MỤC LỤC
CHưƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm ơn . iii
Tóm tắt . iv
Mục lục . viii
Danh sách các chữ viết tắt . xii
Danh sách các bảng . xiii
Danh sách các hình . xiv
Danh sách các biểu đồ . xvi
Danh sách các sơ đồ . xvii
1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ . 1
1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU . 2
1.2.1. Mục đích . 2
1.2.2. Yêu cầu . 2
2. TỔNG QUAN . 3
2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA . 3
2.1.1. Hệ thống phân loại cây lúa . 3
2.1.2. Đặc điểm sinh thái – sinh học cây lúa . 3
2.1.2.1. Hạt lúa và sự nảy mầm . 3
2.1.2.2. Lá lúa . 5
2.1.2.3. Bông lúa . 6
2.1.3. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển cây lúa . 8
2.1.3.1. Ba thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa . 8
2.1.3.2. Các giai đoạn phát triển của cây lúa . 8
2.2. LÚA THƠM ĐẶC SẢN VIỆT NAM . 9
2.2.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC GIỐNG LÚA JASMINE, OM3536, ST3, VD20 . 10
2.2.1.1. Giống lúa OM3536. 10
2.2.1.2. Giống lúa Jasmine . 11
2.2.1.3. Giống lúa VD20 . 12
2.2.1.4. Giống lúa ST3 . 12
2.2.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HÓA SINH CHẤT THƠM CỦA LÚA GẠO . 13
2.2.2.1. Những hợp chất bay hơi có trong gạo thơm . 13
2.2.2.2. Hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline. 16
2.3. PHưƠNG PHÁP VI CHIẾT XUẤT TRÊN PHA RẮN (SPME) . 19
2.4. SẮC KÝ KHÍ . 20
2.5. SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ . 21
3. VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH . 22
3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ . 22
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU . 23
3.4. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 23
3.4.1. Phương pháp trồng lúa . 23
3.4.2. Chiết xuất hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phương pháp SPME. 24
3.4.2.1. Dụng cụ sử dụng cho kĩ thuật SPME . 24
3.4.2.2. Các bước thực hiện trong kĩ thuật vi chiết xuất trên pha rắn . 26
3.4.2.3. Ứng dụng phương pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 – acetyl
– 1 – pyrroline . 27
3.4.3. Định tính và định lượng hợp chất thơm 2 – AP có trong lá và hạt lúa
bằng GC và GC/MS . 29
3.4.3.1. Sơ đồ thiết bị sắc kí khí . 30
3.4.3.2. Detector . 31
3.4.3.3. Cột mao quản . 32
3.4.4. Xác định hệ số phản hồi của 2 - AP . 34
3.4.5. Xác định nồng độ hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong lá lúa
và trong hạt lúa . 34
3.4.6. Phương pháp xử lý thống kê . 34
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 35
4.1. XÁC ĐỊNH HỆ SỐ PHẢN HỒI CỦA 2 - AP . 35
4.2. ĐỊNH TÍNH HỢP CHẤT 2- ACETYL – 1 – PYRROLINE . 40
4.3. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH HÀM LưỢNG 2 – AP CÓ TRONG CÂY LÚA
QUA CÁC THỜI KÌ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY LÚA Ở 4 GIỐNG LÚA:
JASMINE, OM3536, ST3, VD20 . 47
4.3.1. Khảo sát sự biến đổi hàm lượng 2 – AP ở cây lúa qua các thời kì tăng
trưởng . 47
4.3.2. So sánh hàm lượng 2 – AP qua các thời kì sinh trưởng, phát triển của cây
lúa ở 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20 . 50
4.4. SO SÁNH HÀM LưỢNG 2 – AP CÓ TRONG LÁ LÚA VÀ LÁ DỨA . 51
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 54
5.1 KẾT LUẬN . 54
5.1.1. Định tính 2 - AP . 54
5.1.2. Phân tích hàm lượng 2 – AP có trong lá và trong hạt của 4 giống lúa
Jasmine, OM3536, ST3, VD20 . 54
5.2 ĐỀ NGHỊ . 55
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 56
7. PHỤ LỤC . 64
Phụ lục 1. Các hợp chất bay hơi có trong gạo thơm . 64
Phụ lục 2. Khống chế các yếu tố ảnh hưởng . 65
Phụ lục 3. Sắc ký đồ phân tích hợp chất 2 – AP có trong lá của giống lúa Jasmine
. 68
Phụ lục 4. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong lá của giống lúa
OM3536 . 68
Phụ lục 5. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong lá của giống lúa ST3
. 69
Phụ lục 6. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP có trong lá của giống lúa
VD20 . 69
Phụ lục 7. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP có trong hạt của giống lúa
Jasmine . 70
Phụ lục 8. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong hạt của giống lúa
OM3536 . 70
Phụ lục 9. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong hạt của giống lúa ST3
. 71
Phụ lục 10. Sắc ký đồ GC phân tích hàm lượng 2 – AP có trong hạt của giống lúa
VD20 . 71
Phụ lục 11. Sắc ký đồ GC phân tích hàm lượng 2 – AP có trong lá dứa . 72
Phụ lục 12. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn tetradecane . 72
Phụ lục 13. Sắc ký đồ GC phân tích pentanol và hexanal . 73
Phụ lục 14. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn collidine, octanol, nonanal, decanal,
hexanol . 73
Phụ lục 15. Sắc ký đồ GC/MS phân tích mẫu gạo Jasmine . 74
92 trang |
Chia sẻ: leddyking34 | Lượt xem: 2822 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Khảo sát, phân tích và so sánh chất lượng mùi thơm của một số giống lúa thơm trồng ở đồng bằng sông Cửu Long bằng phương pháp SPME-GC, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ồng bằng
sông Cửu Long tiến hành khảo nghiệm trên diện rộng. VD20 có các đặc tính nhƣ
sau:
- Thời gian sinh trƣởng 100 ngày (Đông Xuân) và 105 ngày (Hè Thu).
- Chiều cao cây 100 - 105 cm.
- Cứng cây, nở bụi khá, phiến lá có màu xanh hơi nhạt, gốc thân và bìa lá
có màu tím. Trung bình có 7 bông / bụi.
- Bông to, dài 25 - 26 cm, hạt chắc trên bông 180 – 190 hạt, tỉ lệ lép thấp
(dƣới 10%). Giai đoạn vào chắc nhanh.
- Hạt nhỏ, trọng lƣợng 1000 hạt từ 20 – 21gram, gạo rất trong, chiều dài
hạt gạo lức 6,16mm, tỉ lệ gạo nguyên cao (88%), trọng lƣợng vỏ trấu
20,8%
- Đặc biệt có mùi thơm từ giai đoạn mạ đến chín giống nhƣ lúa thơm
Jasmine.
- Mức độ nhiễm rầy nâu và vàng lá nhẹ.
- Thích hợp vụ Đông Xuân hơn Hè Thu. Năng suất thực tế vụ Đông Xuân
là 6,16 tấn / ha (trên diện tích 650 m2).
- Hàm lƣợng amylose thấp (18 – 20%), cơm dẻo, mềm và có mùi thơm
nhẹ.
2.2.1.4. Giống lúa ST3 [2]
Giống lúa ST3 do kỹ sƣ Hồ Quang Cua thanh lọc từ những dòng biến dị của
giống lúa VD20 bằng phƣơng pháp chọn lọc cá thể theo hƣớng tiến gần tới tiêu
chuẩn gạo thơm cao cấp của Thái Lan (dài hạt gạo 7 mm). ST3 có các đặc tính sau:
13
13
- Thời gian sinh trƣởng 112 – 117 ngày (vụ Hè Thu), 100 – 105 ngày (vụ
Đông Xuân).
- Chiều cao cây 110 – 115 cm, đẻ nhánh mạnh, gốc nâu, bản lá to, dài, có
màu tím dọc theo mép lá.
- Giống cao cây, chịu phân kém, dễ đổ ngã.
- Nhiễm rầy nâu, nhiễm cháy lá nặng.
- Hạt gạo rất dài (7,5 – 8 mm), gạo trong, rất ít bạc bụng, thơm đậm, bền
mùi, cơm mềm, dẻo.
- Năng suất bình quân: 3 – 4 tấn / ha (vụ Hè Thu), 6 – 7 tấn (vụ Đông
Xuân).
2.2.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOÁ SINH CHẤT THƠM CỦA LÚA GẠO
2.2.2.1. Những hợp chất bay hơi có trong gạo thơm
Nghiên cứu đầu tiên về gạo thơm đã đƣợc thực hiện bởi Yajima và ctv (1979)
[73]. Họ đã xác định đƣợc 114 thành phần có trong gạo thơm, trong đó có 21 acid,
14 ester của các acid béo, 15 alcohol, 18 aldehyde, 17 ketone, 18 hydrocarbon và
một vài hợp chất vòng khác nhƣ pyridine và furan. Khi so sánh gạo thông thƣờng
với gạo thơm, Yajima đã rút ra kết luận: trong gạo thông thƣờng hàm lƣợng 4 –
vinylphenol, 1 – hexanol và 1 – hexanal cao hơn so với gạo thơm, nhƣng lại có hàm
lƣợng indole thấp hơn. Hơn nữa, gạo thơm còn có 1 thành phần chƣa xác định đƣợc
và α – pyrrolidone là những chất không đƣợc tìm thấy trong gạo thông thƣờng [73].
Những hợp chất bay hơi trong gạo đƣợc xác định bằng cách thu thập những
chất bay hơi, phân tách bằng sắc ký và sau đó xác định những thành phần này bằng
sắc ký khối phổ (GC/MS) [58].
Tsuzuki và ctv (1981) [67] và Buttery và ctv (1983b) [20] đã phân tích
những thành phần bay hơi có trong cơm nấu từ gạo thơm. Kết quả là họ đã nhận
biết đƣợc 114 chất (phụ lục 1). Tuy nhiên, theo đánh giá, không có thành phần bay
hơi riêng lẻ nào đặc trƣng cho gạo thơm chƣa chế biến [17]. Năm 1988, Buttery và
ctv [22] đã xác định đƣợc những thành phần chính tạo nên mùi thơm của gạo thơm
hạt dài California là 2 – acetyl – 1 – pyrroline; (E,E) – deca – 2,4 – dienal; nonanal;
14
hexanal; (E) –– non – 2 – enal; octanal; decanal; 4 – vinyl – guaiacol và 4 –
vinylphenol.
Buttery và ctv (1983a) [19] đã phân tích 2 – acetyl – 1 – pyrroline ở điều
kiện áp suất hơi nƣớc đối với những giống gạo khác nhau. Thí nghiệm này chỉ thực
hiện trên gạo đã chế biến chứ không thí nghiệm trên gạo thô, vì thế, Tsugita (1985 -
1986) [66] đã tỏ ý hoài nghi rằng có thể chất này đƣợc hình thành trong quá trình
nấu nƣớng. Suvarnalatha và ctv (1994) [61] đã nuôi cấy mô sẹo giống lúa Basmati
và so sánh những thành phần bay hơi từ những cây lúa đó với những thành phần
bay hơi trong những cây lúa Basmati thông thƣờng và rút ra kết luận rằng những
chất này là tƣơng tự nhau. Tuy nhiên, họ đã không tìm thấy 2 – AP trong mô sẹo
hay trong cơm gạo. Có thể là do phƣơng pháp sử dụng chƣa đủ nhạy.
Tiến hành so sánh những chất bay hơi có trong gạo thông thƣờng và gạo
thơm, Widjaja và ctv (1996) [69] đã xác định đƣợc 70 chất và mô tả mùi thơm hầu
hết những chất đó. Những chất bay hơi chính trong gạo thơm là các alkanal; alk – 2
– enal; alka(E) – 2,4 – dienal; 2 – pentylfuran; 2 – acetyl – 1 – pyrroline và 2 –
phenylethanol. Những giống gạo thông thƣờng chứa nhiều n-hexanal, (E) – 2 –
heptanal, 1 – octen – 3 – ol, n – nonanal, (E) – 2 – octenal, (E) – 2 - (E) – 4 –
decadienal, 2 – pentylfuran, 4 – vinylguaiacol và 4 – vinylphenol hơn so với gạo
thơm. Kim (1991) [41] đã xác định trong gạo thơm có 16 loại hydrocarbon, 15 loại
alcohol.
Lorieux và ctv (1996) [43] đã phân tích mẫu gạo của 2 giống lúa Azucena
(thơm) và IR64 (không thơm), phân tích định lƣợng của 15 hợp chất chính liên quan
đến 2 giống trên. Kết quả không tìm thấy chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong giống
IR64. Xử lý thống kê cho thấy các chất sau có sự khác biệt giữa giống lúa thơm và
không thơm: pentanol; 2 – acetyl – 1 – pyrroline; benzaldehyde; octanol;
pentadecan – 2 – one; 6,10,14 – trimethylpentadecan – 2 – one và hexanol.
Khi so sánh nồng độ các cấu tử bay hơi thu đƣợc trong quá trình chiết xuất
gạo thơm, Petrov và ctv (1996) [47] đã xác định đƣợc 9 thành phần có sự khác biệt
rõ rệt về nồng độ giữa loại gạo thơm và gạo thông thƣờng: pentanol; hexanol; 2 –
15
15
acetyl – 1 – pyrroline; (E) – hept – 2 – enal; benzaldehyde; octanal; pentadecan – 2
– one; 6,10,14 – trimethylpentadecan – 2 – one và hexadecanol. Trong số 9 hợp chất
trên, pentadecan – 2 – one thể hiện mối tƣơng quan nghịch với những hợp chất khác,
và là thành phần đặc trƣng trong giống gạo thông thƣờng (IR64) còn 6 hợp chất góp
phần tạo mùi thơm trong gạo thơm: hexanal, octanal, nonanal, (E) – non – 2 – enal,
(E,E) – deca – 2,4 – dienal và 2 – acetyl – 1 – pyrroline.
Theo Paule C. M. và Powers J. J. (1989) [46], hàm lƣợng hexanol tƣơng
quan nghịch với chất lƣợng mùi thơm trong gạo, trong khi đó, 2 – acetyl – 1 –
pyrroline lại tƣơng quan thuận. Kết quả nghiên cứu này một lần nữa chứng minh kết
luận của Buttery và ctv (1983a) [19] rằng 2 – acetyl – 1 – pyrroline là thành phần
chính chịu trách nhiệm cho mùi thơm đặc trƣng trong gạo thơm là đúng đắn.
Theo Widjaja và ctv (1996) [69], thành phần chính trong tất cả các loại gạo
là hexanal. Khác biệt cơ bản giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng là gạo thông
thƣờng chứa hàm lƣợng hexanal, heptanal; 6 – methyl – 5 – hepten – 2 – one; (E) –
2 – heptenal; 1 – octen – 3 – ol; nonanal; (E) – 2 – octenal và (E) – 2, (E) – 4 –
decadienal nhiều hơn so với gạo thơm.
Các thành phần hóa sinh góp phần tạo phát triển mùi thơm, nhƣng khả năng
hình thành mùi thơm của cây còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền, môi trƣờng, dinh
dƣỡng và điều kiện bảo quản (Simon và ctv, 1980; Paillard, 1981) [55, 45]. Do đó,
sự khác biệt giữa mùi thơm trong gạo thơm và gạo thông thƣờng không thể chỉ dựa
trên các thành phần hóa sinh (nhƣ acid béo, amino acid, đƣờng hay sắc tố) của mỗi
giống [47].
Hiện nay có 2 quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo. Quan điểm
thứ nhất cho rằng chất thơm đƣợc tạo ra từ các hợp chất aldehyde (CHO) và keton
(C=O) và các hợp chất với lƣu huỳnh (Ayano và Tsuzuki, 1976) [13]. Quan điểm
thứ 2 cho rằng chất thơm lúa gạo, do vòng pyrrol kiểm soát tính thơm của chất 2-
acetyl-1-pyrroline (Buttery và ctv, 1983a) [19].
16
2.2.2.2. Hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline
3
Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của 2 – AP
2 – acetyl – 1 – pyrroline, một hợp chất thơm có mùi tƣơng tự nhƣ mùi bắp
nổ, đƣợc đánh giá là một thành phần chất thơm quan trọng trong các giống gạo
thơm do đặc tính giữ mùi lâu hơn so với các thành phần bay hơi khác trong gạo [19,
22]. Buttery và ctv (1983a) [19] đã chiết xuất 2 – AP và những hợp chất bay hơi
khác từ gạo bằng cách sử dụng hệ thống chiết xuất Likens – Nickerson (SDE). Sản
phẩm thu đƣợc đƣợc phân tích bằng GC/MS. Sau đó, họ đã định lƣợng 2 – AP bằng
máy sắc ký khí với đầu dò FID [21].
Hình 2.3. Phổ đồ hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline (A: Tanchotikul and Hsieh,
1991; B: Varaporn và Sarath, 1993) [64, 68]
Năm 1983, Buttery và ctv [19] đã nghiên cứu 7 giống lúa thơm. Trong số các
thành phần xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí, hợp chất 2 – acetyl – 1 –
pyrroline đã tìm thấy và có mùi tƣơng tự nhƣ mùi thơm của cơm. Ngƣỡng mùi thơm
của chất này trong nƣớc là 0,1μg/l và mùi thơm tích lũy tƣơng tự nhƣ loại bắp nổ
17
17
(pop corn). Theo Buttery và ctv (1982, 1983a) [18, 19], 2 – acetyl – 1 – pyrroline là
thành phần chính trong hỗn hợp các chất thơm có trong gạo thơm, góp phần cấu
thành nên hƣơng thơm của gạo. Do đó, có thể cho rằng thành phần chính dùng để
nhận biết sự khác biệt về mùi giữa gạo thông thƣờng và gạo thơm là 2 – acetyl – 1 –
pyrroline.
Buttery và ctv (1983a) [19] nhận thấy rằng, các giống gạo thơm chứa 0,04 –
0,09 ppm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong khi các giống gạo thông thƣờng chứa
lƣợng thấp hơn khoảng 10 lần (< 0,006 đến < 0,008 ppm). Họ đã công bố những
chất thơm này chỉ đƣợc tìm thấy trong quá trình nấu nƣớng mà không đƣơc phát
hiện trong gạo thô. Nhƣng theo Yoshihashi (2002) [75], hợp chất thơm 2 – AP
không phải đƣợc hình thành trong quá trình nấu nƣớng hay do điều kiện bảo quản
sau thu hoạch mà chúng đƣợc hình thành từ phần khí sinh của cây trong suốt thời
gian gieo trồng. Năm 2003, Wornpongchai và ctv [70] đã tìm thấy 2 – AP trong gạo
thô và các bộ phận khác của cây bằng phƣơng pháp chiết xuất không sử dụng nhiệt.
Họ cho rằng, 2 – AP chính là một hợp chất thứ cấp hiện diện trong cây lúa đặc sản.
Hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline đƣợc xác định là thành phần chính trong
tinh dầu lá dứa. Theo Buttery và ctv (1983a) [19], trong lá dứa chứa khoảng 1 ppm
2 – acetyl – 1 – pyrroline, hàm lƣợng này cao gấp 100 lần so với những loại gạo
thông thƣờng. Vì thế, ở một vài nƣớc châu Á, ngƣời dân thƣờng cho lá dứa vào
trong quá trình nấu cơm đối với những loại gạo thông thƣờng để có đƣợc mùi thơm
nhƣ gạo thơm [68].
Thí nghiệm phân tích của Trung tâm Nghiên cứu vùng của Bộ nông nghiệp
Hoa Kỳ và IRRI (1982) (trích dẫn bởi Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [9] cũng cho kết quả
về hàm lƣợng chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline của 8 giống lúa thơm và 2 giống lúa
không thơm. Hàm lƣợng chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline của Khao Dawk Mali
105 và Basmati 370 là 0,07 và 0,06 ppm theo thứ tự, giống đối chứng Calrose là
0,006 ppm.
Hussain và ctv (1987) [35] thực hiện so sánh mùi thơm giữa lúa thơm
(Basmati) và lúa không thơm. Xác định hợp chất thơm dựa trên các peak
18
pentadecan-2-one, hexanol, 2-pentylfurane với nồng độ cao ở lúa Basmati. Chất 2-
acetyl-1-pyrroline không tìm thấy. Tuy vậy, hầu hết các nghiên cứu thực hiện sau
năm 1983 (Buttery và ctv, 1983b, 1986, 1988; Paule và Powers, 1989; Lin và ctv,
1990; Tanchotikul và Hsieh, 1991) đã chứng tỏ tầm quan trọng của thành phần 2 –
acetyl – 1 – pyrroline. Hàm lƣợng của hợp chất này trong gạo dao động từ 6 – 90
µg/kg tùy theo chất lƣợng mùi thơm trong gạo thơm (Buttery và ctv 1983b) [20].
2 – AP không chỉ đóng vai trò quan trọng trong gạo thơm mà còn đƣợc xem
là thành phần chính trong vỏ và ruột bánh mì (Schieberle và Grosch, 1991 và
1991a), bắp nổ (Schieberle, 1991a), hạt kê (Seitz và ctv, 1993), bánh ngô
(Karahadian và Johnson, 1993), lá dứa (Buttery và ctv, 1983a; Laksanalamai và
Ilangantileke, 1993), mật cây đoan (Blank và ctv, 1989) và bia Đức (Schieberle,
1991b) (trích dẫn bởi Petrov, 1996) [47].
2 – AP còn là thành phần chính đƣợc tổng hợp từ một vài dòng Bacillus
cereus phân lập đƣợc từ việc lên men quả ca cao (Romanczyk và ctv, 1995) [51].
Theo Buttery và ctv (1983a) [19], 2 – acetyl – 1 – pyrroline có cùng nguồn
gốc với 2 – acetyl – 1,4,5,6 – tetrahydropyridine là 1 thành phần chất thơm đã đƣợc
Hunter và ctv (1969) tìm thấy trong bánh mì hay bánh nƣớng. Proline hay
hydroxyproline cũng là tiền thân của 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Khi thay thế nhóm –
COOH của hydroxyproline thành nhóm methyl keton bằng cách khử nƣớc và
chuyển nối đôi sang vị trí số 1 sẽ tạo ra đƣợc 2 – AP.
Còn theo Petrov và ctv (1996) [47], 2 – acetyl – 1 – pyrroline có nguồn gốc
từ proline và ornithine. Sản phẩm của quá trình phân hủy Strecker là proline và 1-
pyrroline (Yoshikawa và ctv, 1965) [77] sẽ phản ứng với những sản phẩm của quá
trình phân hủy đƣờng tạo ra AcPy (Schieberle, 1989, 1990; Tressl và ctv, 1985) [53,
54, 65].
Mũi của ngƣời có thể phát hiện đƣợc chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline ở
nồng độ 0,007ppm. Do đó, đánh giá bằng cảm quan, trong điều kiện nhất định và
với những ngƣời có khứu giác bình thƣờng, kết quả có thể tin cậy đƣợc [9].
19
19
Theo Varaporn và Sarath (1993) [68], nồng độ 2 – AP trong gạo sẽ giảm đối
với những gạo đƣợc lƣu trữ trong thời gian dài.
Bảng 2.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến việc hình thành và lƣu giữ mùi thơm
trong gạo thơm (nguồn Singh và ctv, 2000) [58]
Các yêu tố góp phần gia tăng chất
lƣợng mùi thơm
Các yếu tố làm suy giảm chất lƣợng
mùi thơm
Thời tiết mát mẻ trong thời kỳ ra hoa và
hạt chín
Bón phân với liều lƣợng thích hợp
Đất màu mỡ
Gieo hạt trực tiếp
Đất nhẹ, chân ruộng cao
Nhiệt độ tăng cao trong thời kỳ ra hoa và
hạt chín
Phân bón chứa lƣợng urê quá cao
Đất nghèo dinh dƣỡng
Trồng lúa theo hình thức gieo xạ
Đất nặng
Độ ẩm trong đất thấp trong giai đoạn hạt
chín
Xay xát thủ công
Thu hoạch muộn
Sử dụng máy móc trong giai đoạn xay
xát lúa
2.3. PHƢƠNG PHÁP VI CHIẾT XUẤT TRÊN PHA RẮN (SPME)
Nguyên tắc
SPME là 1 phƣơng pháp chiết xuất không cần sử dụng dung môi, đƣợc phát
minh bởi Pawliszyn và cộng sự từ năm 1989 [34]. Phƣơng pháp này dựa trên cơ chế
hấp phụ các chất hữu cơ cần phân tích từ pha nƣớc hoặc pha khí lên sợi silica đƣợc
phủ các chất hấp phụ thích hợp nhƣ polydimethylsiloxan (PDMS), PDMS/DVB
(divinyl benzen), polyacrylat…thông qua tác động phân chia giữa những chất đƣợc
hấp phụ và hỗn hợp mẫu. Quá trình hấp phụ diễn ra khi nhúng sợi chiết vào mẫu
lỏng hay khi phơi sợi chiết ra môi trƣờng phía trên mẫu lỏng hay rắn. Các hợp chất
bám trên sợi silica sẽ đƣợc giải hấp phụ trực tiếp vào buồng hóa hơi của thiết bị sắc
ký khí.
20
Đặc điểm
Kỹ thuật này kết hợp các giai đoạn chuẩn bị mẫu, chiết xuất, cô cạn mẫu
thành 1 bƣớc đơn giản, không cần sử dụng dung môi. Các chất cần phân tích sẽ
đƣợc chiết xuất và làm giàu trực tiếp vào sợi chiết. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm
thời gian chuẩn bị mẫu và lƣợng dung môi sử dụng, và có thể cải thiện đƣợc giới
hạn dò. Thuận lợi chính của phƣơng pháp là khả năng phân tích tốt, đơn giản, giá
thành thấp. Sản phẩm thu đƣợc từ phƣơng pháp SPME tƣơng đối sạch và cô đặc,
khả năng ứng dụng MS cao.
Kỹ thuật SPME thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với GC và GC/MS. Kỹ thuật
này đã đƣợc áp dụng thành công trong việc phân tích nhiều thành phần khác nhau,
đặc biệt, trong quá trình chiết xuất những thành phần hữu cơ bay hơi có trong
những mẫu phân tích môi trƣờng, sinh học, thực phẩm, dƣợc phẩm. Sợi chiết dùng
trong kỹ thuật SPME có thể đƣợc đƣa trực tiếp vào hệ thống HPLC và LC/MS để
phân tích những thành phần bay hơi kém hay không bền nhiệt không thể thực hiện
trên thiết bị GC hay GC/MS.
Thời gian chiết xuất phụ thuộc vào các yếu tố: loại sợi chiết sử dụng, kích
thƣớc mẫu, bề dày lớp polymer. Sử dụng sợi chiết có lớp polymer càng dày thì thời
gian chiết xuất càng dài, nhƣng hệ số lặp lại càng cao. Thời gian chiết xuất không
phụ thuộc nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu. Thông thƣờng, lớp film có bề
dày mỏng nhất ở mức độ có thể chấp nhận đƣợc thƣờng đƣợc sử dụng để giảm thời
gian chiết xuất.
2.4. SẮC KÝ KHÍ (Gas Chromatography - GC)
Nguyên tắc
Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong gạo thơm sẽ bị hấp thụ trên
pha tĩnh của cột phân tích khác nhau nên có thời gian lƣu khác nhau. Trên cơ sở
khác nhau về thời gian lƣu này mà ngƣời ta có thể định tính và định lƣợng cấu tử
cần nghiên cứu [11].
21
21
2.5. SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS)
Sắc ký khối phổ là một loại sắc ký đặc biệt, vì sau khi ra khỏi cột sắc ký, các
cấu phần đƣợc lần lƣợt cho vào buồng MS để thực hiện việc ghi phổ của từng cấu
phần. Nhờ một phần mềm, các phổ MS này đƣợc so sánh với các phổ MS chuẩn
chứa trong thƣ viện của máy tính. Do đó để tăng độ chính xác cho sự dò tìm và so
sánh, thƣ viện phổ khối lƣợng cần phải có nhiều phổ chuẩn. Độ tƣơng hợp giữa phổ
MS của các cấu phần và phổ mẫu có tính tƣơng đối tùy thuộc phần mềm phụ trách
việc so sánh, thƣờng thì độ tƣơng hợp càng lớn thì xác suất định danh càng cao.
Kinh nghiệm về thành phần hóa học và kiến thức về phổ khối lƣợng có tính quyết
định rất lớn đến độ chính xác của kết quả định danh. Đầu dò phổ khối lƣợng có độ
nhạy cao, khoảng 10-6 – 10-9 g, do đó có thể xác định đƣợc những cấu phần có hàm
lƣợng thấp mà các phƣơng pháp khác không thể thực hiện đƣợc. Sắc ký khối phổ có
khả năng định danh cao, khả năng dò tìm nhanh, lƣợng mẫu sử dụng ít [11].
22
Chƣơng 3.
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH
- Địa điểm: Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại học Nông
Lâm TP.HCM, nhà lƣới thuộc trƣờng Đại học Nông Lâm.
- Thời gian: tháng 3/2007 đến tháng 7/2007.
3.2. VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ
- Vật liệu: 4 giống lúa thơm Jasmine, VD20, ST3, OM3536.
- Hoá chất sử dụng: ethanol (Merck), acetone (Merck), methanol (Merck), 2,4,6-
collidine (2,4,6-trimethyl pyridine) (Merck), nonanal (Merck), hexanal (Merck),
hexanol (Merck), tetradecane (Merck), octanol (Merck), decanal (Merck), pentanol
(Merck), KOH (Merck).
- Dụng cụ và thiết bị:
Tủ mát, Darling (Việt Nam).
Tủ lạnh, Hitachi (Japan).
Máy bóc vỏ trấu TR200 (Nhật)
Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức).
Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ).
Máy sắc ký khối phổ HP 6890 N (G1530N) – Agilent Technologies
(Mỹ).
Kim SPME (SupelcoTM SPME fiber holder) – Bellefonte, PA (Mỹ).
Máy nhiệt từ, Ikamag (Đức).
Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co. (Hàn Quốc).
Tủ sấy, Memmert (Đức).
23
23
Kìm đóng nắp, Mỹ.
Micropippet loại 10 – 100 μl, đầu típ 100 μl, cá từ, nắp nhôm. Lọ bi
10ml, Agilent (Mỹ).
Bình tam giác 250 ml (Trung Quốc).
Kéo, đĩa petri, khay nhựa, xô nhựa (loại 10 lít), giấy lọc Walkman,
bao plastic, bình định mức 25 ml, 10ml, 50ml.
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Khảo sát sự biến đổi các hợp chất thơm ở cây lúa qua các thời kì sinh
trƣởng.
So sánh hàm lƣợng các hợp chất thơm giữa 4 giống Jasmine, OM3536,
ST3, VD20.
Xác định lại hệ số phản hồi của 2 – acetyl – 1 - pyrroline theo nồng độ
8 chất chuẩn: 2,4,6-collidine (2,4,6-trimethyl pyridine), nonanal,
hexanal, hexanol, tetradecane, octanol, decanal, pentanol.
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phƣơng pháp trồng lúa
- Xử lí hạt: Ngâm hạt giống 24 giờ, để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Chuyển hạt sang đĩa petri có lót giấy lọc, giữ ẩm.
- Sau 3 ngày, khi hạt đã nhú rễ và mầm, chuyển hạt sang cát, giữ ẩm.
- Khi cây có 2-3 lá mầm, chuyển sang chậu đất (5cây/xô) và đặt trong nhà
lƣới, tƣới nƣớc thƣờng xuyên (giữ lớp nƣớc khoảng 2cm).
- Sau 45 ngày, tiến hành bón phân cho cây theo tỉ lệ N/P/chậu là
0.5g/0.25g/xô.
24
3.4.2. Chiết xuất hợp chất bay hơi có trong gạo thơm bằng phƣơng pháp
SPME
3.4.2.1. Dụng cụ sử dụng cho kỹ thuật SPME
Hình 3.1. Cấu tạo sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME
Sợi chiết đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SPME là một đoạn sợi quang học có
chứa silica biến tính, ngắn và mỏng (dài khoảng 1 cm, đƣờng kính ngoài cỡ 0,11
mm), đƣợc bao phủ bên ngoài bởi một lớp polymer mỏng (ví dụ
polydimethylsiloxane) (hình 3.1). Sợi chiết này khá ổn định cả ở nhiệt độ cao và có
cấu tạo hóa học tƣơng nhƣ phía bên trong của cột mao quản silica biến tính sử dụng
trong phƣơng pháp sắc ký khí. Sợi chiết đƣợc gắn với một cần kim loại, tất cả đƣợc
đặt trong ống kim loại bảo vệ. Để thuận tiện khi sử dụng, toàn bộ hệ sợi chiết và các
bộ phận phụ trợ đƣợc bố trí theo kiểu xyranh (hình 3.2).
25
25
Hình 3.2. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME
Nhiều loại pha tĩnh tẩm cho sợi chiết đƣợc nghiên cứu với mục đích chiết các
nhóm chất khác nhau. Giống nhƣ qui tắc khi lựa chọn cột sắc ký khí “các chất giống
nhau dễ hòa tan trong nhau”, pha tĩnh tẩm sợi chiết cũng đƣợc lựa chọn trên cơ sở
độ chọn lọc đối với các chất cần phân tích đã định và khả năng bay hơi của những
chất này. Các pha tĩnh không phân cực (ví dụ: polymethylsiloxan) lƣu giữ
hydrocacbon rất tốt. Ngƣợc lại, pha tĩnh phân cực (nhƣ polyacrylat và cacbowax) lại
chiết đƣợc các hợp chất phân cực nhƣ phenol, acid cacboxylic rất hiệu quả. Ái lực
của pha tĩnh đối với chất cần phân tích có tính chất quyết định trong việc lấy mẫu
theo SPME vì cả nền mẫu và pha tĩnh đều cạnh tranh trong tƣơng tác với chất phân
tích. Ví dụ, một pha tĩnh đƣợc lựa chọn để chiết các chất phân cực ra khỏi nƣớc
phải có ái lực với chất phân tích mạnh hơn ái lực của nƣớc với chất đó thì mới có
thể thực hiện đƣợc quá trình chiết theo yêu cầu.
26
3.4.2.2. Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật vi chiết xuất trên pha rắn
Kỹ thuật chiết SPME gồm 2 giai đoạn: (1) phân bố chất phân tích giữa mẫu
và pha tĩnh của sợi chiết, (2) chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp từ pha tĩnh
của sợi chiết và chuyển vào thiết bị phân tích [34].
Hình 3.3. Các kỹ thuật chiết dùng trong phƣơng pháp SPME
Để thực hiện quá trình chiết, mẫu nƣớc chứa chất hữu cơ hoặc mẫu rắn chứa
chất hữu cơ dễ bay hơi cần phân tích đƣợc đặt trong lọ, đóng kín bằng nút có
septum. Khi lấy mẫu, ống kim loại bảo vệ chứa sợi chiết SPME đâm xuyên qua
septum, sau đó pittông sẽ đẩy sợi chiết lộ ra khỏi ống kim loại bảo vệ. Sợi chiết
đƣợc nhúng vào mẫu lỏng hoặc nằm trong không gian hơi phía trên pha mẫu
(headspace) (hình 3.3).
Chất phân tích đƣợc chiết từ mẫu vào pha tĩnh của sợi chiết. Sau thời gian
hấp phụ, sợi chiết đƣợc kéo vào trong lòng ống bảo vệ, rồi rút ra khỏi lọ đựng mẫu.
Sau đó ống bảo vệ chứa sợi chiết đƣợc đƣa vào bộ phận bơm mẫu của sắc ký khí
hoặc sắc ký lỏng cao áp, pittông lại đẩy sợi chiết ra khỏi ống bảo vệ. Lúc này, sợi
chiết tiếp xúc với môi trƣờng nhiệt độ cao trong bộ phận bơm mẫu của GC, các chất
phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp nhiệt và chuyển vào cột sắc ký khí. Trong
HPLC, dung môi đƣợc sử dụng để giải hấp chất phân tích khỏi sợi chiết. Sau các
27
27
quá trình giải hấp này, sợi chiết lại đƣợc kéo vào lòng ống bảo vệ và rút ra khỏi bộ
phận bơm mẫu.
3.4.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 –
acetyl – 1 – pyrroline
Grimm và ctv (2001) đã ứng dụng kỹ thuật SPME để khảo sát qui trình phân
tích hàm lƣợng 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo thơm [33]. Theo họ, lƣợng 2 –
AP thu đƣợc sẽ tăng gấp đôi khi tăng nhiệt độ từ 60oC lên 85oC. Ngƣợc lại, hàm
lƣợng chất chuẩn 2,4,6 – trimethylpyridine sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Không có sự
khác biệt đáng kể về hàm lƣợng 2 – AP khi chiết xuất mẫu ở 80°C và 85°C, do đó,
80
°C đƣợc xem là điểm nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết suất.
Khoảng thời gian từ 10 – 15 phút đủ để thu nhận hầu hết các chất bay hơi,
trong khi những thành phần ít bay hơi hơn nhƣ acid hữu cơ hay ester phải tốn hàng
giờ mới có thể thu nhận đƣợc. Sau khi so sánh lƣợng 2 – AP thu đƣơc sau khoảng
thời gian hấp phụ là 10, 15, 20 phút, họ đã rút ra kết luận thời gian chiết xuất mẫu
phù hợp nhất là 15 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc thêm nƣớc vào mẫu gạo sẽ giúp tăng hàm
lƣợng 2 – AP thu nhận đƣợc, đồng thời giảm đƣợc yêu cầu phải nghiền mẫu, góp
phần đơn giản hóa quá trình chuẩn bị mẫu. Lƣợng nƣớc cất tối ƣu sử dụng cho quá
trình chiết suất là 200 µl.
Để xác định lƣợng 2 – AP hấp thu, diện tích peak đƣợc chuyển thành khối lƣợng
bằng cách dựng đƣờng chuẩn dựa trên chuẩn 2 – AP pha loãng trong CHCl3. Theo
kết quả nghiên cứu của Casey và ctv (2001), hàm lƣợng 2 – AP trung bình thu đƣợc
trong mẫu gạo Jasmine khi phân tích bằng phƣơng pháp SPME là 2,2 ng trong 0,75
g gạo, tƣơng đƣơng với 2,9 ppb. Phƣơng pháp SPME phù hợp cho việc so sánh mối
tƣơng quan về nồng độ 2 – AP giữa các mẫu gạo khác nhau. Nhìn chung, trong tất
cả các trƣờng hợp, phƣơng pháp SPME có thể phân biệt giữa gạo thơm và gạo
thông thƣờng. Cấu tử 2 – AP đƣợc phân tách ở 5 phút 42 giây, và chỉ chiếm 1 lƣợng
nhỏ trong tổng số các chất bay hơi, nhƣng lƣợng này đủ để chiếm ƣu thế trong
thành phần chất thơm có trong cơm gạo.
28
Cách tiến hành:
- Tiến hành thu mẫu lá (3 tuần/lần, 3cây/giống).
- Lấy toàn bộ cả phần rễ cây, rửa sạch đất, cho vào bao plastic với một ít
nƣớc ngập rễ. Bảo quản ở nhiệt độ mát.
- Phân tích hàm lƣợng 2AP trong lá, hạt theo phƣơng pháp vi chiết xuất
trên pha rắn SPME (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [50,
48]:
+ Chuẩn bị mẫu: cắt bỏ rễ, thân, cắt nhỏ 0,5g ± 0,01g lá (hoặc 1,0g ±
0,01g hạt) cho vào vial, thêm 200µl KOH 0,1N, đậy nắp. Bảo quản mẫu ở
nhiệt độ
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- PHAM MAI THUY TRANG.pdf