Khóa luận Khảo sát sinh trưởng nấm linh chi đen (Amauroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan - Việt Nam

chống khối u và tăng tính miễn dịch. Năm 1994, Byong Kak Kim tiến hành lai hệ sợi nấm bằng phương pháp dung hợp Protoplast giữa chủng G.lucidum với G.applanatum, thậm chí với cả nấm hương (Lentinus edodes), qua đó tăng cường hoạt tính chống khối u sarcom 180 của các phức polysaccharide – protein lên đáng kể. Lei L.S và Lin L.B (1993) đã chứng minh tác dụng tăng sinh tổng hợp IL – 2 (Interleukine-2) và hoạt tính ADN polymerase ở chuột già tuổi bởi polysaccharide, càng soi sáng thêm khả năng trẻ hóa, tăng tuổi thọ của các nấm Linh chi. Những nghiên cứu về polysaccharide không tan trong nước cũng chứng tỏ hiệu lực chống khối u rất rõ, thậm chí làm tan khối u với tỷ lệ ¾ ở các loài G.lucidum và G.applanatum (Takashi, 1985; Liu G.T, 1993). [10] Có lẽ đa dạng nhất và có tác dụng dược lý mạnh nhất là nhóm Saponine, triterpenoide và các acid ganoderic. Vai trò của các chất này chủ yếu là ức chế giải phóng histamine, ức chế Angiotensine Conversino emzyme (ACE), ức chế sinh tổng hợp Cholesterol và hạ huyết áp. [10,11, 22] 2.5. Khả năng chữa bệnh của nấm linh chi Linh chi được dùng như một thượng dược khoảng từ 4000 năm nay ở Trung Quốc và người ta chưa thấy tác dụng xấu hay độc tính của Linh chi. Đa số các loài Linh chi điều có vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim, chữa trị tức ngực, bổ gan khí, an thần,…[10, 11, 14] Theo cách diễn đạt truyền thống của người phương Đông, các tác dụng lớn của nấm Linh chi như sau:[3, 4, 14] - Kiện não (làm sáng suốt, minh mẫn) - Bảo can (bảo vệ gan) - Cường tâm (thêm sức cho tim) - Kiện vị (củng cố dạ dày và hệ tiêu hoá) - Cường phế (thêm sức cho phổi, hệ hô hấp) - Giải độc (giải tỏa trạng thái dị cảm) - Trường sinh (tăng tuổi thọ) 18 Bảng 2.6: Lục bảo Linh chi và tác dụng trị liệu (Lý Thời Trân, 1590) Tên gọi Màu sắc Đặc tính dược lý Thanh chi Xanh Vị chua, tính bình, không độc chủ trị sáng mắt, bồ gan khí an thần, tăng trí nhớ. Hồng chi Đỏ Vị đắng, tính bình, không độc, tăng trí nhớ, dưỡng tim, bổ trung, chữa trị tức ngực. Hoàng chi Vàng Vị ngọt, tính bình, không độc, an thần ích tì khí. Bạch chi Trắng Vị cay, tính bình, không độc, ích phổi, thông mũi, an thần, chữa ho nghịch. Hắc chi Đen Vị mặn, tính bình, không độc, trị chứng bí tiểu Qua phân tích các hoạt chất về mặt dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta thấy Linh chi có tác dụng với một số bệnh: Đối với các bệnh tim mạch: Hàng loạt các hoạt chất của Linh chi được chứng tỏ có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cholesterol, kìm hãm quá trình kết tụ tiểu cầu. Các nghiên cứu này được cũng cố để có kết quả trị liệu cho các bệnh nhân cao huyết áp, nhiễm mỡ xơ mạch, bệnh mạch vành tim,....Hầu hết các bệnh nhân có chuyển biến tốt sau một vài tuần, huyết áp ổn định dần, không xảy ra các tác dụng phụ như các loại thuốc tân dược (Bùi Chí Hiếu, 1993; Wang Chi, 1994). Nhiều nghiên cứu đã phát hiện ra vai trò của các nguyên tố khoáng vết hiếm. Vanadium (V) có tác dụng chống tích đọng cholesterol trên thành mạch. Germanium giúp lưu thông khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mô. Hiện nay, chỉ số Ge trong các dược phẩm Linh chi được xem như là một chỉ tiêu quan trọng, có giá trị trong điều trị tim mạch và giảm đau trong trị liệu ung thư.[10, 11] Hiệu quả chống ung thƣ: Bằng việc kết hợp các phương pháp xạ trị, hoá trị, giải phẫu với trị liệu nấm trên các bệnh nhân ung thư phổi, ung thư vú và ung thư dạ dày có thể kéo dài thời gian sống trên 5 năm cao hơn nhóm không dùng nấm. Nhiều thông tin ở Đài Loan cho biết nếu dùng nấm Linh chi trồng trên gỗ long não điều trị cho các bệnh nhân ung thư cổ tử cung đạt kết quả tốt - khối u tiêu biến hoàn toàn [10]. Công trình của Zhibin Lin (1994) đã chỉ ra nguyên lý hiệu dụng là tăng khôi phục hệ miễn dịch, nhờ đó các phác đồ trị liệu: xạ trị, hóa trị, giải phẩu đạt kết quả cao hơn. 19 Đối với các bệnh về hô hấp: Nấm Linh chi đem lại kết quả tốt, nhất là những ca điều trị viêm phế quản dị ứng – hen phế quản tới 80%, có tác dụng làm giảm và nhẹ bệnh theo hướng khỏi hẳn.[3, 4] Khả năng kháng HIV: Để khảo sát khả năng kháng HIV của các hợp chất trong nấm Ganoderma lucidum, người ta đã sử dụng dịch chiết từ quả thể trong thử nghiệm kháng virút HIV – 1 trên các tế bào lympho T ở người. Sự nhân lên của virút được xác định qua hoạt động phiên mã ngược trên bề mặt các tế bào lympho T đã được gây nhiễm HIV – 1. Kết quả cho thấy có sự ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virút này (Gau J.P, 1990; Kim, 1996). Do đó, nhiều quốc gia đã đưa Linh chi vào phác đồ điều trị tạm thời, nhằm tăng cường khả năng miễn dịch và nâng đỡ thể trạng cho các bệnh nhân trong khi AZT, DDI, DDC, còn hiếm và rất đắt [10]. Các nghiên cứu tại Nhật Bản đã chứng minh các hoạt chất từ nấm Linh chi có tác dụng như sau:(Masao Hattori, 2001)  Ganoderiol F và ganodermanontirol có hoạt tính chống HIV – 1  Ganoderderic acid B và lucidumol B có tác động ức chế hữu hiệu protease HIV – 1  Ganodermanondiol và lucidumol A ức chế phát triển tế bào Meth – A (mouse sarcoma) và LLC (mouse lung carcinoma). Ngoài ra các ganoderma alcohol là lanostane triterpene với nhóm hydroxol (- OH) ở vị trí C25 có khả năng chống HIV – 1, Meth – A và LLC ở chuột.[10, 27] Khả năng antioxydant: Nhiều thực nghiệm chỉ ra vai trò của các saponine và triterpenoid, mà trong đó Ganoderic acid được coi là hiệu quả nhất (Wang C.H, 1985). Những nghiên cứu gần đây đang đẩy mạnh theo hướng làm giàu Selenium - một yếu tố khoáng có hoạt tính antioxydant rất mạnh – vào nấm Linh chi. Chính vì vậy con người có thể chờ đợi vào một dược phẩm tăng tuổi thọ, trẻ hoá từ nấm Linh chi nói chung và Linh chi Việt Nam nói riêng.[10] Các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trình lão hóa cơ thể hay sau khi bị nhiễm xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ nào cho cơ thể. Ngoài ra nấm Linh chi còn có tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khí chữa trị đau nhức khớp xương, gân cốt,…[11, 14] 20 Bảng 2.7: Một số bài thuốc chữa bệnh của nấm Linh chi [3] Tác dụng điều trị Pha chế Cách dùng Suy nhược thần kinh, nhức đầu chóng mặt, ngứa ban đêm Linh Chi 1 – 3 gam Sắc uống mỗi ngày 3 lần Viêm gan mãn tính, suyễn phế quản, viêm thận Linh Chi 50 gam Nghiền bột uống mỗi lần 1 – 1,5 gam, ngày uống 3 lần Bệnh tim dài Bột Linh Chi 30 gam, bột đậu 90 gam Nghiền bột 9 – 15 gam uống với nước sôi, ngày uống 3 lần Cao huyết áp, viêm gan mãn tính Linh Chi 10 gam Sắc uống mỗi ngày 3 lần Đau dạ dày Linh Chi 30 gam, rượu vang 250 gam Ngâm rượu 14 ngày, ngày uống 2 lần, mỗi lần 15 ml 2.6. Giới thiệu sơ lƣợc về hoạt chất sinh học có trong nấm Linh chi 2.6.1. Ganoderma polysaccharide (GLPs) [16, 17] Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi. Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị. Một trong 4 loại polysaccharide có đặc tính chống khối u mạnh nhất là beta – D glucan, trọng lượng phân tử 3,12 * 105 hoặc 1,56 * 106, có tác dụng chống ung thu và tăng tính miễn dịch cho cơ thể. Vai trò dược học của polysaccharide:  Kích thích hệ miễn dịch cơ thể  Gia tăng khả năng dung nạp oxygen 21  Giảm gốc tự do hydroxyl  Ức chế khối u phát triển  Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ  Tăng chức năng gan  Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường  Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein 2.6.2. Ganoderic Acid Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [21, 22] Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [5, 9] Bảng 2.8: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996) Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy rằng Ganoderic acid còn có tác dụng:  Giảm đau  Bảo vệ gan Hoạt chất Hoạt tính Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp Ganodermaldiol Hạ huyết áp Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol 22  Chống khối u 2.6.3. Ganoderma Adenosine [21, 22] Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh. Chức năng của adenosine:  Giảm độ nhớt máu  Ức chế kết dính tiểu cầu  Ngăn chặn hình thành cục nghẽn  Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin  Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não  Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể 2.6.4. Alcaloid [5, 9] 2.6.4.1. Định nghĩa Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Tuy nhiên cũng có một số alcaloid không có nhân dị vòng với nitơ và một số alcaloid không có phản ứng kiềm. Một số alcacoid còn có thể có phản ứng acid yếu do có nhóm chức acid trong phân tử. 2.6.4.2. Tính chất Đa số alcaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn. Một vài alcaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alcaloid ở dạng lỏng và có màu. Alcaloid là những hợp chất có tính baz yếu, do sự có mặt nguyên tử nitơ. Tính baz của các alcaloid khác nhau tùy theo nhóm thế (R-) gắn trên nguyên tử nitơ. Các alcaloid tính baz yếu thì phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nước. Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong 23 việc ly trích alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống. 2.6.4.3. Công dụng Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alcaloid.  Tác dụng lên hệ thần kinh  Tác dụng lên huyết áp  Tác dụng trị ung thư 2.6.5. Hợp chất Saponin [28, 29] 2.6.5.1. Khái niệm chung về Saponin Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon. Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200 o C trở lên và có thể trên 300oC. Saponin bị tủa bởi chì acetat, hidroxid barium, sulfat amonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. - Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:  Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean.  Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan. - Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan. 2.6.5.2. Công dụng [11]  Trị long đờm, chữa ho  Là chất phụ gia trong một số vắc xin  Tác dụng thông tiểu  Tác dụng kháng viêm, chống khối u 24 2.6.6. Germanium hữu cơ [21, 22] Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Chức năng của Germanium:  Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư  Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ  Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ 2.7. Phƣơng pháp ổn định dƣợc liệu [5] Muốn bảo quản dược liệu được lâu, tránh hiện tượng lên meo mốc, hoạt chất trong dược liệu bị biến đổi thì dược liệu phải có độ ẩm không quá 1 giới hạn nào đó. Giới hạn này gọi là độ ẩm an toàn, độ ẩm đạt tốt nhất là 13%. Thông thường sự hoạt động của men xảy ra ngay sau khi nguyên liệu bị cắt khỏi cây. Vấn đề xử lý nguyên liệu sau khi thu hái nhằm ức chế hoạt động của men để đảm bảo cấu trúc ban đầu của hợp chất trong cây và nâng cao hiệu suất chiết là cần thiết. Bản thân men là những protein không tan trong cồn, tan trong nước, bị tủa bởi một số muối vô cơ có nồng độ cao. Men hoạt động ở nhiệt độ thích hợp từ 20 – 45oC và bị phá hủy trên 60oC. Có nhiều phương pháp ổn định dược liệu, phương pháp thông thường là sấy ở nhiệt độ thấp trong khoảng thời gian dài. 2.7.1. Chuẩn bị dịch chiết Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành các nhóm theo độ phân cực của chúng: Nhóm các chất không hoặc kém phân cực Nhóm các chất có độ phân cực trung bình 25 Nhóm các chất có độ phân cực mạnh Các nhóm chất này lần lượt được chiết từ nguyên liệu với các dung môi ether ethylic, ethanol (hay methanol) và nước. Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng. Trong một số trường hợp, sự thay đổi mức độ ion hóa của phân tử (dẫn đến thay đổi tính tan) của 1 nhóm chất trong môi trường acid hay baz cũng được dùng để tách các phân nhóm. Yêu cầu chung của các phản ứng hay các thuốc thử sử dụng trong định tính 1 nhóm hợp chất là chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện, chúng cũng phải không hay ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng. 2.7.2. Phƣơng pháp ngâm [5] Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra mọi điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu. Sự khuấy trộn, yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm…, được dùng làm tăng quá trình chiết. - Phương pháp ngâm lạnh: Dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được hoàn tất - Phương pháp ngâm nóng: Là phương pháp ngâm ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. 26 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Đề tài được thực hiện từ 22/03/2005 đến 1/08/2005 tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi - Nấm dược liệu, Quận 12, Thành Phố Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Đối tƣợng thí nghiệm Nấm Hắc chi (Amauroderma subresinosum) do ThS. Phan Thị Nhiều thu hái tại vùng núi Chứa Chan thuộc Tỉnh Đồng Nai (2004) và ThS. Cổ Đức Trọng phân lập, giám định. 3.3. Vật liệu thí nghiệm 3.3.1. Thiết bị Cân phân tích Kính hiển vi Máy chụp ảnh kỹ thuật số Tủ cấy vô trùng Nồi hấp Autoclave và nồi hấp hơi nước Tủ sấy 3.3.2. Hóa chất - Các hóa chất vô cơ: AgNO3, Bi(NO3)3, Fe2(SO4)3, HCl, HgCl2, HNO3, H2SO4, KI, NaOH, NH4OH. - Các hóa chất hữu cơ: anhidrid acetic, cloroform, diethyl ether, etanol. 3.3.3. Môi trƣờng sử dụng 3.3.3.1. Môi trƣờng dinh dƣỡng - Môi trường PGA (Potato glucose agar) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) 27 - Môi trường PGA + 10% nước dừa già Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước dừa: 100 (ml) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) - Môi trường PGA + 10% dịch chiết cà rốt Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Cà rốt: 100 (ml) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) - Môi trường Mizuno Pepton: 10 (g) Glucose: 25 (g) Maltose: 50 (g) NaCl: 5 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Điều chỉnh môi trường về pH = 6 – 6,5 - Môi trường Czapek – Dox Saccharose: 30 (g) NaNO3: 3 (g) KH2PO4: 1 (g) MgSO4: 0,5 (g) KCl: 0,5 (g) FeSO4: 0,01 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Điều chỉnh môi trường về pH = 6 – 6,5 28 - Môi trường lỏng PG (Potato glucose) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Các môi trường đều được khử trùng ở 121oC trong 25 phút. 3.3.3.2. Môi trƣờng nhân giống: Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn vào trong các nghiệm thức thí nghiệm. 3.3.3.3. Môi trƣờng giá thể mạt cƣa cao su: Mạt cưa mua về cần phải rây để loại bỏ dăm bào, sau đó ủ với nước vôi 0,25% qua đêm và tiến hành phối trộn dinh dưỡng theo các nghiệm thức thí nghiệm. 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.4.1. Quan sát hình thái giải phẩu quả thể nấm Amauroderma subresinosum 3.4.1.1. Hình thái quả thể nấm 3.4.1.2. Phƣơng pháp quan sát hệ sợi nấm [7]  Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính  Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn  Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút  Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95%  Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu  Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100 3.4.1.3. Phƣơng pháp quan sát bào tử nấm Linh chi đen [19, 20]  Lấy quả thể nấm Linh chi đen trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ giấy trắng để thu bào tử  Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính  Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô  Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100 3.4.2. Khảo sát sinh trƣởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên các môi trƣờng thạch Theo T. Mizuno (1998), môi trường dùng phân lập giống từ thiên nhiên và phân giống cấp 1 thường là môi trường có chứa Maltose. Để xác định môi trường thích hợp 29 nhất cho việc bảo quản và nhân giống cấp 1 phù hợp với phòng thí nghiệm ở Việt Nam và chuẩn bị cho quá trình phát triển nuôi trồng sản xuất, chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm trên các loại môi trường: PGA, PGA bổ sung, Mizuno, Czaper – Dox. Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 đĩa với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 PGA 2 PGA + 10% nước dừa 3 PGA + 10% dịch chiết cà rốt 4 Mizuno 5 Czaper - Dox Tổng số đĩa cấy: 150 đĩa Các chỉ tiêu theo dõi sau khi cấy 2 ngày:  Đo tốc độ lan tơ nấm (cm/ngày)  Quan sát màu sắc và hình thái sợi nấm Cách tiến hành thí nghiệm: Các môi trường đều hấp khử trùng ở 121oC/25 phút. Đổ môi trường vào đĩa petri vô trùng, để nguội, cấy giống vào đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng (30 2oC). Theo dõi và tiến hành đo đường kính của khuẩn lạc định kỳ 2 ngày 1 lần cho đến khi hệ sợi lan ra hết đĩa petri. 3.4.3. Nghiên cứu quá trình lên men dịch thể Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi đen trên môi trường lỏng PG Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 0.5 lít một lượng môi trường 50 ml. Hấp khử trùng ở 121oC/25 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 10, 15, 20. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô. Trong quá trình thí nghiệm, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 chai. Tổng số chai cấy là 30 chai. 30 3.4.4. Khảo sát sự sinh trƣởng của sợi nấm trên môi trƣờng nhân giống Nguyên liệu dùng là hạt lúa nấu chín và mạt cưa cao su bổ sung các thành phần: cám gạo, cám bắp theo tỷ lệ của các nghiệm thức thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 ống với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 Lúa 90% + mạt cưa 5% + cám gạo 5% 2 Lúa 50% + mạt cưa 25% + cám gạo 25% 3 Mạt cưa 50% + cám bắp 50% 4 Lúa 50% + cám bắp 25% + cám gạo 25% Tổng số ống nghiệm cấy: 120 ống nghiệm Các chỉ tiêu theo dõi:  Đo tốc độ lan sâu của sợi nấm 3 ngày 1 lần (cm/ngày)  Quan sát màu sắc, đặc điểm sợi nấm Cách tiến hành thí nghiệm: Tiến hành phối trộn môi trường theo các nghiệm thức thí nghiệm sao cho độ ẩm đạt khoảng 60%, cho môi trường vào khoảng 2/3 chiều dài ống nghiệm, khử trùng 121oC/60 phút, để nguội và cấy giống vào ở độ tuổi 10 – 12 ngày. Tiến hành theo dõi và đo độ lan sâu của sợi nấm theo định kỳ 3 ngày một lần. 3.4.5. Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh chi đen trên môi trƣờng mạt cƣa cao su Thí nghiệm được bố trí với 10 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 13 bịch với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường giá thể mạt cưa cao su 1 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + urê 2,5o/oo 2 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + urê 2,5o/oo + DAP 2,5 o /oo 3 Mạt cưa cao su + SA 5o/oo + DAP 2,5 o /oo 4 Mạt cưa cao su + nitrat canxi 5 o/oo + DAP 2,5 o /oo 5 Mạt cưa cao su + N-P-K202015 5o/oo 6 Mạt cưa cao su + cám gạo 10% 31 7 Mạt cưa cao su + cám bắp 10% 8 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + super lân 5o/oo + urê 2,5 o /oo 9 Mạt cưa cao su + urê 2,5o/oo + DAP 2,5 o /oo 10 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + dynamic lifter 2,5%. Tổng số bịch cấy trong 3 lần: 390 bịch Các chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi quá trình sinh trưởng và hình thành quả thể nấm Linh chi đen Cách tiến hành:  Mạt cưa cao su khô được bổ sung vôi bột với tỷ lệ 0,25% (theo trọng luợng khô của mạt cưa), bổ sung nước, trộn đều và ủ qua đêm. Độ ẩm của cơ chất mạt cưa đã ủ vôi qua đêm khoảng 45%.  Trộn đều các loại giá thể tổng hợp trên với nước sạch (có bổ sung các chất dinh dưỡng) để đạt đến độ ẩm 65 ± 2% và đóng vào các bịch PP. Hấp thanh trùng bằng hơi nước nóng 100oC trong 5 giờ.  Sau khi giá thể nguội, chúng tôi dùng giống trên môi trường hạt ngũ cốc để cấy vào các bịch giá thể mạt cưa cao su. Độ tuổi thích hợp nhất của giống là 13 – 14 ngày. Xác định hiệu suất sinh học nuôi trồng nấm Linh chi trên giá thể là tỷ lệ giữa trọng lượng thể quả tươi thu hoạch và trọng lượng cơ chất khô. Tiến hành đánh giá trọng lượng quả thể nấm được nuôi trên bịch PP chứa 180 gam cơ chất khô, trong điều kiện nuôi ở nhiệt độ 28 – 35oC. 3.5. Xác định dƣợc chất có trong nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) 3.5.1. Phƣơng pháp định tính alcaloid [5] 3.5.1.1. Chuẩn bị dịch thử Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau: - Phần 1: Bột nấm Linh Chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1% H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. 32 Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2. - Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường