, thịt đông lạnh, thịt nghiền, thịt chế biến -Sản phẩm chế biến từ thịt 10 6 0 10 2 10 2 0 3x10 5 50 3 10 0 * Nhóm cá và hải sản - Cá và thủy sản tƣơi sống - Sản phẩm chế biến từ tôm, cá, các loại giáp xác, nhuyễn thể luộc hấp - Thủy sản khô chế biến nhƣ cá khô 10 6 0 10 2 10 2 0 10 5 10 3 10 0 10 6 10 2 10 10 2 0 * Nhóm trứng - Trứng tƣơi, dịch trứng tƣơi đông lạnh - Sản phẩm chế biến từ trứng 10 5 10 2 3 10 0 10 3 10 0 3 0 * Nhóm sữa - Sữa khô, sữa bột - Sữa tƣơi tiệt trùng theo phƣơng pháp pasteur - Sữa tƣơi tiệt trùng theo phƣơng pháp U.H.T - Sản phẩm chế biến từ sữa (bơ, sữa chua, phomat) 5x10 4 10 0 0 0 5x10 4 10 3 0 10 0 0 0 0 10 4 10 0 0 0 * Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc, khoai củ, đậu đỗ: - Cần xử lý nhiệt trƣớc khi dùng:bột, miến, mì sợi - Dùng trực tiếp, không xử lý nhiệt: bánh bột 10 6 10 3 10 2 10 2 0 10 4 10 3 10 0 * Nhóm nƣớc khoáng và nƣớc giải khác đóng chai - Nƣớc giải khác có cồn - Nƣớc giải khác không cồn - Nƣớc khoáng đóng chai 10 0 0 0 0 10 2 0 0 0 Theo GMP 0 0 0 0 * Nhóm gia vị 104 102 3 102 0 * Nhóm nƣớc chấm - Nguồn động vật:nƣớc mắn - Nguồn thực vật 10 4 10 2 0 3 0 10 4 10 2 0 3 0 * Kem, nƣớc đá 5x104 10 0 3 0 * Nhóm đồ hộp 0 0 0 0 0 * Nhóm dầu mỡ 103 10 3 0 0 Ghi chú: TVKHK: tổng vi khuẩn hiếu khí; ECO: E. coli; SAU:Stphylococcus aureus; SAL: Salmonella; COL: Coliforms; G.M.P.: Good Manufacturing Practice: quy phạm sản xuất GMP 2.4. Các con đƣờng vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm [14] Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm theo 4 con đƣờng: + Do môi trƣờng không đảm bảo vệ sinh, VSV từ đất, nƣớc bẩn, không khí, dụng cụ và các vật dụng khác nhiễm vào TP. + Do thiếu vệ sinh trong quá trình chế biến, TP đƣợc nấu không chín kỹ, ăn thức ăn sống. + Do bảo quản TP không hợp vệ sinh, không che đậy để côn trùng vật nuôi… tiếp xúc vào TP mang theo vi khuẩn gây bệnh. + Do bản thân TP, gia súc, gia cầm bị bệnh từ trƣớc khi giết mổ vì vậy thịt của chúng mang các vi trùng gây bệnh hoặc trong quá trình giết mổ, vận chuyển, bảo quản chế biến, TP đã bị nhiễm vi khuẩn và các hoá chất độc hại khác. 2.5. Tình hình an toàn vệ sinh thực phẩm 2.5.1. Tình hình ngoài nƣớc [17], [23] Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) lƣơng thực TP chính là nguyên nhân đã gây ra khoảng 50% các trƣờng hợp tử vong đối với con ngƣời trên toàn thế giới hiện nay, ngay đối với các nƣớc phát triển việc ngộ độc TP luôn luôn là vấn đề bức xúc và hết sức gây cấn. - Ở Nhật Bản, trung bình hàng năm có tới 2000 vụ ngộ độc với hơn 50.000 ngƣời bị ngộ độc cấp tính do lƣơng thực, TP gây ra. Tháng 7 năm 1996, tại Thành phố Osaka (Nhật Bản), một biến cố quan trọng về ngộ độc TP do vi khuẩn E. coli gây nên đã làm trên 8000 ngƣời bị bệnh, đa số là trẻ em học sinh. - Ở Mỹ, mỗi năm có tới hàng chục triệu ngƣời bị ngộ độc do lƣơng thực, TP gây ra. - Tháng 9 năm 2006 vừa qua một biến cố ngộ độc do ăn rau Spinach nhiễm vi khuẩn E. coli đã làm trên 100 ngƣời ngã bệnh và có một ngƣời chết tại Mỹ. - Tháng 5 năm 2000, thành phố WalKerton, Ontario Canada đã chấn động lên sau khi có trên 2000 cƣ dân bất thình lình ngã bệnh, đau bụng, tiêu chảy và nôn mửa, trong đó có 7 ngƣời tử vong. Sau khi ngƣời ta tiến hành kiểm tra thì phát hiện có sự hiện hiện E. coli trong nguồn nƣớc của thành phố. - Năm 1999, thành phố LaBaie, tỉnh bang Quebec Canada cũng đã ghi nhận một vụ ngộ độc tƣơng tự. Có tất cả 11 ngƣời đã mắc bệnh và một em bé tử vong vì ăn thịt bò xay mà ngƣời ta hay gọi là hamburger. - Trƣớc đó 1 năm, tại một số tiểu bang phía Tây Hoa Kỳ cũng đã xảy ra một vụ ngộ độc TP do E. coli nhiễm vào trong nƣớc pomme (applejuice) không đƣợc hấp tiệt trùng trƣớc khi bán ra ngoài. - Theo Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC), hằng năm tại Mỹ có khoảng 20.000 ngƣời bị bệnh hamburger và trong số này có 500 ngƣời tử vong. Cơ quan Y tế của chính phủ Canada cũng ƣớc đoán mỗi năm có tới một triệu ca ngộ độc TP các loại đã xảy ra. 2.5.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm trong nƣớc [12], [15], [24] Theo Cục quản lý chất lƣợng ATVSTP, trong năm 2004 số vụ ngộ độc, số mắc và số vụ ngộ độc hàng loạt đều giảm đáng kể so với cùng kỳ năm 2003. Nguyên nhân thƣờng gặp hơn cả là do ăn phải TP bị nhiễm VSV chiếm 55% và TP nhiễm độc chiếm 22,8%. Cũng theo số liệu từ Cục ATVSTP-Bộ Y tế, trong 5 năm (2001 – 2005) cả nƣớc xảy ra gần 1000 vụ với hơn 23.000 ngƣời bị ngộ độc TP, trong đó có hơn 200 ngƣời chết. Năm 2005, xảy ra 150 vụ với hơn 4.300 ngƣời bị ngộ độc TP, làm chết hơn 50 ngƣời, tỷ lệ tử vong 2005 đƣợc xác nhận là tăng 90% so với năm 2004. Tuy nhiên đây là những số liệu thống kê chƣa đầy đủ. Riêng thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2005 có 27 vụ ngộ độc với hơn 1536 ngƣời mắc, trong đó có 4 trƣờng hợp tử vong, chiếm một tử lệ khá cao về ngộ độc TP của cả nƣớc. Bảng 2.2: Số vụ mắc, ngộ độc và tử vong trong năm 2003 – 2004 Năm 2004 Năm 2003 Số vụ ngộ độc 145 238 Số ngƣời mắc 3584 6428 Số ngƣời tử vong 41 37 Số vụ ngộ độc TP hàng loạt (nhiều hơn 30 ngƣời) 29 42 Nguyên nhân ngộ độc thực phẩm Vi sinh vật 55,8% 49,2% Hoá chất 13,2% 19,3% Thực phẩm độc 22,8% 21,4% Không rõ nguyên nhân 8,2% 10,1% (Theo nguồn số liệu: Cục quản lý chất lượng ATVSTP) Tính từ 01/01/2007 đến 31/05/2007, số vụ ngộ độc so với 2003 – 2004 có giảm hơn nhiều. Bảng 2.3: Số vụ mắc, ngộ độc và tử vong trong năm 2006 – 2007 Năm 2007 Cùng kỳ 2006 Số vụ ngộ độc 89 68 Số ngƣời mắc 2337 2197 Số ngƣời tử vong 24 34 Nguyên nhân ngộ độc thực phẩm Vi sinh vật 35,9% 35,3% Hoá chất 4,5% 20,5% Thực phẩm độc 31,5% 22,1% Không rõ nguyên nhân 28,1% 22,1% Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1. Địa điểm: Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Kiểm nghiệm, Chi Cục Tiêu Chuẩn – Đo lƣờng – Chất lƣợng – tỉnh Bình Thuận. 3.1.2. Thời gian: Thời gian thực hiện từ 4/2007 đến 7/2007. 3.2. Vật liệu – thiết bị 3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 3.2.1.1. Trang thiết bị Micropipet 0.1 – 1 ml Nồi hấp Tủ cấy Tủ ủ các loại Cân điện tử Bể điều nhiệt Máy khuấy từ không gia nhiệt 3.2.1.2. Dụng cụ Đĩa petri Ống nghiệm Cốc thuỷ tinh Các loại chai đựng môi trƣờng Các loại ống đong Đầu típ Các loại que cấy: que cấy thẳng, cấy vòng, cấy trang Bao PE vô trùng Tất cả các loại dụng cụ này đều phải đƣợc hấp khử trùng trƣớc khi sử dụng. 3.2.2. Các loại môi trƣờng và hoá chất dùng trong nghiên cứu 3.2.2.1. Các loại môi trƣờng dùng trong nuôi cấy và phân lập  Saline Peptone Water (SPW) Đây là môi trƣờng dùng để pha loãng VSV trong quá trình định lƣợng. Tiến hành pha chế trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan và phân phối vào mỗi ống nghiệm 9ml, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 1g NaCl 8,5g Nƣớc cất 1000ml  Plate Count Agar (PCA) Đây là môi trƣờng thạch dùng để định lƣợng tổng sinh vật hiếu khí, tiến hành pha trong chai, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó lắc đều. Thành phần gồm: Peptone 5,0g Cao nấm men 2,5g Glucose 1g Agar 14g Nƣớc cất 1000ml  Trypton Soya Agar (TSA) Đây là môi trƣờng thạch không chọn lọc đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, trƣớc khi hấp khử trùng phải đun để tan hết agar. Thành phần gồm: Trypticase peptone 15g Phytone peptone 5g NaCl 5g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml  Violet Red Bile Agar (VRBA) Môi trƣờng này đƣợc dùng trong qui trình định lƣợng Coliforms tổng số. Đây là môi trƣờng thạch đĩa nhƣng không đƣợc hấp khử trùng. Vì vậy, phải đong trƣớc một thể tích xác định nƣớc cất vào chai, hấp ở 121oC trong 15phút. Sau đó, tiếp tục cân môi trƣờng khô vào và đun tan. Tất cả các thao tác này phải đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Cao nấm men 3g Peptone 7g NaCl 5g Muối mật 1,5g Lactose 10g Neutral red 0,03g Crystal violet 0,002g Agar 18g Nƣớc cất 1000ml  Brilliant Green Bile Lactose (BGBL) Đây là môi trƣờng lỏng nên đƣợc pha trong cốc thuỷ tinh, khuấy cho tan, sau đó bơm phân phối 5ml vào mỗi ống nghiệm rồi cho ống Durham ngƣợc vào, đậy nút bông, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi hấp xong quan sát xem các ống có sinh hơi không, nếu thấy sinh hơi thì không sử dụng. Thành phần gồm: Peptone 10g Lactose 10g Mật bò 20g Brilliant green 0,0133g Nƣớc cất 1000ml  Eosin Methyl Blue (EMB) Đây là môi trƣờng thạch dùng để phân lập E. coli và môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội ở 45oC rồi đỗ đĩa. EMB là môi trƣờng rất dễ bị nhiễm mốc, do đó phải đƣợc pha trƣớc một ngày. Thành phần gồm: Peptone 10g Lactose 5g Sucrose 5g K2PO4 (dikali phosphat) 2g Eosin 0,4g Methyl blue 0,065g Agar 13,5g Nƣớc cất 1000ml  Baird Parker Agar (BPA) Đây là môi trƣờng dùng để phân lập Staphylococcus aureus. Môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi hấp xong thì giữ ấm ở 45oC rồi bổ sung thêm EY (Egg yorlk tellurite), trộn đều tránh tạo bọt khí, đổ đĩa, phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Tryptone 10g Cao thịt 5g Cao nấm men 1g Sodium pyruvate 10g Glycine 10g Lithium chloride.6H2O 5g Agar 15g Egg yorlk tellurite 50ml Nƣớc cất 1000ml  Buffered Peptone Water (BPW) Đây là môi trƣờng tiền tăng sinh Salmonella, đƣợc hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 10g NaCl 5g Na2HPO4.12H2O 9g KH2PO4 1,5g Nƣớc cất 1000ml  Rappaport Vassiliadis Soy Peptone (RV) Đây là môi trƣờng dùng để tăng sinh chọn lọc Salmonella, đƣợc hấp khử trùng ở 115oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 4,5g MgCl2.6H2O 28,6g NaCl 7,2g K2HPO4 0,18g KH2PO4 1,26g Malachite green oxalate 0,036g Nƣớc cất 1000ml  Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) Đây là môi trƣờng thạch dùng để phân lập Salmonella, môi trƣờng này không đƣợc hấp khử trùng, do đó phải đong trƣớc một thể tích xác định nƣớc cất vào chai, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, cân môi trƣờng khô vào, đun tan đổ đĩa, tất cả các thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Cao nấm men 3g NaCl 5g D(+)xylose 3,5g Lactose 7,5g Sucrose 7,5g L(+)lysine 5,0g Sodium desoxycholate 2,5g Sodium thiosulphate 6,8g Ammonium iron citrate 0,8g Phenol red 0,08g Agar 13,5g Nƣớc cất 1000ml 3.2.2.2. Môi trƣờng dùng để thử sinh hoá  Simmons Citrate Đây là môi trƣờng thạch nghiêng nên phải đƣợc pha trong cốc, đun cho tan hết agar, phân phối vào mỗi ống nghiệm khoảng 7ml, đậy nắp, hấp ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 41g NH4H2PO4 41g MgSO4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml  Huyết tƣơng tƣơi đông lạnh  Urea Broth Đây là môi trƣờng không đƣợc hấp khử trùng, nƣớc cất phải đong một thể tích chính xác vào chai, hấp ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, cân môi trƣờng vào lắc cho tan hết, lọc qua màng lọc rồi phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, thực hiện trong điều kiện vô trùng. Thành phần gồm: Urea 20g Cao nấm men 0,1g Na2HPO4 49,5g K2HPO4 49,1g Phenol red 0,01g Nƣớc cất 1000ml  Canh Manitol Phenol Red Đây là môi trƣờng thạch nghiêng nên đƣợc pha trong cốc, sau đó đun tan rồi phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Mannitol 10g Phenol red broth base 15g Nƣớc cất 1000ml  Lysine Decarboxylase Đây là môi trƣờng lỏng, pha trong cốc thủy tinh, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: L-lysine HCl 0,5g Dextrose 0,5g KH2PO4 40,5g Nƣớc cất 100ml  Kligler Iron Agar (KIA) Đây là môi trƣờng thạch nghiêng sâu, đƣợc pha vào trong cốc thủy tinh, đun cho tan hết agar, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 121oC trong 15 phút. Sau đó, lắc đều và làm nghiêng ống sao cho sau khi môi trƣờng đông đặc phải có phần sâu khoảng 2cm. Thành phần gồm: Peptone 20g Lactose 10g Dextrose 10g NaCl 5g Feric ammonium 0,5g Sodium thiosulphate 0,5g Agar 15g Phenol red 0,025g Nƣớc cất 1000ml  Canh Tryptone Môi trƣờng này đƣợc sử dụng để thử nghiệm phản ứng indol. Đây cũng là môi trƣờng lỏng, pha trong cốc, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp 121oC trong 15 phút. Thành phần: Tryptone 20g NaCl 5g Nƣớc cất 1000ml  Methyl Red Vosger – Proskauer (MR – VP) Môi trƣờng này đƣợc sử dụng để thử phản ứng Methyl red và Voges Proskauer. Đây là môi trƣờng lỏng, đƣợc pha vào trong cốc khuấy tan, phân phối vào mỗi ống nghiệm 5ml, hấp ở 121oC trong 15 phút. Thành phần gồm: Peptone 5g K2HPO4 5g Glucose 5g Nƣớc cất 1000ml  Thuốc thử Methyl red Kovac’s - napthol 5% Dung dịch KOH 40% 3.2.3. Vật liệu nghiên cứu Mẫu TP đƣợc sử dụng bao gồm các loại TP khác nhau đƣợc thu tại khu vực chợ và các quán ăn ven đƣờng, trong chợ và trong các quán ăn. Các loại mẫu thu đại diện cho 3 nhóm TP chính: TP ăn liền, TP tƣơi sống và TP khô. Chi tiết các loại mẫu đƣợc trình bày dƣới Bảng 3.1. Bảng 3.1: Các nhóm thực phẩm đƣợc sử dụng trong khảo sát Nhóm mẫu TP Số lƣợng Loại mẫu Ăn liền 35 Xôi đậu xanh, xôi đậu bắp, chè chuối, chè đậu đen, chè đậu ván, chè đậu phộng, chè khoai sáp, nƣớc mía, nƣớc rau má, bánh plan, bánh canh, bánh bò, bánh bèo, bánh tiêu, bánh đậu xanh, đông sƣơng, bún, phở, bánh ƣớt, bánh bông lan, sữa đậu nành, chả chiên, chả hấp, chả lụa, tƣơng đen, tƣơng đỏ, nƣớc mắn, cá cơm kho khô, cá mai tẩm mè, cá bống mú tẩm , kim chi, cà chua ngọt, cải chua ngọt, đu đủ muối chua ngọt. Tƣơi sống 21 Đậu phụ trắng, đậu phụ vàng, thịt heo, thịt gà, thịt bò, mực ống nguyên con, tép tƣơi, mực ống cắt khúc, cá mú đông lạnh, cá mập lụa đông lạnh, cồi điệp tƣơi đông lạnh, cá cờ đông lạnh, cá thu đông lạnh, cá trích đông lạnh, cá hố cắt khúc, cá nục đông lạnh, cá cơm đông lạnh , mực nang đông lạnh, nghêu lụa luộc đông lạnh, sò lông luộc đông lạnh, rau má, xà lách, cải xanh, tí tô. Khô 24 Cá bò ép, tôm khô, cá mối khô, cá chỉ tẩm, nghêu luộc khô, sò hào khô, mực ống tẩm gia vị, cá cơm, cá trích, cá mối tẩm, cá hố khô, cá giãnh, cá úp giấy, tép khô, cá chỉ, cá bống mú tẩm, cá bò ép tẩm, cá thiều tẩm, cá bống mú khô, cá đuối khô. 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Phƣơng pháp thu và bảo quản mẫu thực phẩm Mẫu đƣợc thu tại chợ và đƣợc chứa trong bao nylon, bảo quản mẫu trong nƣớc đá cho tới khi vận chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích. Nếu chƣa phân tích ngay thì đƣợc bảo quản trong tủ ở 4 – 5oC trong 24 – 36 giờ. Riêng đối với mẫu cá và thủy sản tƣơi và khô thì đƣợc cán bộ Chi Cục thu tại cơ sở chế biến. 3.3.2. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật Cân 10 g mẫu cho vào 90ml dung dịch pha loãng SPW, sau đó đêm dập mẫu trong khoảng 30 giây, để đƣợc dung dịch pha loãng 10-1. Dùng micropipet với đầu típ vô trùng, hút 1 ml dịch mẫu vào ống chứa 9 ml dung dịch pha loãng, lắc đều đƣợc 10-2. Tiếp tục hút và pha loãng để đƣợc các nồng độ thấp hơn. Hình 3.1: Sơ đồ pha loãng vi sinh vật 3.3.3. Phƣơng pháp phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn hiếu khí là vi khuẩn sinh trƣởng và phát thiển ở nhiệt độ 30oC trong 72 giờ. Để xác định mậtc độ tổng số vi khuẩn hiếu khí, chúng tôi sử dụng bằng phƣơng pháp đổ đĩa.  Cách tiến hành Sử dụng kẹp, kéo đã đƣợc vô trùng cắt và cân 10g ± 0,5g mẫu cho vào bao PE vô trùng, bổ sung vào 90 ml dung dịch pha loãng SPW đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong khoảng 30 – 40 giây để đƣợc độ pha loãng 10-1. Dùng micropipet với đầu típ vô trùng hút 1 ml dịch mẫu đã đƣợc pha loãng ở nồng độ 10 -1 chuyển vào ống nghiệm chứa sẵn 9 ml dung dịch pha loãng để đƣợc 10-2, đồng nhất bằng máy lắc (vortex) rồi hút 1 ml chuyển vào hai đĩa petri trống vô trùng, sau đó hút 1 ml chuyển vào ống 9 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất. Cứ tiếp tục hút cho đến khi đạt đƣợc độ pha loãng tùy theo mỗi loại mẫu phân tích. Đổ môi trƣờng PCA vào các đĩa petri đã đƣợc cấy mẫu, mỗi đĩa khoảng 10 – 15 ml. Trộn đều dịch mẫu với môi trƣờng bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngƣợc chiều kim đồng hồ, mỗi chiều khoảng 3 – 5 lần, đặt môi trƣờng trên 90 ml 9ml 9ml 9ml 9ml 10g 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Ống nuôi cấy ban đầu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Pha loãng ra các nồng độ tiếp theo Độ pha loãng mặt phẳng nằm ngang cho môi trƣờng đông đặt lại, lật ngƣợc và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 72 giờ.  Tính kết quả Sau thời gian ủ, chọn những đĩa có từ 25 – 250 khuẩn lạc để đếm. Tổng số vi khuẩn hiếu khí đƣợc tính theo công thức sau: N A (CFU/g hay CFU/ml) n1xV1xF1 +…+ nixVixFi Trong đó: A: số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 g hay 1 ml mẫu. N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn. ni: số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. Vi: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa Fi: độ pha loãng tƣơng ứng 3.3.4. Phƣơng pháp phân tích Coliforms tổng số Để xác định mật độ Coliforms tổng số, chúng tôi tiến hành bằng phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống.  Cách tiến hành Từ dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10-1), hút 1 ml cấy chuyển vào đĩa petri vô trùng, mỗi nồng độ cấy 2 đĩa, thêm vào mỗi đĩa đã cấy khoảng 5 ml môi trƣờng TSA đã đƣợc hấp và đun tan, môi trƣờng này có tác dụng phục hồi các tế bào bị suy yếu hay bị tổn thƣơng trong quá trình chế biến cũng nhƣ trong thao tác mẫu. Sau đó trộn đều dịch mẫu với môi trƣờng bằng cách xoay tròn đĩa petri theo chiều kim đồng hồ, mỗi vòng xoay từ 3 – 5 lần, để yên từ 30 – 60 phút ở nhiệt độ phòng rồi bổ sung 10 – 15 ml môi trƣờng VRB, chờ đông đặc, lật ngƣợc và ủ các đĩa ở 37oC ± 0,5oC trong 24 giờ. Sau thời gian ủ, chọn đĩa có xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc có màu đỏ đến đỏ đậm, đƣờng kính lớn hơn 0,5 mm, có quầng tủa muối mật để đếm. Sau đó, dùng que cấy thẳng đã khử trùng chọn 5 khuẩn lạc cấy chuyển vào ống có chứa 5 ml môi trƣờng BGBL, ủ các ống ở 37oC ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ. Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc Coliforms trên môi trƣờng VRB  Tính kết quả Dựa vào số khuẩn lạc đếm đƣợc và tỷ lệ khẳng định, tính mức độ của Coliforms theo công thức: N C (CFU/g hay CFU/ml) = x R n xV x F Trong đó: C: số Coliforms trong 1 g hay 1 ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên đĩa đã chọn n: số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng đã chọn V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa F: độ pha loãng tƣơng ứng R: tỷ lệ khẳng định 3.3.5. Phƣơng pháp phân tích E. coli trong thực phẩm Để xác định E. coli trong thực phẩm, chúng tôi dùng phƣơng pháp định tính, phƣơng pháp này chỉ cho phép phát hiện có hay không có E. coli trong mẫu thực phẩm.  Cách tiến hành Bước tăng sinh chọn lọc: Đây là bƣớc rất quan trọng vì nó ức chế sự phát triển một số nhóm VSV không mong muốn. Dùng micropipet vô trùng hút 1ml dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10 -1) cấy chuyển vào ống nghiệm có chứa 5ml môi trƣờng BGBL, lắc đều và ủ ở 44 o C ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ. Bước phân lập: Bƣớc này nhằm tách biệt VSV mục tiêu ra khỏi quần thể của chúng. Dùng que cấy vòng đã khử trùng chọn những ống mẫu trong môi trƣờng BGBL có sinh hơi cấy phân lập sang đĩa môi trƣờng EMB, lật ngƣợc và ủ đĩa ở 37oC ± 0,5oC trong khoảng 24 – 48 giờ. Hình 3.3: Hình dạng khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng EMB Bước khẳng định: Dùng que cấy vòng đã khử trùng chọn 5 khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím hoặc tím đen trên môi trƣờng EMB cấy vào đĩa môi trƣờng TSA, ủ ở 37oC ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ. Sau thời gian ủ, tiến hành thử sinh hoá theo nghiệm pháp IMViC: Indol (+), MR (+), VP (-), SC (-). - Phản ứng Indol: Dùng que cấy vòng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống có chứa 5ml môi trƣờng canh Trypton. - Phản ứng MR - VP: Dùng que cấy vòng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang hai ống có chứa 5ml môi trƣờng canh MR - VP. - Phản ứng Simmoms Citrate (SC): Dùng que cấy thẳng đã khử trùng, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA sang ống có chứa 5ml môi trƣờng SC. Đem tất cả các ống đã cấy ủ ở 44oC ± 0,5oC trong 24 giờ. Hình 3.4: Các thử nghiệm sinh hóa IMViC 1: Thử nghiệm indol dương tính, 2: Thử nghiệm Indol âm tính, 3: Thử nghiệm MR dương tính, 4: Thử nghiệm MR âm tính, 5,6: thử nghiệm VP âm tính, 7,8: thử nghiệm SC âm tính 3.3.6. Phƣơng pháp phân tích Staphylococcus aureus trong thực phẩm  Cách tiến hành Dùng micropipet với đầu típ vô trùng, hút 0,2 ml dịch pha loãng mẫu ở nồng độ ban đầu (10-1) cấy vào đĩa petri có chứa 10 – 15 ml môi trƣờng thạch BP, dùng que cấy tam giác đã khử trùng cấy trãi đều trên mặt thạch cho đến khi nào khô, lật ngƣợc và ủ ở 37oC ± 0,5oC trong 48 giờ. Đọc kết quả Chọn và đếm những đĩa có xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc có đƣờng kính từ 0,5 – 1 mm, tròn lồi, đen bóng có quầng sáng hoặc quầng trong xung quanh rộng khoảng 1 – 2 mm. Có một số dòng S. aureus không cho khuẩn lạc đặc trƣng. Hình 3.5: Khuẩn lạc S. aureus trên môi trƣờng BP Khẳng định Trên môi trƣờng BP chọn 5 khuẩn lạc đặc trƣng và 5 khuẩn lạc không đặc trƣng cấy vào môi trƣờng TSA, ủ ở 37oC ± 0,5oC trong 24 giờ, cấy chuyển sinh khối vi khuẩn từ môi trƣờng TSA vào ống nghiệm chứa 0,5ml huyết tƣơng tƣơi đông lạnh, ủ ở 37oC ± 0,5oC trong 24 giờ. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tƣơng sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8, và 24 giờ. Tính tỷ lệ khẳng định trên khuẩn lạc đặc trƣng và khuẩn lạc không đặc trƣng. Kết quả phản ứng: + Dƣơng tính: có khối đông huyết tƣơng hình thành. Mọi m