Khóa luận Khảo sát sinh trưởng một chủng nấm Vân chi đen (Trametes versicolor) có nguồn gốc từ Trung Quốc

bạch cầu đơn nhân to, đại thực bào và tế bào lympho B, lympho T. Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng β-1,3-glucan là chất kích hoạt hệ miễn dịch chống ung thư tự nhiên ở người và phần glucan có thể kích ứng sự co lại của khối u (Luzio et al, 1980; Mansell et al, 1975; Morikawa et al, 1985). Theo các nhà khoa học thì chỉ có polysaccharide nối với peptide mới tạo ra hiệu quả kháng ung thư. Các thành phần này không bị ảnh hưởng bởi quá trình tiêu hoá nên có hiệu quả khi uống. 9 Thành phần các yếu tố có trong dịch trích [25] Carbon : 40,5% Hydrogen : 60,2% Nitrogen : 5,2% Oxygen : 47,5% 9 Thành phần hoá học dịch trích [25] Hydrate carbon: 42 – 43 % (91 – 93 % chuỗi beta-glucan chứa các polymer có glucose) Protein : 28 – 35 % Ẩm độ : 7 – 7,6 % Khoáng : 6 – 7 % Phần còn lại là đường tự do và aminoacid 2.4.1. PSK (polysaccharide - Kureha) 2.4.1.1. Cấu tạo [27] PSK được ly trích từ chủng vân chi CM-101 bằng nước và bằng phương pháp muối hoá. Trong thành phần cấu tạo gồm 62% polysaccharide và 38% protein. Thành phần glucan gồm có một chuỗi chính β1-4 và các chuỗi phụ β1-3, β1-6 liên kết nhau bằng các nối O-glycosidic hay N- glycosidic. Phần peptide rất giàu các acid amin như aspartic, glutamic và một số acid amin acid khác. PSK có trọng lượng phân tử khoảng 94 – 100 kDa. Phần polysaccharide gồm các monosaccharide: glucose, galactose, mannose, xylose, fucose. Các nghiên cứu với PSK được đánh dấu phóng xạ C14 đã xác nhận rằng phổ nguyên tử của nó được hấp thụ trong 24h sau khi đưa vào cơ thể 20 chuột. PSK không độc, liều LD50 thấp và không xuất hiện các dị hình trong các thử nghiệm độc tính cấp và bán cấp. 2.4.1.2. Dược tính [20], [24], [27], [32], [33] Năm 1971, hơn 200 dược chất hoá lý có khả năng kháng khối u được chọn lọc bởi các nhà nghiên cứu Nhật, PSK là liệu pháp chữa trị tốt nhất vì nó bảo vệ hệ miễn dịch bằng cách trung hoà các thuốc hoá trị và các quá trình gây độc của tế bào ung thư. PSK có khả năng tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch. Khi PSK được dùng kết hợp với phương pháp xạ trị thí nghiệm trên chuột, người ta quan sát thấy có sự hồi phục hệ miễn dịch thể dịch đã suy yếu. Các nghiên cứu trên động vật xác nhận thêm rằng PSK cảm ứng tế bào T diệt và phục hồi lại các thông số miễn dịch bị suy yếu trong khi đó sẽ ức chế các hợp chất gây ức chế miễn dịch. PSK ngăn chặn các phản ứng phụ khi dùng kết hợp với các tác nhân hoá trị như 5-FU (5-fluorouracil), doxorubicin, cyclophosphamide (CPA), tegafur, cis-Blastin và mitomycin-C (MMC) để chữa trị ung thư, gia tăng khả năng sống còn của các bệnh nhân ung thư dạ dày ở các giai đoạn III và IV (Kaibara et al, 1970). PSK kích ứng sự biểu hiện cytokine trong các tế bào máu đơn nhân vùng ngoại vi in vitro. Sự biểu hiện gen TNF-α (yếu tố gây hoại tử khối u) và interleukin-8 (IL-8) được cảm ứng mạnh ở những người tình nguyện khoẻ mạnh và những bệnh nhân ung thư dạ dày khi dùng PSK, mặc dù đáp ứng của mỗi người mỗi khác. Có tác dụng ngăn chặn sự phát triển khối u in vitro. PSK gia tăng khả năng sống còn, ức chế sự hình thành và di căn của các tác nhân gây ung thư hoặc các khối u tạo ra do phóng xạ. PSK cũng ức chế sự phát triển trở lại sau hậu phẫu hoặc sự di căn các tế bào khối u ở các mẫu động vật thí nghiệm, cơ chế có lẽ là ngăn chặn sự di chuyển, sự xâm nhập, sự gắn kết với các tế bào màng trong và sự phát triển. Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tác động hỗ trợ hiệu quả giữa PSK và liệu pháp sinh học gồm vaccin L1210 gắn với concanavalin A (lectin gây phân bào) và kháng thể đơn dòng chống lại các tế bào ung thư ruột kết. Thí nghiệm của Pang ZJ và CS đã chứng minh PSK cải thiện hoạt tính enzyme glutathione peroxidase thông qua sự cảm ứng dịch mã sự biểu hiện của mRNA. 21 PSK biểu hiện hoạt tính kháng virus và có thể có hiệu quả kháng sự nhiễm HIV bằng cách biến đổi receptor virus hoặc bằng cách ngăn chặn nó kết hợp với tế bào bạch huyết. Một cơ chế khác giải thích tính kháng virus của PSK là nó kích thích sự sản xuất interferon, IL-1 ở tế bào người. PSK cũng có tính kháng sinh mạnh, hiệu quả trên Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Cryptococcus neoformans, Psedomonas aeruginosa, Candida albicans và vài loại vi trùng khác gây bệnh ở người. 2.4.2. PSP (polysaccharide-peptide) 2.4.2.1. Cấu tạo [27] PSP được ly trích từ hệ sợi nấm vân chi chủng COV-1. Trong thành phần cấu tạo có khoảng 90% polysaccharide và 10% peptide. Thành phần chuỗi polypeptide có trong PSP tương tự như trong chuỗi proteoglycan PSK, rất giàu aspartic acid và glutamic acid. Tuy nhiên PSP khác PSK về thành phần các đường đơn trong chuỗi polysaccharide, PSP thiếu fucose nhưng lại có arabinose và rhamnose. Chuỗi polysaccharide là các β-glucan thật sự: phương pháp sắc kí khí và khối phổ đã chứng minh liên kết chính trong chuỗi là 1-4, 1-2, và 1-3 glucose cùng với một lượng nhỏ các liên kết 1-3, 1-4 và 1-6 galactose; 1-3 và 1-6 mannose; 1-3, 1-4 arabinose, trong đó cũng thấy xuất hiện vài liên kết α. Trọng lượng phân tử của PSP khoảng 100 kDa. 2.4.2.2. Dược tính [22], [28], [29] Các nghiên cứu về dược lý đã chứng minh rằng PSP ảnh hưởng mạnh mẽ đến sức khỏe và năng lượng, được xem là loại chất cảm ứng điều hoà sinh học mới. PSP không gây hại đối với các tế bào bình thường. PSP có khả năng phân biệt giữa tế bào thường và tế bào ung thư. Có thể tiêu diệt tế bào ung thư mà không gây bất cứ sự thay đổi hay tạo độc tố trên tế bào (Mei-po Yang, Hongkong university). Tỉ lệ phần trăm bệnh nhân trải qua thử nghiệm hiệu quả của PSP trong các giai đoạn II và III cho thấy tỉ lệ sống còn gia tăng đáng kể so với nhóm đối chứng: 90 – 97 % đối với ung thư dạ dày, 82 – 87 % đối với ung thư thực quản, 70 – 86 % đối với ung thư phổi. PSP là chất đầy tiềm năng và hiệu quả trong điều trị ung thư. 22 9 PSP gia tăng chức năng miễn dịch của cơ thể bình thường. Tăng sự biểu hiện của gen Interleukin-6 (IL-6) trong các tế bào lympho máu ngoại vi (PBL) ở người và do đó sản xuất ra IL-6 và cũng hoạt hoá tế bào bạch cầu để gia tăng quá trình sản xuất interferon α và γ lên gấp 2 – 4 lần. Gia tăng mạnh mẽ chỉ số thực bào, trị số HC50, kháng thể ở chuột, tăng PBL từ phase G1 đến phase S, thúc đẩy sự phát sinh PBL. Thúc đẩy sự phát sinh tế bào lympho T và tế bào tiền tế bào T ở tuyến ức và lách, tăng cường hoạt tính tế bào lympho B. 9 PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do khối u gây ra ở động vật. Làm ngưng quá trình tiêu biến của tuyến ức ở chuột mang bệnh Sarcoma. Trung hoà sự trương phồng của gan khi mắc bệnh ung thư cổ trướng Ehrlich. Chống lại quá trình ức chế kháng thể của tế bào ung thư Sarcoma ở chuột. Tăng giá trị bổ thể huyết thanh C3 trong chuột mắc bệnh Sarcoma. 9 PSP trung hoà quá trình ức chế miễn dịch do tác dụng của các hoá dược trong điều trị ung thư. Ức chế quá trình tiêu biến tế bào bạch cầu do cyclophosphamine (CPA) gây ra và rút ngắn thời gian phục hồi tế bào bạch cầu. Chống lại quá trình ức chế của CPA trên IL-2 và tế bào T tự sát thương. Phục hồi lại phản ứng mẫn cảm loại chậm bị ức chế bởi CPA. Dùng kết hợp với các phương pháp hoá trị và xạ trị sẽ làm giảm các tác dụng phụ của hoá dược và có hiệu quả cao hơn. 9 PSP ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở người và động vật thí nghiệm PSP (50 mg/kg, ip hoặc po) có thể ức chế sự phát triển của Sarcoma 180 ở chuột. PSP (100 µg/ml) có thể ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid của tế bào ung thư cổ trướng Ehrlich. Ức chế sự phát triển tế bào ung thư bạch cầu P388, tế bào u tủy, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư phổi Lewis ở chuột. Nó có thể ức chế sự phát triển của tế bào ung thư dạ dày, ung thư tuyến phổi ở người, ung thư tế bào bạch cầu đơn nhân to, ung thư mô bạch huyết ở da. Nó cũng gây ra sự tiêu biến tế bào ung thư và sự tích tụ NST mà không tạo ra bất kỳ độc tố nào trên tế bào fibroblast hay tế bào chủ (Liang-Zhong Xu, Bao-zhen Zhong, 2003). 23 Huyết thanh bạch cầu (ALS) có thể được trung hoà. Hoạt tính kháng khối u của PSP có liên quan với sự gia tăng tế bào lympho T. Tăng sự sản xuất các hợp chất nitơ trung gian, anion superoxide và yếu tố gây hoại tử ung thư. 9 Một số hiệu quả khác của PSP. Cải thiện sự thèm ăn của chuột khi dùng kết hợp với CPA. Giảm phản ứng đau của động vật khi chịu các tác nhân kích thích như điện, acid acetic, nước nóng. Ức chế hệ thần kinh trung ương và giảm hoạt tính tự phát của chuột. Tăng khả năng chịu đựng trong điều kiện thiếu oxy đối với chuột thí nghiệm. Biểu hiện khả năng ức chế sự tương tác giữa HIV-1 gp120 và làm bất động thụ thể CD4 (IC50=6,25µg/ml), ức chế enzyme glycohydralase gắn với sự glycosic virus và làm giảm độc tố tế bào. Do đó hướng sắp tới PSP sẽ được nghiên cứu để tạo thành tác nhân kháng virus in vivo. Ngoài ra, PSP còn được ứng dụng trong chữa trị các bệnh viêm nhiễm virus và bệnh gan. 2.4.3. So sánh giữa PSK và PSP [28] PSP và PSK là chuỗi proteoglycan, có trọng lượng phân tử khoảng 100 kDa, thành phần polysaccharide đều không có N-acetylamino-hexose trong khi tất cả chuỗi polysaccharide khác có. PSP và PSK đều được xem là những chất gây biến đổi các đáp ứng sinh học có khả năng trị ung thư và làm tăng miễn dịch, nhưng những nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàn cho thấy PSP và PSK có một số khác biệt. Bảng 2.2: So sánh giữa PSK và PSP Đặc điểm so sánh Giống nhau Khác nhau Chủng loại Vân chi Trametes versicolor PSP: chủng COV-1 từ Trung Quốc. PSK: CM-101 từ Nhật. Dạng dược phẩm PSP: dạng viên PSK: dạng gói Màu bột Nâu PSP: nâu PSK: nâu đậm Dạng nguyên liệu thô Hệ sợi 24 Kỹ thuật lên men Nguồn carbon chính là glucose lên men ở 25oC, 3 ngày hoặc 26oC, pH = 5 – 7. PSP: nguồn nitơ từ bột đậu nành PSK: nguồn nitơ từ pepton và cao nấm men. Thời gian lên men của PSP (64 giờ) nhanh gấp 3 lần PSK. Phương pháp chiết Chiết bằng nước nóng. PSP: tủa bằng cồn. PSK: sử dụng phương pháp muối hoá với (NH4)2SO4 để tủa. Phần đường Galactose, glucose, mannose, xylose PSP: arabinose, rhmanose PSK: fucose - Ngăn chặn sự tổng hợp acid nucleic của tế bào Ehrlich ascitic và sự phát triển của tế bào ung thư Sarcoma-180, bạch cầu P388… PSP: tỉ lệ ngăn chặn trên P388 là 90 – 96 % (1mg/kg). PSK: có tỉ lệ là 61 – 90 % (1mg/kg) PSP: tỉ lệ ức chế sự tổng hợp RNA, DNA của tế bào Ehrlich là 47%, 65%. PSK: 39%, 34%. - Phục hồi lại phản ứng mẫn cảm bị ức chế bởi các dược chất hoá học và bảo tồn lượng bạch cầu. Mức ngăn chặn của PSP, đối với bệ Sarcoma trên chuột là 43%, PSK 28%. Dược tính Gia tăng hoạt tính đại thực bào, hàm lượng globulin miễn dịch, bổ thể C3, kháng thể HC50, và IL-2 tế bào lympho-T PSP có thể làm tăng hàm lượng α- và β-ITF tạo bởi tế bào bạch cầu gấp 2 – 4 lần. Độc tính LD50>20g/kd, không đôc, không làm xuất hiện các dị hình, không ảnh hưởng đến sinh sản. PSP có thể tạo ra phản ứng độc bằng cách tập hợp nhiễm sắc thể của các tế bào ung thư phổi nhưng không độc trên chuột bình thường. Tác dụng trị liệu Làm giảm độc và phản ứng phụ của hoá trị và xạ trị, tăng chức năng miễn dịch, tăng hiệu quả chữa trị, kéo dài tuổi thọ và tăng chất lượng cuộc sống. PSP làm tăng sự thèm ăn, làm giảm đau. 25 2.5. Phương pháp chiết xuất hợp chất thô từ nấm (Phương pháp trích ly) [5] 2.5.1. Khái niệm Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất. Tùy theo cơ chế và đặc điểm, quá trình chiết được phân ra: 9 Chiết lỏng - lỏng với cơ chế chính là quá trình phân bố của chất tan trong hai chất lỏng không đồng tan với nhau theo định luật phân bố. 9 Chiết rắn - lỏng với cơ sở chính là sự hoà tan của chất tan vào dung môi. 2.5.2. Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 2.5.2.1. Quá trình hoà tan Sự hoà tan là một quá trình vật lý trong đó chất tan được solvat hoá và kéo vào dung môi. Sự hòa tan này không có chọn lọc, tất cả những chất tan được trong dung môi đều có mặt trong dịch chiết. Quá trình hoà tan nhanh hay chậm phụ thuộc vào khả năng hòa tan của chất tan trong dung môi, diện tích bề mặt tiếp xúc của chất tan với dung môi, nhiệt độ và sự khuếch tán của chất tan trong dung môi. Nồng độ dung dịch phụ thuộc vào bản chất của dung môi và của chất tan, số lượng của dung môi và của chất tan. 2.5.2.2. Quá trình khuếch tán Quá trình khuếch tán xảy ra nhằm làm triệt tiêu sự chênh lệch nồng độ giữa dung dịch ở những nơi dung môi tiếp xúc với chất tan và dung dịch ở những nơi dung môi không hoặc ít tiếp xúc với chất tan. Sự khuếch tán thúc đẩy quá trình hoà tan và kéo chất tan từ các tế bào vỡ ra khỏi tế bào đi vào dịch chiết. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán: 9 Sự chêch lệch nồng độ 9 Nhiệt độ 9 Độ nhớt của dung môi 2.5.2.3. Quá trình thẩm tích Việc di chuyển chất tan phân tử nhỏ qua các kênh bào tương (Plasmodesmata, ống trao đổi) trong quá trình chiết xuất được thực hiện bởi sự khuếch tán thụ động theo 26 gradient nồng độ. Sự thẩm tích làm cho quá trình hòa tan chiết xuất có tính chọn lọc hơn. Các yếu tố ảnh hưởng: Cấu trúc vách tế bào, kích thước chất tan, nhiệt độ. 2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất 2.5.3.1. Nguyên liệu Bản chất của nguyên liệu: bề dày của vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu tố quan trọng nhất. Mức độ chia nhỏ của nguyên liệu: Nguyên liệu càng được chia nhỏ, quá trình chiết càng nhanh. Tuy nhiên cách chia nhỏ phải phù hợp với từng loại nguyên liệu và dung môi. Chất tan: Độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tế bào càng lớn. 2.5.3.2. Dung môi Khả năng hoà tan của dung môi: Khả năng hoà tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hoà tan càng nhanh làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Dung môi phân cực hoà tan các chất phân cực, dung môi kém phân cực hoà tan các chất kém phân cực. Độ nhớt của dung môi: Độ nhớt càng thấp, quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Sự thấm dung môi qua vách tế bào: Nguyên liệu còn tươi, còn nhiều nước làm chậm quá trình chiết đối với các dung môi kém phân cực. 2.5.3.3. Kỹ thuật chiết Tốc độ của quá trình chiết phụ thuộc các yếu tố: 9 Sự khuấy trộn: Làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. 9 Nhiệt độ, áp suất: Tăng nhiệt độ, tăng áp suất làm tăng tốc dộ chiết. 9 Chất trợ tan: Các chất diện hoạt có tác dụng đẩy nhanh quá trình chiết. 9 Siêu âm và vi sóng: Làm tăng chuyển động nhiệt của các phân tử chất tan và dung môi, tăng sự hoà tan và quá trình khuếch tán. 27 2.5.4. Các phương pháp chiết 2.5.4.1. Chiết các nguyên liệu tươi Nguyên liệu được cắt nhỏ, ngâm ngập trong dung môi và được xay nhỏ bằng một cánh khuấy quay với tốc độ rất cao (khoảng 10 000 vòng/phút) trong một thời gian ngắn (5 – 10 phút). Quá trình chiết này được thực hiện trong máy khuấy có tốc độ cao nên được gọi là turbo-extraction. 2.5.4.2. Phương pháp ngâm Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng nguyên liệu trong những dụng cụ thích hợp. 9 Phương pháp ngâm lạnh: Nguyên liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm thường không dưới 12 giờ để đảm bảo quá trình chiết được căn bản hoàn tất. 9 Phương pháp ngâm nóng: Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. 9 Chiết bằng Soxhlet và Kumagawa: Là phương pháp ngâm nóng nhiều lần lần với một lượng nhỏ dung môi. Kumagawa cho phép chiết ở nhiệt độ gần với nhiệt độ sôi của dung môi còn Soxhlet gần với phương pháp ngâm lạnh hơn. 9 Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi: Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi. Ưu điểm của phương pháp là quá trình chiết xảy ra nhanh; khuyến điểm là cần phải có dụng cụ, thiết bị thích hợp. 2.5.4.3. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt Là phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi được đi qua nguyên liệu theo một hướng nhất định, với một tốc độ nhất định. Quá trình hoà tan xảy ra trong phương pháp ngấm kiệt không giống nhau trong toàn bộ khối nguyên liệu mà theo gradient nồng độ, dung môi /dịch chiết đi từ nơi nguyên liệu có lượng hoạt chất thấp tới nơi có lượng hoạt chất cao hơn. Quá trình ngấm kiệt được tiến hành dưới nhiệt độ thường hay ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Bình 28 chiết được thiết kế với bộ phận gia nhiệt và bảo ôn, dung môi được đưa vào bình ở nhiệt độ cao. 29 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. 3.1.2. Địa điểm Trung tâm nghiên cứu Linh chi và Nấm dược liệu – Công ty cổ phần dược liệu TW2 thành phố Hồ Chí Minh. Phòng vi sinh - Bộ môn Công Nghệ sinh Học - Trường đại học Nông Lâm TpHCM. 3.2. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hoá chất 3.2.1. Nguyên liệu Nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc do Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu thuộc Công ty cổ phần Dược Liệu TW2 TpHCM cung cấp. 3.2.2. Hoá chất, môi trường sử dụng 3.2.2.1.Hoá chất: Cồn 96oC, Vôi bột, Urea, DAP (diamon phosphat), SA (sulphat amon), Nitrate canxi, supe lân, NPK 20-20-15, Dynamic lifter. 3.2.2.2. Các môi trường sử dụng a. Môi trường PSA (Potato saccharose agar) [2] Khoai tây : 200g Saccharose : 20g Agar : 20g Nước cất cho đủ : 1000ml 30 b. Môi trường bán tổng hợp - BTH (Khoai tây - muối khoáng) [2] Khoai tây : 200g Saccharose : 20g KH2PO4 : 3g MgSO4 : 1,5g Agar : 20g Nước cất vừa đủ : 1000ml c. Môi trường Crapek [2] Saccharose : 30g NaNO3 : 3g KH2PO4 : 1g MgSO4 : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4 : 0,01g Agar : 20g Nước cất vừa đủ : 1000ml d. Môi trường dinh dưỡng bổ sung Nước chiết giá: 100g giá đậu + nước  xay nhuyễn  lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết giá. Nước chiết bắp: 100g bắp xay + nước  nấu chín  lọc bỏ bã và bổ sung nước cho đủ để tạo 1 lít dung dịch nước chiết bắp. Nước chiết khoai tây: khoai tây (200g) gọt vỏ, rủa sạch, cắt sợi, nấu và lọc lấy nước chiết + nước cất để tạo dung dịch nước khoai tây 1 lít. e. Môi trường nhân giống cấp hai Môi trường hạt: Chọn loại lúa gạo tốt, ngâm nước 24 giờ, nấu vừa nứt vỏ trấu, vớt ra để ráo, bổ sung lớp cám bắp 5%. Phân lúa vào các chai thuỷ tinh không quá 2/3 thể tích. Hấp khử trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC trong 2 giờ. Để nguội 24 giờ cấy giống gốc từ môi trường thạch, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng (30 ± 2oC) để tạo giống trung gian. Môi trường bắp xay: Bắp xay nấu cho nở và bổ sung các thành phần dinh dưỡng. 31 Môi trường mùn cưa: Mùn cưa cao su khô còn tốt trộn với vôi bột 1%, bổ sung nước, ủ qua đêm và tạo độ ẩm môi trường khoảng 60%. Bảng 3.1: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong mùn cưa (%)[11] Cơ chất Nguyên tố Mùn cưa gỗ cao su Mùn cưa gỗ lim Mùn cưa gỗ tạp N 1,68 ± 0,20 1,02 ± 0,20 1,27 ± 0,20 P 0,48 ± 0,04 0,37 ± 0,03 0,43 ± 0,06 K 1,18 ± 0,05 0,73 ± 0,04 0,77 ± 0,05 Ca 0,12 ± 0,03 0,15 ± 0,05 0,23 ± 0,06 Mg 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 Bảng 3.2: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong các loại bột (%) [11] Bột Nguyên tố Cám gạo Cám bắp Bột bã đậu phộng N 3,64 ± 0,70 3,08 ± 0,46 8,86 ± 0,54 P 1,37 ± 0,31 1,92 ± 0,22 0,88 ± 0,41 K 0,65 ± 0,16 0,24 ± 0,14 0,72 ± 0,18 Bảng 3.3: Hàm lượng khoáng trong nước dừa (Vanderberlt, 1954) Nguyên tố Hàm lượng (µg/100ml) Nguyên tố Hàm lượng (µg/100ml) K 3,12 Fe 0,01 Ca 1,50 Cu 0,04 Na 2,09 S 3,40 Mg 3,00 P 3,70 3.2.3. Dụng cụ, thiết bị Các dụng cụ, thiết bị cần sử dụng: đĩa petri, bình tam giác, chai thuỷ tinh, giấy lọc, máy đo pH, tủ ủ, cân điện tử, tủ sấy, nồi hấp autoclave, tủ cấy. 32 3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 3.3.1. Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi 3.3.1.1 Hình thái cấu tạo quả thể Quan sát hình dạng quả thể, cấu tạo quả thể hoàn chỉnh, thân nấm và lớp bào tầng, cấu trúc cắt ngang quả thể, chụp hình. Quan sát hệ sợi trên quả thể dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. 3.3.1.2. Hệ sợi tơ thứ cấp Lấy mẫu hệ sợi lan trên môi trường thạch cho lên mặt lame, không nhuộm màu mẫu, dùng lamelle đè nhẹ, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40, quan sát hình dạng hệ sợi, vách ngăn ngang, mấu liên kết và sau đó chụp hình. 3.3.1.3. Đảm và đảm bào tử Lấy cốc thuỷ tinh có đựng nước (không đầy đến miệng cốc), đặt quả thể nấm lên trên (quả thể nấm phải lớn hơn đường kính cốc) hướng lớp bào tầng về phía miệng cốc, để nơi kín gió. Sau 1 – 2 ngày, lấy bào tử có trong cốc, quan sát dưới kính hiển vi vật kính X40 và chụp hình. 3.3.2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 3.3.2.1. Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau Thí nghiệm được tiến hành trên 5 môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau. 9 Môi trường 1: PGA 9 Môi trường 2: Bán tổng hợp (Khoai tây - muối khoáng) 9 Môi trường 3: Crapek 9 Môi trường 4: PGA + 10% nước dừa 9 Môi trường 5: PGA + 10% nước chiết giá Tất cả các môi trường đều được hấp khử trùng 121oC/ 30phút, để nguội 50 – 55oC và đổ vào đĩa petri vô trùng. Mỗi môi trường đổ 10 đĩa. Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa 1 hạt lúa từ môi trường nhân giống cấp hai (môi trường hạt). Tiến hành ủ ở nhiệt độ 33 phòng (30 ± 2oC). Ba ngày sau khi cấy, bắt đầu tiến hành đo đường kính hệ sợi lan theo thời gian. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Môi trường sử dụng là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng). Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút sau đó đổ vào đĩa petri vô trùng (mỗi môi trường đổ 10 đĩa). Sau 24h, cấy vào mỗi đĩa một hạt lúa từ môi trường hạt. Tiến hành ủ ở hai mức nhiệt độ 27 ± 2oC và nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Sau 3 ngày tiến hành thu thập số liệu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH Môi trường dùng làm thí nghiệm là môi trường bán tổng hợp – BTH (khoai tây - muối khoáng), điều chỉnh về các pH khác nhau: 5; 5,5; 6; 6,5; 7. Điều chỉnh pH acid dùng dung dịch HCl 1M và pH kiềm dùng NaOH 1M. Khử trùng môi trường 121oC/ 30 phút, mỗi thí nghiệm đổ 10 đĩa, sau 24h cấy giống. Ủ nhiệt độ phòng (30 ± 2oC). Bắt đầu đo và thu thập số liệu sau 3 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai Thí nghiệm được tiến hành trên các môi trường có bổ sung thành phần dinh dường khác nhau để tìm môi trường nhân giống cấp hai tối ưu. 9 MT 1: Lúa 90% Mùn cưa 5% Cám gạo 5% 9 MT 2: Lúa 90% Mùn cưa 5% Cám bắp 5% 9 MT 3: Lúa 80% Mùn cưa 5% Bắp xay 15% 9 MT 4: Bắp xay 50% Cám gạo 25% Mùn cưa 25% 34 9 MT 5: Bắp xay 50% Mùn cưa 25% Đậu xanh 25% 9 MT 6: Bắp xay 50% Mùn cưa 50% 9 MT 7: Mùn cưa 50% Cám gạo 50% (NH4)2SO4 0,2% 9 MT 8: Mùn cưa 50% Cám gạo 50% Urea 0,1% 9 MT 9: Mùn cưa 50% Cám bắp 50% Tất cả các môi trường đều được bổ sung nước để tạo ẩm độ (khoảng 60%) cho hệ sợi nấm phát triển. Mỗi môi trường phân vào 10 ống nghiệm, hấp khử trùng bằng hơi nước nóng 121oC/2 giờ. Sau 24 giờ cấy giống từ môi trưòng hạt, ủ ở nhiệt độ phòng (khoảng 30 ± 2oC). Tiến hành đo và thu thập số liệu sau 4, 6, 8, 10 và 12 ngày. Thí nghiệm được bố trí 3 lần lặp lại. Các chỉ tiêu theo dõi, quan sát. - Tốc độ tăng trưởng của hệ sợi qua các ngày 4, 6, 8, 10, 12 ngày sau khi cấy. - Màu sắc hệ sợi trên ống nghiệm. 3.3.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể Thử nghiệm khả năng cho quả thể trên các môi trường sau: 9 MT 1: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% 9 MT 2: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Urea 0,25% + DAP 0,25% 9 MT 3: Mùn cưa + cám gạo 5% + SA 0,5% + DAP 0,25% 9 MT 4: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Nitrate Canxi 0,5% + DAP 0,25% 9 MT 5: Mùn cưa + Cám gạo 5% + NPK 20-20-15 0,5% 9 MT 6: Mùn cưa + Cám gạo 10% 9 MT 7: Mùn cưa + Cám bắp 10% 9 MT 8: Mùn cưa + Cám gạo 5% + Supe lân 0,5% + Urea 0,25% 35 9 MT 9: Mùn cưa + Urea 0,25% + DAP 0,25% 9 MT 10: Mùn cưa + Cám 5% + Dynamic lifter 0,25% Môi trường mùn cưa sau khi trộn vôi 1%, ủ qua đêm, được bổ sung chất dinh dưỡng khác nhau và cho vào bịch polypropylen. Mỗi bịch nặng 600g và có ẩm độ 65%. Mỗi công thức cho vào 10 bịch, hấp khủ trùng bằng hơi nước nóng ở 121oC/2 giờ. Sau 24 giờ, để cho các bịch môi trường thật nguội và cấy giống từ môi trường lúa. Ủ ở nhiệt độ phòng, theo dõi thời gian xuất hiện hệ sợi nấm trên các bịch môi trường và thời gian xuất hiện tai nấm ở các nghiệm thức. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 3.3.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng Các môi trường thí nghiệm là môi trường