Khóa luận Khảo sát sự ra hoa trong ống nghiệm ở cây Lan sò (Dischidia pectinoides Pearson) và cây Bắt ruồi (Drosera burmannii Vahl)

n biết bởi sự tích lũy và lƣu giữ tinh bột, sự phân bố lại phức tạp hơn của mạng lƣới nội chất trong toàn bộ tế bào chất, sự tăng tổng hợp DNA, tăng cƣờng hoạt động của ty thể, của các enzyme thủy giải, tăng mật độ ribosome, tăng hoạt động của các quá trình nguyên phân và hệ số hô hấp ở đỉnh sinh trƣởng hoa (Ebrahim Zadeh và Nicolas – Prat, 1969; Salisbury, 1971; Yeung và Peterson, 1972; Wardell vavf Skoog, 1973; Trần Thanh Vân và Chlyah, 1976; Bernier và ctv, 1977). [9] Thông thƣờng các hoa tạo ra trong ống nghiệm có kích thƣớc nhỏ hơn hoặc có hình dạng khác thƣờng so với hoa ngoài tự nhiên (Buteko, 1964; Ganapathy, 1969; Mehra và Mehra, 1972; Trần Thanh Vân, 1973a; Scorza và Janick, 1980) [9]. Chẳng hạn ở cây nhân sâm, hoa tạo ra trong điều kiện in vitro có kích thƣớc nhỏ hơn so với hoa trong điều kiện tự nhiên mặc dù hoa vẫn có đầy đủ các cơ quan hoa)[23]; ở cây hoa hồng, đôi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa không đều, đài hoa chƣa chuẩn hoặc có khi chƣa ra đƣợc màu giống với hoa trồng trong môi trƣờng thiên nhiên... [26]; ở cây Gentiana triflora Pall. var. axillarflora, tuy màu sắc hoa có sáng hơn, số bao phấn ít hơn nhƣng hoa vẫn có hình chuông nguyên thủy (Zhang và Leung, 2000). Ngoài ra, việc điều khiển ra hoa trong ống nghiệm còn một hạn chế đó là tỉ lệ nở hoa không đạt đƣợc 100% nhƣ mong đợi. [23,36] 23 2.5 CÁC NGHIÊN CỨU RA HOA IN VITRO 2.5.1 Trên thế giới Chang và Hsing (1980) tạo phôi từ các mô sẹo rễ của cây nhân sâm (Panax ginseng) và các phôi này ra hoa khi nuôi cấy trên môi trƣờng 1/2 MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l GA3. [23] Haeng Soon Lee, Kwang _ Wong Lee, Seung Gyun Yang và Jang Ryol Liu (1991): từ tế bào hợp tử (zygotic embryos) nghiên cứu điều khiển ra hoa trong ống nghiệm trên cây nhân sâm (Panax ginseng). Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng muối vô cơ MS (1962) có nồng độ nitrogen giảm đi một nửa, 100mg/l myo_inositol, 0,4mg/l thiamin HCl, 30mg/l sucrose và kích thích sinh trƣởng BA, GA3, ABA. Sau 10 tuần nuôi cấy, cây nhân sâm ra hoa với tỉ lệ cao nhất trên môi trƣờng chứa 5µm BA và 5µm GA3. Ngoài ra, trên các môi trƣờng chỉ chứa BA; tổ hợp BA+GA3+ABA, hoặc BA + ABA cây cũng cho ra hoa với tỉ lệ tƣơng đối cao. G. R. Rout và P. Das (1994) nghiên cứu tạo phôi soma và ra hoa trong ống nghiệm ở 3 loài tre là Bambusa vulgaris, Dendrocalamus gigateus và Dendrocalamus strictus. Đốt thân của cây con tái sinh từ phôi soma đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng ra hoa: 1/2 MS bổ sung 0,5 mg/l adenin sulphate; 0,25 mg/l IBA; 0,5 mg/l GA3 và 3% sucrose. Sau 12 tuần nuôi cấy thì cho hoa, môi trƣờng lỏng cảm ứng ra hoa tốt hơn môi trƣờng có agar (60-70% so với 25-30%). [36] Rajani S. Nadgauda và ctv (1997) báo cáo rằng khi nuôi cấy cây con in vitro của giống tre Babusa arundinacea trong môi trƣờng MS lỏng chứa 2% sucrose, 5% nƣớc dừa và 2,2 µM BA, sau 3 - 6 tháng có 70 % mẫu cấy ra hoa. [37] Nadgauda et al (2000): Cảm ứng tạo hoa in vitro ở cây Dendrocalamus strictus. Cây đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng ½ MS có bổ sung các nồng độ khác nhau của TDZ (0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; và 1mg/l); 2% sucrose và để trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày ở 25 ± 20C. Sau 21 ngày nuôi cấy tất cả mẫu đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS không chứa TDZ. Kết quả thí nghiệm cho tỷ lệ ra hoa cao 24 nhất sau 2 tuần nuôi cấy trên những mẫu cấy đƣợc cấy chuyền từ môi trƣờng ½ MS có chứa 0,5mg/l TDZ sang môi trƣờng ½ MS. Kachonpadungkitti Yong sak Romchatngoen Supot Hasegewa Koji và Hisajima Shigeru (2001): cảm ứng tạo hoa in vitro từ mẫu chồi cây lúa kiều mạch nuôi cấy in vitro. Trên môi trƣờng ½ MS, với nitrat là nguồn nitro duy nhất, 5% sucrose, 0,1µm kinetin trong điều kiện nuôi cấy 27± 20C ở quang kỳ là 8 giờ chiếu sáng và 16 giờ trong tối, mẫu cấy đƣợc cảm ứng tạo hoa trên 100% số lƣợng với 16 hoa trên mẫu và số hoa nở trên mẫu là 9 sau 8 tuần nuôi cấy. [29] S. Sudhakaran và V.Sivasankari (2002): chồi của cây húng (Ocimum basilicum L.) đƣợc cấy trên môi trƣờng 1/2 MS có bổ sung BAP (3- 5- 7 mg/l) và IAA (1-3-5 mg/l). Sau 20 ngày nuôi cấy cây cho ra hoa in vitro ở môi trƣờng có nồng độ BAP là 7 mg/l và IAA là 5 mg/l. [35] G. Y. Wang, M.F.Yuan và Y.Hồng (2002) đã nghiên cứu ra hoa trong ống nghiệm ở 6 loại hoa hồng. Cây con tái sinh từ chồi sau 45 ngày thì chuyển sang môi trƣờng MS chứa 400 mg/l myo–inositol, 30 g/l sucrose bổ sung các chất điều hoà sinh trƣởng zeatin, TDZ, NAA, BA, IAA, GA3 ở các nồng độ khác nhau. Sau 156- 561 ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy cây cho ra hoa in vitro với mật độ hoa cao nhất ở môi trƣờng chứa 0,5 mg/l TDZ hoặc 0,5 mg/l zeatin kết hợp với 0,1 mg/l NAA (49,2%, 44,2%). [21] Chen Chang và Wei - Chin Chang (2003) đã thành công khi callus có đƣợc từ thân rễ của Cymbidium ensifolium var. misericors ra hoa in vitro trên môi trƣờng 1/2 MS chứa 1,5 µM NAA kết hợp với TDZ (nồng độ từ 3,3–10 µM) hay 2iP (nồng độ 10–33 µM) sau 100 ngày nuôi cấy. [31] 2.5.2 Trong nƣớc Nguyễn Hồng Vũ và ctv (2003) lần đầu tiên điều khiển thành công ra hoa trong ống nghiệm ở cây hoa hồng. Đặc biệt, tác giả đã phát hiện 2 yếu tố quan trọng mang tính chất quyết định đối với sự nở hoa của thực vật là cytokinin và đƣờng, trong đó, đƣờng là yếu tố tác động chính lên sự hình thành hoa in vitro, còn cytokinin giúp làm tăng tỉ lệ hình thành hoa và giúp biệt hoá các cấu trúc hoa ở giai đoạn sau khi 25 tƣợng hoa, làm chất kích thích sự hình thành hoa. Tuy nhiên đề tài vẫn còn một số điểm chƣa hoàn thiện lắm: đôi lúc hoa bị đột biến, cánh hoa không đều, đài hoa chƣa chuẩn hoặc có khi chƣa ra đƣợc màu giống với hoa trồng trong môi trƣờng thiên nhiên...do vậy cần tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện quy trình ra hoa của cây hoa hồng trong ống nghiệm. [26,27] Phạm Thị Minh Thu và ctv (2005) đã cho loài hoa Torenia màu tím (Torenia Fournieri) trổ hoa thành công trong ống nghiệm từ mẫu chồi đƣợc tái sinh từ lá cây Torenia mọc lên từ hạt. Tiếp theo Nguyễn Ngọc Thi và ctv đã tiếp tục tiến hành thí nghiệm làm thay đổi màu sắc hoa torenia trong ống nghiệm từ màu tím sang trắng bằng cách bổ sung yếu tố vi lƣợng vào môi trƣờng sống của cây.[12,34] Vũ Quốc Luận, Dƣơng Tấn Nhựt (2006) đã điều khiển làm cho những đóa hoa lan đầu tiên nở trong ống nghiệm ở loài lan Dendrobium Mild Yumi. [17] Lê Hồng Thủy Tiên và ctv (2006) điều khiển ra hoa thành công cây dừa cạn (Catharanthus roseus) trong điều kiện in vitro. Theo thí nghiệm này, môi trƣờng thích hợp nhất cho sự ra hoa của cây dừa cạn trong ống nghiệm là môi trƣờng MS bổ sung 0,05 mg/l TDZ và 0,1 mg/l NAA. Tỉ lệ ra hoa là 100%. Cây ra nụ sau 58 ngày nuôi cấy và 68 ngày thì hoa nở, trung bình có 4 hoa/cây. [4] Nguyễn Thị Mỹ Duyên và ctv (2007) đã tiến hành thí nghiệm nở hoa trong ống nghiệm trên hai giống lan Dendrobium mini và Giả Hạc và đã đạt đƣợc thành công đáng kể khi hai loại hoa lan này đã lần lƣợt ra hoa trong ống nghiệm. [13] 26 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 3.2 NỘI DUNG Đề tài thực hiện gồm 2 nội dung: Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro ở cây lan sò (Dischidia pectinoides Pearson) Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro ở cây bắt ruồi (Drosera burmannii Vahl) 3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), một yếu tố, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 3 bình, mỗi bình 1 mẫu. 3.3.1 Nội dung 1: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây lan sò Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sò và ra hoa in vitro của cây lan sò. Bảng 3.1: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự tạo sò và ra hoa in vitro trên cây lan sò. Nghiệm thức Môi trƣờng Cƣờng độ ánh sáng (lux) 1 (ĐC) MS 900 2 MS 1800 3 MS 2700 4 MS 3600 Ghi chú: 900 lux ≈ 1 bóng đèn neon Số nghiệm thức: 4 27 Tổng số bình: 36 Tổng số mẫu: Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa Bảng 3.2. Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro ở cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa Nghiệm thức Môi trƣờng GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) 1 (ĐC) MS 0 0 2 MS 0,5 0 3 MS 1,0 0 4 MS 1,5 0 5 MS 2,0 0 6 MS 2,5 0 7 MS 3,0 0 8 MS 0 15 9 MS 0,5 15 10 MS 1,0 15 11 MS 1,5 15 12 MS 2,0 15 13 MS 2,5 15 14 MS 3,0 15 Số nghiệm thức: 14 Tổng số bình: 126 Tổng số mẫu: 126 28 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sò và ra hoa in vitro của cây lan sò. Bảng 3.3. Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ BA đến sự tạo sò và ra hoa in vitro trên cây lan sò Nghiệm thức Môi trƣờng BA (mg/l) 1 (ĐC) MS 0 2 MS 1 3 MS 3 4 MS 5 Số nghiệm thức: 4 Tổng số bình: 36 Tổng số mẫu: 36 3.3.2 Nội dung 2: Khảo sát sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng cơ bản MS với sự thay đổi nồng độ của thành phần hóa chất thực hiện thí nghiệm. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi. Bảng 3.4: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ KH2PO4 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi Nghiệm thức Môi trƣờng KH2PO4 (mg/l) 1 (ĐC) MS 170 (theo MS) 2 MS 340 (x 2) 3 MS 510 (x 3) 4 MS 680 (x 4) 5 MS 850 (x 5) Số nghiệm thức: 5 29 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 45 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro của cây bắt ruồi. Bảng 3.5: Các nghiệm thức thí nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ NH4NO3 đến sự ra hoa in vitro trên cây bắt ruồi. Nghiệm thức Môi trƣờng NH4NO3 (mg/l) 1 (ĐC) MS 1650 (theo MS) 2 MS 825 (1/2) 3 MS 412,5 (1/4) 4 MS 275 (1/6) 5 MS 206,25 (1/8) Số nghiệm thức: 5 Tổng số bình: 45 Tổng số mẫu: 45 3.4 CHỈ TIÊU THEO DÕI 3.4.1 Theo dõi khả năng tạo chồi và sinh trƣởng của cây - Chiều cao cây (cm): tính từ gốc đến đỉnh sinh trƣởng. - Số lá (lá/cây): đếm số lá trên cây, tính lá đã nở ra hoàn toàn và thấy rõ cuống lá. - Số chồi hình thành: số chồi hình thành sau khi cấy 3.4.2 Theo dõi sự ra hoa - Tỉ lệ cây ra nụ (%): là tỉ lệ giữa tổng số cây ra nụ trên tổng số mẫu cấy. - Thời gian ra nụ (ngày): tính từ lúc cấy đến khi có 30% cây ra nụ. - Thời gian ra hoa (ngày): tính từ lúc cấy đến khi 30% nụ nở thành hoa đầu tiên. - Tỉ lệ hoa nở (%): là tỉ lệ giữa tổng số hoa và tổng số nụ. - Số hoa (hoa/cây): là tổng số hoa trên 1 cây. 30 3.5 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.5.1 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản là môi trƣờng MS. Tùy theo mục đích thí nghiệm mà bổ sung thêm chất điều hòa sinh trƣởng GA3 (gibberellin), BA (6_Benzyladenine); nƣớc dừa; tăng hay giảm nồng độ KH2PO4, NH4NO3. Môi trƣờng sau đó đƣợc chỉnh về pH 5,8 (bằng NaOH hoặc HCl) trƣớc khi thêm agar. Sử dụng bình nuôi cấy thể tích 500ml, phân phối vào mỗi bình khoảng 80ml môi trƣờng, hấp tiệt trùng bằng autoclave ở 1210C, áp suất 1,2 atm trong thời gian là 25 phút (riêng môi trƣờng có bổ sung GA3 thì đƣợc hấp thanh trùng trƣớc sau đó mới bổ sung GA3 đã đƣợc lọc vô trùng, môi trƣờng có nƣớc dừa chỉ hấp thanh trùng trong thời gian 20 phút). 3.5.2 Chuẩn bị mẫu cấy Đề tài thực hiện trên cây lan sò và cây bắt ruồi in vitro đƣợc cung cấp bởi phòng nuôi cấy mô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Cây lan sò in vitro đƣợc nhân giống sau 30 ngày tạo cây con hoàn chỉnh, có từ hai đến ba chồi trên một cây. Đây chính là nguồn mẫu sử dụng cảm ứng tạo hoa in vitro. Đối với cây bắt ruồi, sau 14 ngày nhân giống sẽ tạo cây con hoàn chỉnh có 1 chồi trên một cây. 3.5.3 Điều kiện nuôi cấy Cây lan sò in vitro đƣợc nuôi trong phòng tăng trƣởng ở nhiệt độ 240C (± 20C), ẩm độ 55 – 60%, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ngày với cƣờng độ ánh sáng khoảng 1000 – 2000 lux. 3.5.4 Xử lý số liệu Số liệu thu thập đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình thống kê Statgraphics 7.0 31 Chƣơng 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. NỘI DUNG 1: CÂY LAN SÕ IN VITRO Do lan sò là một loại thực vật thân bò nên đối với sự sinh trƣởng của cây chúng tôi chỉ theo dõi chỉ tiêu về sự gia tăng số lá của cây. 4.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng trên sự ra hoa của cây lan sò in vitro Lan sò là một loại cây chịu ánh sáng kém, chỉ thích hợp với ánh sáng nhẹ lúc sáng sớm và lúc cuối buổi chiều. Nếu để trong điều kiện ánh sáng quá mạnh cây sẽ kém phát triển có thể dẫn đến cháy lá. Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng đối với sự sinh trƣởng sinh dƣỡng và sự ra hoa của cây lan sò in vitro.  Sự gia tăng số chồi Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng số chồi của cây lan sò in vitro Nghiệm thức Cƣờng độ ánh sáng (lux) Số chồi trên cây 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 900 7,67a 8,56a 2 1800 7,11 a 8,33 a 3 2700 7,00 a 5,67 b 4 3600 5,56 b 3,33 c CV (%) 18,5 18,56 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). 32 Trong điều kiện ánh sáng yếu 900 lux, cây có số chồi hình thành cao nhất 8 chồi. Khi cƣờng độ ánh sáng tăng trên 2700 lux, cây không những không hình thành chồi mới mà số chồi đang hiện diện cũng giảm đi. Điều này cho thấy cƣờng độ ánh sáng có ảnh hƣởng rất lớn đối với sự gia tăng số chồi của cây.  Sự gia tăng số lá trên cây Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đến sự gia tăng số lá của cây lan sò in vitro Nghiệm thức Cƣờng độ ánh sáng (lux) Số lá (lá/cây) 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 900 49,56a 60,22a 2 1800 38,89 b 46,89 b 3 2700 34,33 bc 33,33 c 4 3600 28,89 c 23,44 d CV (%) 17,4 19,8 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Cũng nhƣ khả năng tạo chồi, ở các cƣờng độ ánh sáng càng cao, sự gia tăng số lá trên cây càng thấp. Sự gia tăng số lá nhiều nhất là ở nghiệm thức 1 (60 lá) và thấp nhất ở nghiệm thức 4 (23 lá). Những kết quả thu đƣợc về ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng đối với sự gia tăng số chồi và số lá khẳng định rằng cƣờng độ ánh sáng yếu mới là điều kiện thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây lan sò in vitro. Tuy nhiên, sau 60 ngày nuôi cấy dƣới ảnh hƣởng của cƣờng độ ánh sáng, cây lan sò chƣa tạo sò và ra hoa in vitro, điều này có thể là do sự tác động của cƣờng độ ánh sáng chƣa thích hợp để đƣa cây đến giai đoạn trƣởng thành nhất định cần thiết cho sự tạo sò và ra hoa in vitro. 33 4.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa. GA3 là chất kích thích sinh trƣởng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu ra hoa in vitro trên nhiều loài khác nhau. Tác dụng của GA3 thể hiện trong khả năng kích thích sự phân chia và kéo dài tế bào, tăng trƣởng lóng thân và lá, tăng cƣờng sự nở hoa trên nhiều loài khác nhau. Ngoài ra, GA3 còn có tác dụng kích thích sự tạo hoa trên các cây ngày dài cũng nhƣ các cây cần có sự kéo dài lóng thân để ra hoa [7]. Do vậy, GA3 có thể cảm ứng sự ra hoa in vitro trên cây lan sò. Nƣớc dừa, theo nhiều nghiên cứu đã chứng minh đƣợc trong thành phần có chứa nhiều chất dinh dƣỡng khác nhau nhƣ myo- inositol, các loại acid amin thiết yếu, zeatin …. Zeatin - một loại cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia của các tế bào thân đã phân hóa. Đây chính là yếu tố giúp cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây, đƣa cây đến giai đoạn trƣởng thành ra hoa đặc biệt ở những cây cần có sự kéo dài lóng thân mới ra hoa.[2] 34  Sự gia tăng số chồi trên cây Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến số chồi của cây lan sò in vitro trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa. Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) Số chồi trên cây 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 0 0 4,56a 9,89a 2 0,5 0 4,67 a 6,22 e 3 1,0 0 7,33 de 10,33 af 4 1,5 0 8,11 ef 9,67 ab 5 2,0 0 6,00 bc 9,44 ab 6 2,5 0 9,00 f 12,22 g 7 3,0 0 6,89 cd 11,44 fg 8 0 15 4,33 a 6,67 de 9 0,5 15 6,00 bc 9,11 abc 10 1,0 15 7,00 cde 9,44 ab 11 1,5 15 6,78 cd 7,89 cd 12 2,0 15 5,11 ab 6,67 de 13 2,5 15 5,00 ab 5,78 e 14 3,0 15 6,78 cd 8,33 bc CV(%) 19,3 18,67 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05).  Trên môi trƣờng không bổ sung nƣớc dừa Trong môi trƣờng có nồng độ GA3 2,5 mg/l, cây hình thành chồi nhiều nhất, trung bình 12 chồi/cây. Ở các nồng độ GA3 thấp hơn, số chồi hình thành ít hơn. Tuy nhiên, khi nồng độ GA3 cao hơn mức 2,5 mg/l sự gia tăng số chồi của cây có dấu hiệu giảm lại (xem bảng 4.2). Ở đây, chúng tôi thấy sự gia tăng số chồi ở các nghiệm thức bổ sung GA3 ít hơn so với sự gia tăng số chồi của nghiệm thức đối 35 chứng (không sử dụng GA3). Điều này có thể do gibberellin là một chất có hoạt tính cản sự khởi tạo đỉnh sinh trƣởng, do đó ức chế sự hình thành chồi mới, chỉ kích thích sự phát triển của chồi một khi đỉnh sinh trƣởng đã đƣợc hình thành (Jarret và Hasegawa, 1981) [3].  Trên môi trƣờng có bổ sung nƣớc dừa Sau 30 ngày nuôi cấy, nghiệm thức 10 có nồng độ GA3 1 mg/l có số chồi hình thành cao nhất (9,44 chồi). Sau 60 ngày nuôi cấy, số chồi hình thành cao nhất vẫn là ở nghiệm thức 10 và khi nồng độ GA3 càng cao, sự gia tăng số chồi giảm dần. Nồng độ GA3 thích hợp nhất cho sự hình thành chồi của cây lan sò in vitro là 1mg/l. Khi nuôi cấy cây lan sò trên môi trƣờng có và không có nƣớc dừa với sự thay đổi nồng độ GA3 từ 0-3 mg/l, kết quả thu đƣợc cho thấy: trên môi trƣờng không chứa nƣớc dừa, số chồi hình thành nhiều nhất ở nghiệm thức 6 với nồng độ GA3 là 2,5 mg/l và số lá hình thành nhiều nhất ở nghiệm thức 3 với nồng độ GA3 là 1,0mg/l; trên môi trƣờng có nƣớc dừa, môi trƣờng thích hợp nhất cho sự hình thành chồi và tăng trƣởng lá cho cây lan sò in vitro là môi trƣờng bổ sung GA3 1,0 mg/l. Những kết quả trên đây có thể là do trên môi trƣờng không có nƣớc dừa, sự tác động của GA3 chỉ là ở nồng độ GA3 sử dụng trong các nghiệm thức. Việc sử dụng nồng độ GA3 có hiệu quả trên sự gia tăng số lá của cây, cây tăng nhanh về số lá và chiều dài lóng thân làm cây sum xuê hơn so với mẫu cấy lúc đầu. Trên môi trƣờng chứa nƣớc dừa, nƣớc dừa là một hợp chất chứa rất nhiều thành phần dinh dƣỡng khác nhau nhƣ vitamine, acid amine thiết yếu, zeatin,…. Còn gibberellin lại đƣợc xem là có thể thay thế cho auxin trong quá trình cảm ứng tạo chồi (Sekioka và Tanaka, 1981) [3]. Chính vì vậy, việc phối hợp sử dụng gibberellin và nƣớc dừa trong môi trƣờng nuôi cấy cũng có thể đƣợc coi nhƣ là sự phối hợp giữa auxin và cytokinine, và khi sự phối hợp này đạt đƣợc một tỷ lệ thích hợp cần thiết cho sự tạo chồi (auxin/cytokinine nhỏ hơn 1) sẽ kích thích mạnh sự phát triển chồi của cây. Ở đây, sự hình thành chồi đƣợc quan sát thấy cao nhất trong môi trƣờng chứa 15% nƣớc dừa và GA3 1,0 mg/l, đây có thể đƣợc xem là môi trƣờng có sự kết hợp giữa gibberellin và nƣớc dừa phù hợp cho sự tạo chồi cây lan sò in vitro. 36  Số lá trên cây Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự sinh trƣởng lá của cây lan sò in vitro trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa. Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) Số lá (lá/cây) 30 ngày 60 ngày 1 (Đ/C) 0 0 29,22ab 48,33abc 2 0,5 0 20,67 c 48,56 abc 3 1,0 0 38,33 de 72,00 f 4 1,5 0 24,33 ac 54,00 bcd 5 2,0 0 20,67 c 45,56 ab 6 2,5 0 23,33 ac 56,56 cd 7 3,0 0 27,00 ac 60,67 def 8 0 15 28,33 ab 42,44 a 9 0,5 15 37,78 de 68,00 def 10 1,0 15 53,44 f 72,33 f 11 1,5 15 50,22 f 67,22 def 12 2,0 15 35,89 de 57,67 cde 13 2,5 15 34,22 bd 49,33 abc 14 3,0 15 42,33 e 69,78 ef CV(%) 19,8 19,24 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Trên cả hai môi trƣờng có và không có nƣớc dừa, sự gia tăng số lá đều đƣợc nhận thấy cao nhất ở môi trƣờng bổ sung GA3 1,0 mg/l sau 30 và 60 ngày nuôi cấy (72 lá). Ở nồng độ GA3 cao hơn hoặc thấp hơn, sự gia tăng số lá trên cây ít hơn. Tuy nhiên, trên môi trƣờng có nƣớc dừa, số lá hình thành trên cây cao hơn so với trên môi trƣờng không có nƣớc dừa (Bảng 4.4). Nhƣ vậy, sự gia tăng số lá của cây lan sò tốt nhất là trên môi trƣờng bổ sung GA3 1,0 mg/l và 15% nƣớc dừa. 37  Sự ra hoa Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ GA3 đến sự ra hoa in vitro của cây lan sò trên môi trƣờng có và không có bổ sung nƣớc dừa Nghiệm thức Nồng độ GA3 (mg/l) Nồng độ nƣớc dừa (%) Tỉ lệ cây ra nụ (%) Thời gian ra nụ (ngày) Thời gian ra hoa (ngày) Tỉ lệ hoa nở (%) Số hoa/cây (hoa) 1 0 0 0 a 0 a 0 a 0 a 0 a 2 0,5 0 33,3 b 90,0 bc 107,0 b 100 b 2,0 b 3 1,0 0 55,5 e 89,8 c 100,7 b 100 b 2,3 b 4 1,5 0 44,4 d 78,0 b 95,5 b 100 b 7,0 d 5 2,0 0 33,3 d 77.7 b 95,5 b 100 b 4.3 c 6 2,5 0 33,3 d 76,0 b 95,5 b 100 b 4,0 c 7 3,0 0 22,2 c 79,0 b 90,0 b 100 b 3,5 bc 8,9,10,11 12,13,14 15 - - - - CV (%) 15,9 7,0 5,9 0 15,9 Ghi chú: - Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Trên môi trƣờng không có nƣớc dừa, tất cả các nghiệm thức đều ra hoa và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. - Theo bảng 4.5, tỉ lệ cây ra nụ tƣơng đối thấp ở các nghiệm thức và dao động trong khoảng 22,2 – 44,4%, chỉ có nghiệm thức 3 có tỉ lệ ra nụ cao nhất 55,6%. - Về thời gian ra nụ, nghiệm thức 6 với nồng độ GA3 2,5 mg/l có thời gian ra nụ ngắn nhất 76 ngày trong khi các nghiệm thức khác thời gian ra nụ dài hơn hẳn. - Thời gian ra hoa của cây từ 90 - 110 ngày kể từ lúc cấy. Thời gian ra hoa ngắn nhất là 90 ngày ở nghiệm thức 7 nhƣng lại không có sự khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Thời gian để nụ phát triển thành hoa ở các nghiệm thức rất khác nhau. Ví dụ: nghiệm thức 6 có thời gian ra nụ ngắn nhất nhƣng thời gian để 38 nụ phát triển thành hoa lại cao nhất, nghiệm thức 3 và nghiệm thức 7 là có thời gian phát triển từ nụ thành hoa ngắn nhất (11 ngày). Theo sự quan sát của chúng tôi, những hoa có thời gian phát triển từ nụ thành hoa càng dài thì thời gian tồn tại của hoa sau đó càng lâu, và ngƣợc lại những hoa có thời gian phát triển từ nụ thành hoa càng ngắn thì độ bền của hoa cũng giảm xuống. Cụ thể là hoa bị rụng sớm khi chƣa phát triển đến giai đoạn hoàn chỉnh nhất. Nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể do lƣợng chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng đã giảm bớt trong thời gian nuôi cấy nên khi cây đến giai đoạn trổ hoa thì lƣợng dinh dƣỡng không đủ để cây cung cấp cho hoa, do vậy hoa hoàn thành vòng phát triển nhanh và rụng sớm. Hơn nữa cũng có thể do nụ phát triển thành hoa quá nhanh dẫn đến không đảm bảo tổng hợp đủ các yếu tố cần thiết để phát triển thành hoa hoàn chỉnh và tồn tại lâu dài. - Số hoa hình thành trên cây cao nhất ở nghiệm thức 4 có nồng độ GA3 1,5mg/l với số hoa trung bình là 7 hoa/cây, khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Trên môi trƣờng bổ sung nƣớc dừa, tất cả các cây đều chƣa có dấu hiệu của sự ra hoa. Qua thí nghiệm này, môi trƣờng thích hợp nhất để điều khiển cây lan sò ra hoa in vitro là môi trƣờng bổ sung GA3 1,5 mg/l và không có nƣớc dừa. Cây ra nụ sau 78 ngày nuôi cấy và phát triển thành hoa sau 95 ngày, trung bình có 7 hoa trên cây. Môi trƣờng có GA3 1,0 mg/l dù tỉ lệ ra nụ cao nhất nhƣng thời gian ra nụ dài, đa số hoa bị rụng sớm và có dấu hiệu bất thƣờng không phải là môi trƣờng tốt để phát triển hoa in vitro. Hoa lan sò in vitro tƣơng đối giống với hoa in vivo. Tuy nhiên, hoa hình thành trong điều kiện in vitro có một số nhƣợc điểm nhƣ: phát triển không bình thƣờng, rụng sớm; cấu trúc hoa không hoàn chỉnh, màu sắc hoa đậm hơn hoặc nhạt hơn hoa in vivo. 39 Hình 4.1 Các giai đoạn phát triển của hoa lan sò in vitro. (B1): Cây lan sò 30 ngày sau cấy; (B2): Nụ hoa 3 ngày tuổi; (B3): Nụ hoa 10 ngày tuổi; (B4): Nụ hoa 15 ngày tuổi; (B5), (B6): Hoa lan sò in vitro chƣa hoàn chỉnh và hoàn chỉnh. B2 B1 B6 B3 B5 B2 B4 40 Hình 4.2 Hoa lan sò in vitro. (C1): lan sò ra hoa in vitro; (C2), (B3): hoa chƣa trƣởng thành và trƣởng thành. C1 C2 C3 41 Hình 4.3 Những biểu hiện không bình thƣờng của hoa lan sò in vitro. (D1): Hoa lan sò in vivo; (D2): Hoa lan sò in vitro; (D4), (D3): Hoa biến dạng; (D5): Hoa có màu sắc đậm; (D6), (