Khóa luận Khảo sát sự sinh trưởng của Saccharomyces SP. trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hưởng đến sức sống của chúng trong chế phẩm

acid nucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn tiêu biến. Nhƣ vậy có thể thấy số lƣợng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit, song sinh khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lƣợng tế bào ở giai đoạn này lớn. 2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào 2.7.1. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lƣợng nhƣ K, Na, Mg, Ca và vitamin. Dùng ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men rất tốt. Bột hoặc tinh bột các loại dùng vào mục đích này trƣớc tiên phải thủy phân bằng acid hoặc enzyme của mầm mạ, của vi sinh vật để biến các polysacarit thành các dạng đƣờng mà nấm men đồng hóa đƣợc. Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trƣờng mà nguồn carbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trƣờng đƣờng với nguồn nguyên liệu đƣợc nấu chín thì tốt hơn. Một số giống nấm men phân lập từ men thuốc bắc có khả năng sử dụng cả môi trƣờng đƣờng và môi trƣờng tinh bột hoặc cấy trực tiếp vào thức ăn sống mà vẫn phát triển tốt. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng cám, số lƣợng nấm men có thể đạt hàng chục triệu tế bào/ml dịch nuôi cấy (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970). 13 Môi trƣờng rỉ đƣờng hoặc dung dịch đƣờng đƣợc acid hóa với pH = 4, bổ sung thành phần dinh dƣỡng và duy trì nhiệt độ 25 – 300C, lƣợng sinh khối thu đƣợc khoảng 25 – 50 g/l (Trần Minh Tâm, 2002, trích từ Nguyễn Thị Hồng Phƣơng, 2006). Theo phòng vi sinh thuộc Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, từ 1 m3 nƣớc bã rƣợu nuôi nấm men có thể thu đƣợc 10 – 15 kg men khô. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu cũng đƣợc sử dụng để nuôi cấy nấm men do trong đậu chứa hàm lƣợng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm men. Ngoài ra, còn có các vitamin A1, B1, B2, C, E, K và các chất kích thích tố tăng trƣởng khác. Tuy nhiên, vitamin C trong nƣớc chiết giá đậu có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men. Ngoài ra, môi trƣờng thủy phân từ cellulose thực vật (gỗ, vỏ bào, rơm rạ, lõi ngô, bã mía…), hay parafin từ dầu mỏ cũng có thể sử dụng để nuôi cấy nấm men. Đặc biệt, nấm men có khả năng sử dụng đƣợc môi trƣờng dịch kiềm sulfit (chất thải của nhà máy giấy), thành phần chủ yếu là đƣờng pentose. Ngƣời ta tính đƣợc rằng, khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất giấy sẽ thải một lƣợng dịch kiềm sulfit chứa khoảng 180 kg đƣờng. Dịch này hấp thụ nhiều oxy nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so với bình thƣờng (Lƣơng Đức Phẩm, 2006). Hiện nay, môi trƣờng đƣợc sử dụng để nuôi cấy nấm men phổ biến nhất vẫn là môi trƣờng rỉ đƣờng. 90% lƣợng sinh khối nấm men dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trên thế giới đƣợc sản xuất từ rỉ đƣờng mía và củ cải đƣờng. Thành phần chính của loại nguyên liệu này là saccharose, khoảng 35 – 40%. Trong đƣờng mía chứa các chất sinh trƣởng (biotin, acid pantotenic, inozit) với hàm lƣợng lớn, nhƣng lại nghèo chất khoáng và các acid amin. Vì vậy, khi sử dụng đƣờng mía làm nguồn carbon nuôi cấy nấm men cần phải loại bỏ một phần các chất sinh trƣởng, đồng thời bổ sung các muối khoáng cần thiết và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân vào giai đoạn nhân giống. Lƣợng đƣờng trong môi trƣờng khoảng 2 – 3%, không nên nhiều hơn hay ít hơn. Nếu lƣợng đƣờng cao sẽ vừa lãng phí và 14 vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngƣợc đến quá trình tạo sinh khối. Nếu lƣợng đƣờng quá nhỏ sẽ không đủ nguồn carbon cần thiết cho sự tạo sinh khối. Một điểm đáng lƣu ý là hệ keo và các chất màu có trong mật rỉ. Hệ keo có trong mật rỉ đƣợc hình thành bởi protein và pectin, nó thƣờng có độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào, gây ra hiện tƣợng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém, dẫn đến hiệu suất sinh khối thu đƣợc thấp. Các chất màu có trong rỉ đƣờng nhƣ hợp chất caramen, melanin…sẽ làm sinh khối nấm men có màu sẫm, ảnh hƣởng đến cảm quan. Vì thế, đặc biệt trong sản xuất men bánh mì ngƣời ta phải xử lý rỉ đƣờng trƣớc khi nuôi cấy. 2.7.2. Nhiệt độ Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng và phát triển của chúng. Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ƣu là 28 – 300C, trên 43 0C và dƣới 280C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn. Ở 300C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S. cerevisiae 2 – 3 lần, ở 35 – 380C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấp khoảng 20 – 230C, hạn chế đƣợc mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn. 2.7.3. pH của môi trƣờng pH tối ƣu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc độ tích luỹ sinh khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh dƣỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hƣởng bởi pH nên chất lƣợng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trƣờng nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6. 2.7.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hoà oxy hoà tan. Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động âm trên hoạt động sống của 15 tế bào nấm men. Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxy đƣợc hoà tan vào môi trƣờng nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào. Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để oxy hóa 1 kg đƣờng, nhƣng thực tế chỉ 1 phần nhỏ oxy bơm vào là đƣợc nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trƣờng (Lao Thị Nga, 1987). Khi nuôi cấy nấm men ở qui mô công nghiệp, kích thƣớc của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hƣởng gián tiếp lên sự tăng trƣởng của nấm men. 2.8. Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn Nấm men có rất nhiều chủng loại khác nhau, đa dạng trong chuyển hóa và tổng hợp các chất hữu cơ, phạm vi phân bố và điều kiện sống nhƣ nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, không khí… rộng nên dễ dàng chọn đƣợc các chủng có khả năng thích hợp với qui trình sản xuất và đáp ứng đƣợc yêu cầu đòi hỏi của thị trƣờng. Có tốc độ phát triển nhanh, để tăng gấp đôi khối lƣợng cơ thể thì nấm men cần 1 – 2 giờ, vi khuẩn từ 20 – 60 phút, tảo từ 2 – 6 giờ, nấm sợi từ 4 – 12 giờ trong khi đó gà con cần 200 giờ, heo con cần 600 giờ, bê, nghé cần 1500 giờ (Nguyễn Lân Dũng, 1992). Có khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dƣỡng khác nhau cho phép ngƣời ta sử dụng các nguồn dinh dƣỡng sẵn có, rẻ tiền để sản xuất nhằm tăng sản lƣợng và giảm giá thành sản phẩm (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Không nhƣ nấm mốc, hầu hết nấm men không sinh độc tố trong môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng nhân tạo, trừ 1 số loài gây bệnh nhƣ Candida albican (Nguyễn Văn Hƣng, 1990). Ngoài ra, khi lên men nấm men còn tạo mùi thơm đặc trƣng cho rƣợu, bia. 16 Nấm men cũng nhƣ vi sinh vật dễ gây đột biến bằng các tác nhân vật lý, hóa học, do đó có thể dùng kỹ thuật di truyền để biến đổi đặc điểm sinh học của nấm men theo hƣớng có lợi. Giá trị dinh dƣỡng của nấm men rất lớn, đặc biệt là hàm lƣợng protein, acid amin và vitamin nhóm B trong nấm men rất cao, dễ tiêu hóa và hấp thụ Với đặc điểm sinh lý của nấm men dễ dàng thiết lập dây chuyền công nghệ cao để khai thác các sản phẩm từ nấm men nhằm phục vụ nhu cầu thực tiễn. Trong 24 giờ 1 con bò nặng 300 kg đƣợc chăm sóc tốt cũng chỉ tăng trung bình khoảng 1,1 – 1,2 kg, trong đó có khoảng 120 g protein. Nếu lấy 300 kg nấm men giống nuôi trong hệ thống lên men trong 24 giờ thì tạo 25.000 – 30.000 kg sinh khối, trong đó có khoảng 11.000 – 13.000 kg protein. Rõ ràng ta thấy sự tích luỹ protein ở nấm men cao hơn nhiều so với ở heo, bò, gà vài nghìn lần và tƣơng tự gấp vài trăm lần ở cây đậu, ngũ cốc (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970). Trong nấm men có 1 số men tiêu hóa (amylase, protease…) và vitamin (đặc biệt là vitamin B) xúc tiến nhanh quá trình trao đổi chất, kích thích sự thèm ăn của gia súc. Nhờ đó, công tác chăn nuôi thu đƣợc lợi nhuận cao. Tuy nhiên, sinh khối tế bào nấm men có nhƣợc điểm là mặc dù hàm lƣợng protein cao khoảng 55 – 60%, nhƣng đồng thời nó cũng chứa lƣợng acid nucleic quá cao (10%), điều này ảnh hƣởng tới sức khoẻ con ngƣời. Do đó, cần có các biện pháp làm giảm lƣợng acid nucleic này. Ngoài ra, màng tế bào nấm men khá vững chắc nên cần có biện pháp thích hợp để phá vỡ màng khi thu protein. 17 Bảng 2.1: Thành phần hóa học của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Acid amin Tỷ lệ % Acid amin Tỷ lệ % Cystin 0,54 Tryptophan 0,68 Histidin 1,19 Frolin 1,59 Phenylalanin 2,01 Glycin 2,10 Serin 2,20 Arginin 2,33 Threonin 2,50 Tyrosin 2,77 Lysin 3,11 Valin 3,30 Isoleucin 3,70 Leucin 3,80 Acid asparaginic 3,97 Alanin 5,78 Acid glutamic 6,74 Methionin 0,60 Thành phần Tỷ lệ % Protid 44 – 45% Glucid 25 – 35% Lipid 1,5 – 5% Các chất chiết xuất vô đạm 22 – 40% Các chất khóang 6 – 12% 18 Bảng 2.3: Thành phần khóang của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Thành phần Tỷ lệ % Thành phần Tỷ lệ % K2O 28 – 48 Fe2O3 0,1 – 7,3 Na2O 0,06 – 1,9 P2O5 41 – 59 CaO 1 – 5,5 SO3 0,4 – 6 MgO 4 – 8,1 SiO2 1,6 Bảng 2.4: Thành phần vitamin của nấm men (mg/kg) Vitamin Hàm lƣợng (mg/kg) Vitamin Hàm lƣợng (mg/kg) D2 (calciferol) 250 B6 (pyridoxyn) 60 B1 (thiamin) 40 B9 (acid folic) 4,2 B2 (riboflavin) 50 H (biotin) 2,0 B5 (nicotinic) 21 – 100 2.9. Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi 2.9.1. Ở nƣớc ngoài Đã có nhiều công trình nghiên cứu trƣớc hết về bản chất sinh học, khả năng sinh hóa, phân loại của 1 số giống nấm men đƣợc sử dụng phổ biến trong sản xuất sinh khối tế bào nhƣ Saccharomyces, Torulopsis và Candida (Cainsnorth G et al, 1962, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Những nghiên cứu đầu tiên về sinh vật học trong bánh men rƣợu ở nƣớc ta đƣợc thực hiện vào cuối thế kỷ 19 bởi Calmette và học trò của ông vào 1948. Các nhà khoa học trên thế giới đang hƣớng đến nghiên cứu chọn giống cho quá trình nâng cao công nghệ lên men truyền thống trên môi trƣờng xốp để làm giàu protein cho các sản phẩm giàu tinh bột nhƣ sắn và các phụ phẩm nông nghiệp nhƣ bã dừa, vỏ chuối, bã mía…(Schoch JJ, 1982, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Trƣớc đây, ngƣời ta đã sử dụng nấm sợi để lên men song do vấn đề sinh độc tố 19 mycotoxin làm các nhà chăn nuôi e ngại. Do đó, họ chú ý đến nấm men và 1 số vi khuẩn lên men truyền thống nhƣ vi khuẩn lactic (Rose A.H, 1981, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Chế phẩm ezyme vi sinh vật ngày nay đƣợc sản xuất ở qui mô công nghiệp. các chế phẩm này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi, trong chăn nuôi ezyme đƣợc dùng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp, làm tăng khả năng tiêu hóa cho gia súc. Gần đây, hãng dƣợc Biocodex-Montronge (Pháp) cho ra sản phẩm men tiêu hóa có tên Bioflor 250 có chứa 250mg tế bào nấm men S. boulardii dùng để phòng trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. 2.9.2. Ở trong nƣớc Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nƣớc ta có thể nói đƣợc bắt đầu từ 1960 trở lại đây. Bao gồm các lĩnh vực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đƣờng và sản xuất chế phẩm sinh học. Năm 1975, Trần Đức Trân và Nguyễn Công Xuân đã sử dụng sinh khối nấm men đƣợc sản xuất từ rỉ đƣờng của nhà máy đƣờng Vạn Điểm để chăn nuôi heo với tỷ lệ bổ sung 3 – 4% trong khẩu phần của heo 2 – 5 tháng tuổi đạt kết quả tốt (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đƣờng hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹ Thuật Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase đƣợc tách từ chủng Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae làm cho nó có 2 đặc tính đƣờng hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn (Trƣơng Nam Hải, 1994, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Hiện nay, các nhà chăn nuôi khá quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm. Đặc trƣng của các chế phẩm sinh học này là sự kết hợp của nhiều chủng loại vi sinh vật có ích nhƣ 20 Bacillus. spp, Lactobacillus. spp, Saccharomyces. spp, các enzyme amylase, protease… 21 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03 đến tháng 08 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng thực tập vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Mẫu khảo sát Chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ sấy, nồi hấp khử trùng autoclave, tủ lạnh, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, máy li tâm, máy sục khí, micropipette… Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa khuấy, bình tam giác, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, lame, lamelle, giấy đo pH… 3.2.3. Hóa chất Hóa chất dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm men nhƣ cồn 960, nƣớc cất, agar, KH2PO4, MgSO4, K2HPO4, (NH4)2PO4. 3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng phân lập và giữ giống nấm men là môi trƣờng Sabouraud. 22 Môi trƣờng khảo sát nuôi cấy là môi trƣờng cám gạo, môi trƣờng rỉ đƣờng mía, môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu. 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho. Khảo sát sự phát triển của các chủng đƣợc phân lập từ 4 mẫu trên trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Khảo sát sự phát triển của nấm men trong các loại môi trƣờng nuôi cấy khác nhau. Khảo sát thời gian thu nhận sinh khối nấm men trong các loại môi trƣờng trên. Khảo sát sự phối hợp nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phân lập nấm men 3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì Pha mẫu với 1 ít nƣớc muối sinh lý 90/00 rồi đem cấy ria trên mặt thạch Sabouraud. Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, đƣờng kính khoảng 2 – 3 mm, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái. 3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho Chọn những chỗ bị dập, hơi có mùi rƣợu rồi cấy ria trên mặt thạch Sabourand. Để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái. 23 Sau khi xác định đƣợc đó là chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces thì đem cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng Sabouraud để tăng sinh. 3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B 3.4.2.1. Mục đích Từ các chủng của 4 nguồn mẫu trên, chọn chủng có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Thông số cố định Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng mật rỉ đƣờng mía 60B. Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 100ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 36 giờ. Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. 3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí 1 yếu tố, lặp lại 2 lần với 4 nghiệm thức. Mẫu Chế phẩm Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 Lần 2 24 3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces Từ kết quả thí nghiệm 1, chúng tôi chọn 2 chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất làm đối tƣợng nghiên cứu cho thí nghiệm 2. 3.4.3.1. Mục đích Tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch thích hợp cho số lƣợng tế bào nấm men lớn nhất. 3.4.3.2. Thông số cố định Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 300ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu, đơn vị tính tb/ml. Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud, đơn vị tính là cfu/g. Phƣơng pháp đếm tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chỉ cho biết tổng số tế bào trong dịch nuôi cấy (bao gồm cả số tế bào sống và tế bào chết). Với mục đích nuôi cấy nấm men dùng làm chế phẩm sinh học nên yêu cầu số lƣợng tế bào sống trong chế phẩm phải cao. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa cho phép xác định số lƣợng tế bào nấm men sống trong chế phẩm, từ đó ta có thể đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm. 25 3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch, lặp lại 3 lần. Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ: T1:200 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. T2: 200 ml môi trƣờng cám gạo + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. Yếu tố thời gian thu hoạch có 3 mức độ: 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ. 3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm Sau khi tiến hành xong thí nghiệm 2,chúng tôi thu hoạch sinh khối tế bào nấm men và sản xuất thành chế phẩm. Thử nghiệm trộn sinh khối nấm men với chất nền là cám gạo và bột mì, trong đó chia thành 3 phần: Phần 1: không bổ sung vitamin C. Phần 2: bổ sung 50/000 vitamin C. Phần 3: bổ sung 10/00 vitamin C. Sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng, tiến hành đếm số lƣợng tế bào nấm men còn sống trong chế phẩm bằng phƣơng pháp khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud. 3.4.4.1. Mục đích Xác định đƣợc thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản thích hợp để nấm men có khả năng sống lâu nhất trong chế phẩm. 3.4.4.2. Thông số cố định Thời gian bảo quản: 22 ngày. Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ phòng. Số lƣợng tế bào nấm men ở mỗi mẫu: 109 tb/g. 26 3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa, đơn vị tính là cfu/g. 3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm Các mẫu lấy từ thí nghiệm 3 và chỉ tiêu theo dõi cũng là số lƣợng tế bào sống trong 1 g chế phẩm (đơn vị tính là cfu/g), nhƣng lúc này không xét đến ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C). 3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung S. cerevisiae từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng Sabouraud lỏng trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, B. subtilis từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) trong 24 giờ ở 370C rồi cấy vào các bình nuôi cấy theo tỷ lệ sau: Bình 1: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0B). Bình 2: 1 ml dịch S. cerevisiae + 1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+1B). Bình 3: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,1B). Bình 4: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,01 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,01B). 3.4.6.1. Mục đích Tìm hiểu ảnh hƣởng của B. subtilis lên sự phát triển của S. cerevisiae. 3.4.6.2. Thông số cố định Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 200 ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 48 giờ. 27 Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.6.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Đơn vị tính: tb/ml. Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud. Đơn vị tính: cfu/g. 3.4.6.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố, lặp lại 2 lần. Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ: Môi trƣờng rỉ đƣờng: 150 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 50 ml nƣớc chiết giá đậu. Môi trƣờng cám gạo: 150 ml môi trƣờng cám gạo + 50 ml nƣớc chiết giá đậu. Yếu tố nồng độ B. subtilis có 4 mức độ: 0, 100, 10-1, 10-2. 3.4.7. Phƣơng pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu Lấy 1ml dịch nấm men nuôi cấy pha loãng với 9ml nƣớc muối sinh lý 90/00, ta đƣợc nồng độ 10-1, rồi pha tiếp đến 10-2, 10-3… chọn nồng độ thích hợp cho việc đếm đƣợc dễ dàng và có độ chính xác cao. Sau đó nhỏ lên buồng đếm hồng cầu và đếm dƣới kính hiển vi ở vật kính 40X. Kết quả đƣợc tính theo công thức: Số tế bào nấm men/1 ml = a*4000*1000*H Trong đó: A: số tế bào trong 1 ô nhỏ H: hệ số pha loãng = 1/độ pha loãng 4000 = hệ số chuyển thành 1 mm3 = 1/thể tích ô nhỏ = 1/4000 mm 1000 = hệ số chuyển mm3 thành ml (1 ml = 1000 m3) 28 3.4.8. Phƣơng pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch) Tế bào vi sinh vật sống là tế bào có khả năng sinh trƣởng để tạo thành một quần thể. Trên bề mặt môi trƣờng đặc, quần thể này tạo những đám có hình dạng, màu sắc riêng biệt đƣợc gọi là khuẩn lạc. Từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch suy ra số tế bào sống có trong mẫu đã cấy trên mặt thạch. Ở đây đơn vị tính là cfu/ml, nghĩa là số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 ml đơn vị thể tích. Cách tiến hành Pha loãng mẫu: lấy 1 g chế phẩm pha loãng với 9 ml nƣớc muối sinh lý 90/00 ta đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1, tiếp tục hút 1 ml dịch thể trên pha với 9 ml nƣớc muối sinh lý 90/00 ta đƣợc nồng độ pha loãng 10 -2 và làm nhƣ thế khi có đƣợc nồng độ pha loãng thích hợp. Để tách rời các tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc mạnh dịch đã pha loãng. Cấy trải dịch pha loãng trên đĩa thạch Sabouraud: ta sẽ cấy mỗi mẫu ở 3 nồng độ pha loãng và ứng với mỗi độ pha loãng chuẩn bị 2 đĩa thạch. Sau khi lắc lại dịch pha loãng, dùng pipette vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu nhỏ lên giữa đĩa thạch. Dùng que cấy trang vô trùng gạt giọt dịch trải đều khắp cho tới khi mặt thạch khô ráo. Sau đó đem để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ và đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chú ý cần phân biệt các khuẩn lạc lạ hình thành do tạp nhiễm và không tính chúng. Tính kết quả cfu/ml(g) = a*1/K*1/V A: số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng. V: thể tích dịch pha loãng đƣợc cấy trên mặt đĩa thạch. K: độ pha loãng của dịch cấy. Lƣu ý: xem xét số khuẩn lạc ở 3 nồng độ pha loãng kế tiếp nhau(ví dụ 10-5, 10 -6 , 10 -7). Khi nồng độ pha loãng giảm 10 lần, số khuẩn lạc trên đĩa cũng giảm xấp xỉ 10 lần và trên 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng chỉ chênh lệch nhau khoảng 10%. 29 điều đó chứng tỏ việc tách rời các tế bào, pha loãng cũng nhƣ dàn đều chúng trên mặt thạch diễn ra hoàn hảo và số liệu thu đƣợc là đáng tin cậy. 30 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trƣởng của các chủng đã phân lập trong môi trƣờng rỉ đƣờng 6 0 B Chúng tôi đem 4 chủng nấm men phân lập đƣợc từ 4 nguồn mẫu khác nhau nuôi trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B với thời gian nuôi cấy là 36 giờ nhằm tìm chủng có khả năng phát triển tốt nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo đƣợc thuận lợi hơn. Số liệu thu đƣợc ban đầu có đơn vị tính là tb/ml (phụ lục Bảng 7.1) sẽ chuyển đổi về giá trị logarit để xử lý thống kê. Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) Mẫu Chế phẩm Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 8,450 8,204 8,459 8,566 Lần 2 8,332 8,061 8,130 8,415 Trung bình 8,391 8,133 8,295 8,491 Qua Bảng 4.1 cho thấy số lƣợng tế bào nấm men thuộc các chủng phân lập giảm dần theo thứ tự sau: Nho: 8,491 Chế phẩm: 8,391 Đu đủ: 8,295 Men bánh mì: 8,133 Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.1). Các loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cũng đồng hóa vật chất nhƣ nhau. Có thể nói, các loài khác nhau (dù là một giống) đồng hóa các nguồn 31 dinh dƣỡng là khác nhau nên tốc độ sinh trƣởng của chúng trên cùng một điều kiện nuôi cấy là khác nhau. Do đó, tuy các chủng phân lập từ 4 nguồn mẫu trên đều thuộc giống Saccharomyces nhƣng khi nuôi cấy trong cùng điều kiện môi trƣờng rỉ đƣờng 60B thì số lƣợng tế bào của chúng khác nhau là hợp lý. Dựa theo số liệu ở Bảng 4.1, chúng tôi chọn 2 chủng đƣợc phân lập từ nho và chế phẩm làm đối tƣợng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi nhuộm xem hình thái và thử nghiệm các phản ứng lên men đƣờng, chúng tôi xác định đƣợc chủng nấm men phân lập từ dịch quả nho thuộc loài S. cerevisiae, chủng phân lập từ chế phẩm sinh học (tên thƣơng mại là Ultra Levure) thuộc loài S. boulardii. Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levur