Khóa luận Khảo sát quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm trichoderma reesei

thế enzyme có thể tồn tại trong cơ thể lâu dài vì enzyme bị biệt lập với môi trường xung quanh. Do đó cơ thể tạo được nồng độ cao của enzyme thiếu mà không bị ảnh hưởng của các phản ứng phụ. Enzyme được cố định còn được dùng trong chuẩn đoán bệnh. Ngoài các ứng dụng điện cực enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa của máu như lượng: glucose, urea, cholesterol…Enzyme Horseradish peroxidase cố định trên polystyren cùng với kháng thể , giúp chuẩn đoán nhanh và chính xác (kĩ thuật ELISA). Enzyme L-asparaginase có khả năng ức chế sự phát triển của u ác tính, nếu đưa trực tiếp enzyme này vào cơ thể sẽ bị đưa ra ngoài nhanh chóng và gây nên hiện tượng dị ứng, nhưng nếu đưa các vi tiểu cầu có gắn enzyme vào cơ thể sẽ có hiệu quả cao hơn. 2.7.5.3. Trong nghiên cứu khoa học Năm 1967, điện cực enzyme đã được chế tạo để xác định nồng độ glucose nhờ glucoxydase cố định. Điện cực enzyme là điện cực oxy trên bề mặt gel polyacryamide. Nhúng điện cực vào dung dịch glucose thì cơ chất và oxy sẽ khuếch tán vào gel chứa enzyme. Như vậy sự biến đổi dòng điện trong hệ thống điện cực phụ thuộc vào tốc độ phản ứng và nồng độ glucose. Kaetsu dùng điện cực urease trong máu, dùng cholesterol oxydase đo nồng độ cholesterol. Clark dùng điện cực alcohol oxyreductase để xác định nồng độ cồn. Ngoài ra enzyme cố định còn có thể được dùng vào nhiều mục đích khác nhau như: hoạt hóa enzyme zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng trong phương pháp sắc kí ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme. Ngày nay có nhiều quy trình sử dụng tế bào cố định để xử lí nước thải đạt hiệu quả cao. 2.7.5.4. Trong bảo vệ môi trường Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, rượu, bia, chế biến đường…chất thải, phế phụ liệu của những nhà máy này là nguồn ô nhiễm nặng do giàu chất hữu cơ. Do đó có thể sử dụng enzyme cố định để xử lí nước thải sinh học nhằm làm giảm thiểu hàm lượng hữu cơ trước khi đưa ra ngoài môi trường bên ngoài. 2.7.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.7.6.1. Tình hình nguyên cứu trong nước Nghiên cứu cố định enzyme chỉ mới bắt đầu ở Việt Nam trong vài năm gần đây, kết quả thu được cũng còn nhiều hạn chế. Năm 1994 -1995, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh nghiên cứu enzyme glucoisomerase trên các hạt Silochrom B2 hoạt hóa bằng glutaraldehyde. Lê Văn Hiệp (1995), cố định vi khuẩn tả (Vibrio cholerea) lên giá thể PHEMA bằng kĩ thuật bức xạ, Nguyễn Quốc Hiến (1996) đã nghiên cứu chế tạo chế phẩm hormone progesterone thải chậm bằng kĩ thuật bức xạ. Lê Quang Luân (1997) đã cố định vi khuẩn Pseudomonas mastophlla để xử lí chất hữu cơ nước. Nguyễn Quang Tâm (2002) đã nghiên cứu cố định pectinase thu thập từ các chủng nấm mốc, Nguyễn Quyết (2004) đã nghiên cứu cố định α – amylase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis… 2.7.6.2. Tình hình nguyên cứu ngoài nước Cho đến năm 1979, người ta còn rất hy vọng có thể áp dụng công nghệ này cho tất cả các loại enzyme. Tuy nhiên đánh giá thực sự cho thấy hiện mới chỉ có 2 công nghệ sử dụng glucose isomerase và penicillin amidase cố định là có hiệu quả. Hiện tại enzyme amino acid acyclase, aspartase, fumarase cũng đã bắt đầu được ứng dụng thực tiễn (chủ yếu là ở Nhật). Bảng 2.2 Một số enzyme cố định đang được sử dụng trong sản xuất Enzyme cố định Sản lượng (tấn/năm) Phương pháp cố định Hãng sản xuất Aminoacid acylase 1000 t DEAE sepharose Reactor màng Eupergit Tanabe Degussa Rohm Aminoglucosidase 5000 t sirô glucose Than hoạt tính Tate % Lyle Aspartate 1000 t Nhốt tế bào trong carrageeman Tanabe Furmarase Malic acid Nhốt tế bào trong carrageeman Tanabe Glucose Isomerase 6-7 triệu tấn Lactase < 1000 t sirô lactose Hạt ceramic, trao đổi ion, sợi nylon Corning Sumomoto Lipatse Chuyển ester, thủy phân Trao đổi ion celite Novo Unillever Nitrilase 6000 t acrylamide Nhốt tế bào trong polyacrylamide Nitto RNAase >500 t RNA Thủy tinh, cellulose hoạt hóa, Eugergit VR China, Japan Rohm Penicillin G amidase 4500 t 6-amino-penicillanic Eupergit Rohm Beecham Penicillin V amidase 500 t Polyacrylamide, sợi nylon Toyo Jozo Boehringer Novo Tế bào nấm men Sản xuất cồn Na-alginate KyowaHakko CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY 3.1. Thiết bị và hóa chất 3.1.1. Thiết bị Bể ổn nhiệt Cân phân tích Máy ly tâm Máy quang phổ UV Máy lắc nuôi cấy Nồi khử trùng Máy đo pH Tủ sấy Ống nghiệm Bình tam giác Phễu lọc, giấy lọc Đũa khuấy Pipet man các loại Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml Gía đựng ống nghiệm Ống đong 100ml, 250ml Xi lanh Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-rad, Mỹ Các dụng cụ chạy điện di Tủ lạnh Hình 3.1 Máy đo pH Hình 3.2 Cân phân tích Hình 3.3 Máy đo quang UV Hình 3.4 Máy ly tâm Hình 3.5 Bể ổn nhiệt 3.1.2. Hóa chất Triton X-100 Tween-20 Tweeen-80 Sodium carboxymethyl cellulose Coomassie Brilliant Blue Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 960, muối ammonium sulphate, acetone Dung dịch đệm phosphate: NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4 Hóa chất xác định hàm lượng protein: Thuốc thử Bradfosd CaCl2 0,02M Acid acetic 1% Chế phẩm 3.2. Quy trình thu nhận dịch chiết enzyme thô (quy mô công nghiệp) Dịch ↓ (Trộn tỷ lệ nước) ↓ Khuấy ↓ Lọc ↓ Thu Dịch ↓ Ly tâm (8000 vòng/p) ↓ Dịch ↓ Tủa (bằng : cồn, aceton, muối amoni sunfat) Ly tâm ↓ Enzyme thô ↓ Tinh sạch ↓ 3.2.1. Thuyết minh quy trình Chủng nấm Trichoderma Reesei được nuôi cấy trên môi trường BM:CM (bã mía:cám mì), sau quá trình nuôi cấy ta thu được chế phẩm enzyme thô từ môi trường. Cân 5 g chế phẩm enzyme thô cho vào cốc thủy tinh, thêm vào 20 ml nước cất. Khuấy đều dịch enzyme trong khoảng thời gian 30 phút (có thể khuấy trong khoảng thời gian 40, 50 phút, nhưng khoảng thời gian khuấy 30 phút là phù hợp nhất). Lọc lấy dịch chiết được thể tích khoảng 17,5 ml. Đem dịch lọc được đi ly tâm. Thu dịch ly tâm. Tủa dịch ly tâm (bằng cồn, acetone, hoặc muối amoni sulphate), trong trường hợp này ta tủa dịch ly tâm bằng cồn 960, với tỷ lệ 1:3, tức là: 17,5 ml dịch chiết enzyme thô với 52,5 ml cồn 960. Tách lấy phần tủa ở dưới đem đi ly tâm. Thu dịch ly tâm đem cân phân tích thu được khoảng 20,1g enzyme thô. Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme cellulase ở 400 C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương). Sau đó ta đem enzyme thô đi tinh sạch bằng quá trình lọc gel hay sử dụng phương pháp cố định enzyme để thu được enzyme cellulase thành phẩm. Hình 3.6 Dịch chiết enzyme thô sau khi ly tâm 3.3. Xác định hàm lượng, hoạt tính của enzyme cellulase 3.3.1. Xác định hàm lượng enzyme cellulase theo phương pháp Bradford Các Protein khi phản ứng xanh với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue-CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian. Hóa chất, thiết bị: Dung dịch mẫu enzyme cellulase cần xác định. Dung dịch albumine 0.1mg/ml: Cân chính xác 10mg albumin pha trong 100ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200 C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumine có nồng độ 0.01mg/ml. Dung dịch thuốc thử Bradford: Coomassie Brilliant Blue: 0.001g. Ethanl tuyệt đối: 4,7g Acid phosphoric 85%: 8.5g Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Thiết bị: Máy quang phổ Lập đồ thị chuẩn Để dung dich albumin chuẩn có các nồng độ từ 10-50 µg/ml ta thực hiện như sau: Bảng 3.1 Chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn Ống số 1 2 3 4 5 6 Nồng độ albumin (µg) 0 10 20 30 40 50 Dung dich albuine(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại 2, 3, 4, 5, 6 các ống cách nhau 1 phút. Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành 1 cách tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Đo ở bước sóng 595nm. Tính kết quả Trị số mật độ quang (OD) của những ống chứng (ống 2 đến ống 6) sau khi trừ đi trị số của ống thử không (ống 1) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ protein chuẩn (µg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không, rồi chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (µg/ml). Tổng hàm lượng protein trong M (g) chế phẩm thô được tính theo công thức: mg protein = b x 10-3 x m x M Với: b: nồng độ protein suy ra từ đường chuẩn (µg/ml) m: hệ số pha loãng M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g) 3.3.2. Xác định hoạt tính enzyme cellulose bằng phương pháp đường chuẩn glucose Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất carboxymethyl cellulose bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH 5,0 và 400 C. Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic, màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540 nm. Dụng cụ, thiết bị Máy ly tâm. Bộ ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy Vortex, pH kế, cân phân tích. Bếp điện. Chậu nước lạnh. Que khuấy thủy tinh. Hóa chất Cồn 960 . Sodium acetate. NaOH 1N. Bảng 3.2 Thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme cellulase Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 ml dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 Ml dd DNS-Lactose 2 2 2 2 2 2 2 Ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ của ống số 0 ở bước sóng 540 nm bằng 0. Đo độ hấp thụ của các ống còn lại ở bước sóng 540 nm. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) Ống nghiệm 1: Chỉnh quang phổ kế về độ hấp thụ bằng 0. Hút 1ml dung dịch đệm Na-acetac 50Mm, pH 5.0 cho vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chưa enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đặt độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm bằng 0. Ống nghiệm 2: Phản ứng enzyme Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm và để ở 400 C/5 phút. Đồng thời, ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400 C/5 phút. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều. Để phản ứng ở 400 C chính xác 10 phút. Thêm 2ml dung dịch DND-Lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Ống nghiệm 3: Không có phản ứng enzyme Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm đun sôi từ 5 đến 10 phút để bất hoạt enzyme. Thêm 2ml dung dịch DNS-Lactose và lắc đều. Thêm 1ml dung dịch CMC 1% chứa dung dịch enzyme và lắc đều. Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm. Định lượng đơn vị hoạt tính Một đơn vị CMCase là lượng enzyme mà sẽ giải phóng đường khử như glucose khi thủy phân CMC với vận tốc 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng. 3.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường, độ ẩm, thời gian, nhiệt độ tối ưu, độ pH tối ưu 3.4.1. Nghiên cứu thành phần môi trường Chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm với các thành phần môi trường tương ứng như sau.Cố định thành phần cám 75% và thành phần (NH4)2SO4 1%, thay đổi thành phần trấu. Trấu là tác nhân kích thích sinh tổng hợp cellulase. Ta có bảng thành phần môi trường thí nghiệm được bố trí như sau. Bảng 3.3 Thành phần môi trường thí nghiệm theo phần trăm Đơn Vị Tính Phần Trăm (%) Môi Trường Số 1 2 3 4 5 6 Cám 75 75 75 75 75 75 Trấu 22 20 18 16 14 12 (NH4)2SO4 1 1 1 1 1 1 Thêm nước điều chỉnh độ ẩm 60%. Cấy giống vào và nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng 28-300C. Thời gian khảo sát đối với Trichoderma.viride là 72 giờ. Sau đó xác định hoạt tính enzyme cellulase (đối với Trichoderma.viride) bằng cách đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 540 nm cho cellulase. Trong thành phần môi trường nhân giống, chúng tôi cố định hàm lượng cám và muối sunphat amôn ((NH4)2SO4), thay đổi thành phần trấu . Trấu là tác nhân làm cho môi trường thoáng xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Ban đầu nấm mốc sẽ tận dụng những chất dễ tiêu trong môi trường như các loại đường nhưng khi môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt thì nấm mốc phải tiết ra những enzyme để phân hủy cơ chất khác thành đường để tiếp tục tồn tại và phát triển. Tuy nhiên, cũng tùy thuộc vào nồng độ của cơ chất nhiều hay ít mà nấm mốc sẽ tiết ra lượng enzyme khác nhau. Sự tổng hợp của enzyme còn phụ thuộc vào khả năng tiết tối đa của từng loại vi sinh vật có nghĩa là nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì hoạt tính enzyme sẽ giảm do 2 nguyên nhân, thứ nhất do cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp, thứ hai do cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa không đổi làm hoạt tính enzyme giảm. 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian Kết quả của thí nghiệm trên được áp dụng để tiếp tục cho thí nghiệm này. Sau khi chọn được môi trường tốt nhất cho sinh tổng hợp enzyme cellulase (đối với Trichoderma. viride), ta tiến hành bố trí thí nghiệm nuôi cấy nấm mốc và lấy mẫu ở các thời điểm khác nhau. Thời gian khảo sát từ 28 – 32 – 36 – 40 – 44 – 48 – 52 giờ, giữ nguyên độ ẩm 60%. Khi cấy nấm mốc vào môi trường, chúng sẽ không tiết ngay ra enzyme mà sẽ tiết kiệm năng lượng đến mức tối đa và sử dụng ngay những chất dễ sử dụng nhất là các đường đơn, khoáng chất có sẵn. Sau đó chúng sẽ tiết ra enzyme tùy vào thành phần các chất có trong môi trường. Nấm mốc phát triển được chia ra thành 4 giai đoạn như sau: thích nghi, phát triển, cân bằng và tử vong. Ở giai đoạn thích nghi và phát triển, nấm mốc sẽ tìm cách thích nghi và tiết ra loại enzyme nào và số lượng bao nhiêu để có thể tồn tại và phát triển. Theo thời gian thì lượng enzyme tiết ra sẽ tăng dần và đến một mức độ ổn định, sau đó sẽ giảm đi khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt dần. Quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase cũng tăng tương ứng theo thời gian. Ở Trichoderma. viride, thời gian tăng trưởng chậm hơn nhưng tạo ra hệ enzyme cellulase rất tốt. Sản phẩm của hệ enzyme cellulase là cellobiose, một chất kìm hãm hoạt tính của exo - β -glucanase. Do đó mà quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase ở Trichoderma. viride tăng trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ 4 ngày. 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm Cũng giống như thí nghiệm trên, những kết quả khảo sát được áp dụng như thành phần môi trường và thời gian cho thí nghiệm này. Thay đổi độ ẩm theo các giá trị như sau: 50% - 54% -68% - 62% - 66% - 70%. Các quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc đều có liên quan đến độ ẩm. Độ ẩm là yếu tố quan trọng trong môi trường. Nếu độ ẩm quá thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc và làm cho tế bào bị chết. Điều này sẽ làm hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc. Nếu độ ẩm quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển. Ở một độ ẩm nhất định, khi đó hoạt động trao đổi chất diễn ra tốt nhất thì sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc sẽ diễn ra tốt nhất. Ở môi trường thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy ở độ ẩm 58% thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao nhất ở Trichoderma. viride. Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy để nấm mốc sinh trưởng và phát triển tốt và sản sinh ra từng loại enzyme cực đại thì tùy thuộc vào từng loại giống mà chúng ta bố trí độ ẩm thích hợp. 3.4.4 Xác định độ pH tối ưu Để xác định pH phản ứng tối ưu cho phản ứng xúc tác của enzyme nghiên cứu, dịch enzyme tinh sạch (0.002 mg protein) được ủ với cơ chất CMC pha trong đệm 100 mM sodium acetate, pH từ 3.5-5.5 và 100 mM potassium phosphate, pH từ 6.0-8.0, hỗn hợp phản ứng được ủ ở 500C trong 20 phút. Để đánh giá độ bền pH của enzyme nghiên cứu, trước hết cellulase (0.002 mg protein) được ủ trong các đệm có pH thay đổi trong khoảng 3.5-8.0, trong 2 giờ ủ ở 370 C. Sau đó, chọn ra khoảng pH thích hợp để tiếp tục xác định độ bền pH theo thời gian: 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. Tốt nhất ở pH 5.0. 3.4.5. Xác định nhiệt độ tối ưu Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, chủng nấm nghiên cứu được nuôi trong môi trường: urea: 0.3, (NH4)2SO4: 1.4, KH2PO4: 2.0, CaCl2: 0.3, MgSO4.7H2O: 0.3, peptone: 1, cao nấm men: 10, tween 80: 1, CMC: 10, các yếu tố vi lượng: 0.1% (v/v) bao gồm các muối: FeSO4: 18 mM, MnSO4: 6.6 mM, ZnSO4: 4.8 mM, CoCl2: 15 mM, pH: 7.0 cơ bản cho sinh tổng hợp cellulase, lắc 200 vòng/phút ở 250C, 280C; 300C, 320C và 370C, pH 7.0. Dịch canh trường được thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính cellulase, tốt nhất ở 300 C. 3.5. Khảo sát tác nhân trợ tủa 3.5.1. Tủa protein-enzyme bằng muối, dung môi hữu cơ hoặc polymer Thường được sử dụng như là bước tinh sạch đầu tiên, bởi chúng có độ chọn lọc không cao, dễ thay đổi. Ở nồng độ muối thấp, độ hòa tan của protein tăng với nồng độ muối gia tăng, gọi là staling in. Khi nồng độ muối tăng cao hơn, thì độ hòa tan của protein giảm và tạo tủa, gọi là staling out. Chủ yếu các cation và anion của muối tương tác với nước bao quanh phân tử protein, làm tăng tính kỵ nước của protein, dẫn đến tạo tủa. Trong đó, các muối trung tính như muối sulphate và phosphate, đặc biệt là muối (NH4)2SO4 là thông dụng hơn cả. 3.5.2 .Tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau Chế phẩm enzyme cellulase thô dạng bột của nấm Trichoderma reesei được chiết bằng nước cất, thu được dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này được tủa với muối (NH4)2SO4 so ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70 và cồn 960 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme: cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 cặn tủa thu được hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính cellulase nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa cellulase. Từ đó khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của cellulase từ dịch tủa enzyme thu được từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm được chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lượng phân tử cellulase bằng điện di. Kết quả thu được như sau: Ở nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1:4 là tối ưu để tủa cellulase. Cellulase hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470 C. Tủa protein-enzyme bằng phức hợp nước và dung môi hữu cơ Thường được sử dụng ở giai đoạn đầu tinh sạch enzyme. Có trở ngại là phải thực hiện ở nhiệt độ thấp (khoảng 200 C), vì dung môi hữu cơ gây biến tính protein ở nhiệt độ phòng. Ethanol và acetone là 2 dung môi thường được sử dụng nhiều nhất. Kết tủa bằng dung môi hữu cơ ưu điểm hơn kết tủa bằng muối, vì có độ chọn lọc cao hơn, ít tạo tủa vô định hình, dễ dàng thu nhận bằng ly tâm. Tủa tạo thành nhờ tương tác tĩnh điện giữa các phân tử protein với nhau, kể cả sự có mặt tương tác hấp dẫn Van de Waals, làm giảm hằng số điện môi giữa chúng. Tủa protein-enzyme bằng các polymer trung tính Các polymer trung tính tạo tương tác giữa các protein với nhau, nhờ ưu thế loại bỏ bọc nước, dẫn đến tạo tủa protein và tách phase. Khác với dung môi hữu cơ, các polymer trung tính như polyethylene glycol (PEG), không gây biến tính protein, nên có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng. Ngoài 3 phương pháp tạo tủa phân đoạn protein kể trên, một số phương pháp tạo tủa khác cũng được sử dụng. Đó là tạo tủa phân đoạn protein bằng cách gây biến tính bởi nhiệt độ, độ pH, dung môi hữu cơ, tạo tủa loại protein gây nhiễm. Để tăng tủa đặc hiệu, người ta bổ sung các tay nối (ligand) đặc hiệu vào các polymer tạo “tủa ái lực protein” cho phép làm sạch đáng kể protein-enzyme dịch. 3.5.5. Tủa enzyme bằng điểm đẳng điện Dựa trên tính chất protein có độ hoà tan thấp ở điểm đẳng điện. Ở điểm đẳng điện độ hydrate-hoá của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tử protein, dẫn đến tạo tủa. Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có khoảng giá trị pH đẳng điện giới hạn. Phương pháp này cho hiệu quả không cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ. 3.6. Cố định enzyme cellulase trên chất mang Natriaginatel Tạo dung dịch Natrialginate 3%: Cân 0.75g Natrialginate hòa tan trong 25 ml dung dịch đệm acetate pH 5. Khuấy đến khi tất cả Natrialginate hòa tan hoàn toàn là được. Tiến hành cố định: Cân 0.5g ezyme cellulase hòa tan trong dung dịch Natrialginate 3%. Dùng ống xilanh có đầu kim tiêm, hút dung dịch enzyme hòa tan này nhỏ từ độ cao 20cm vào trong 100ml dung dịch 0.2m CaCl2 để tạo gel. Qúa trình tạo gel xảy ra trong 2 giờ, ở nhiệt độ phòng. Sau cố định, dùng giấy lọc, lọc enzyme đã được cố định. Kết quả thu được hạt gel enzyme cellulase đã được nhốt trong khuôn gel. Dịch lọc thu được đem đi xác định hàm lượng theo phương pháp Bradford và xác định hoạt tíh theo phương pháp của công ty Shin Nihon Chemical Co, Ltd. Cách tính: HL Protein cố định (mg) = HL Protein trước cố định – HL Protein còn lại Hiệu suất gắn Protein được tính theo công thức sau: HS cố định Protein = HL Protein cố định/HL Protein trước cố định x 100 Hiệu suất hoạt tính enzyme cellulase cố định so với hoạt tính enzyme cellulase ban đầu: ∑ ĐVHT E cellulase cố định HS hoạt tính enzyme cố định (%) = X 100 ∑ ĐVHT E cellulase trước cố định Trong đó: ∑ ĐVHT E cellulase cố định: Số đơn vị hoạt tính enzyme cellulase cố định (UI/g). ∑ ĐVHT E cellulase trước cố định: Số đơn vị hoạt tính enzyme cellulase trước cố định (UI/g). Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cellulase cố định trên Natrialginate Sau khi hạt gel đã được cố định ta bọc bằng giấy lọc, thu dịch nước tiến hành khảo sát hoạt tính và hàm lượng lần 1 và rửa lại bằng CaCl2, tiếp tục khảo sát hoạt tính và hàm lượng lần 2 cứ như thế ta khảo sát được lần 3, lần 4,…. Vẽ đồ thị số lần tái sử dụng giảm 50% so với enzyme ban đầu. . Tinh sạch enzyme 3.7.1. Chuẩn bị hóa chất và dụng cụ 3.7.1.1. Dụng cụ và thiết bị Phễu đổ gel Bình hút chân không Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1,5 cm, thể tích 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3,14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3,14 . Bình đựng dung dịch đệm Ống nghiệm: 20 cái Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch. 3.7.1.2. Hóa chất Gel “Sephadex G-100”, có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm, khả năng ngậm nước: 12ml/1 g gel khô, phạm vi phân tách: 5.000-100.000 Daltons. Đệm Acetate 50 Nm, pH 5.0: khử bọt khí trước khi dùng 3.7.1.3. Tinh sạch enzyme Dịch enzyme sau khi được ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, được đưa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7.5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn. Dịch enzyme thô Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn những phân đoạn có hoạt tính endo- β -1,4-glucanase cao được đưa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thước 2,6 x 60 cm được cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, thôi mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là 3320 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme được xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình tinh sạch endoglucanase có thể được tóm tắt như sơ đồ: Ly tâm 10000 vòng/10 phút ↓ Dịch trong ↓ Cột S