Khóa luận Khảo sát sự tác động của Auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp Alkaloid của cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) In Vitro

ợng trực tiếp người ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ được dung dịch có màu để định lượng alkaloid. 22 2.7.5. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid hiện đại 2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp (HPLC)  Nguyên lí hoạt động: phương pháp này dựa theo tính chất hấp thụ, sự phân bố hay trao đổi ion của chất tan (chất phân tích) với pha tĩnh ở trong cột để tách các chất. Vì dùng hạt pha tĩnh kích thước rất nhỏ (3 - 10 µm) để tăng số đĩa lí thuyết cho cột và để cân bằng giữa pha tĩnh và pha động được thiết lập nhanh, nên phải dùng bơm hoặc khí ép có áp suất cao để đẩy pha động đi được nhanh. Cột tách phải bằng thép không gỉ để chịu được áp suất cao (400 - 600 atm) và có đường kính 1 - 4 mm. Thể tích dung dịch mẫu khoảng vài đến vài chục µl (được tiêm vào phía trên cột). Nếu dùng máy tự ghi sẽ thu được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất [31].  Ƣu điểm - Kĩ thuật phân tích hiện đại, hiện nay được sử dụng khá phổ biến trong các lĩnh vực nghiên cứu, kiểm nghiệm, tách các chế phẩm đa thành phần. - Cho kết quả nhanh, tốt cả về mặt định tính lẫn định lượng. 2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản (CE) [13]  Nguyên lý hoạt động: Phương pháp phân tích này dựa theo nguyên tắc di chuyển của những chất tích điện trong một điện trường nhờ vào hai nguyên tắc cơ bản sau: quá trình điện di (electromigration) và quá trình điện thẩm (electroosmose). + Sự dịch chuyển điện di là sự di chuyển của các cấu tử mang điện trong dung dịch về điện cực ngược dấu. + Dòng điện thẩm biểu diễn một dòng chất điện ly lớn gây nên bởi thành mao quản bên trong được tích điện và thế áp đặt. Khi đặt điện thế các cation trong dung dịch điện ly gần thành mao quản di chuyển về phía catod, kéo dung dịch điện ly đi theo chúng. Điều này tạo thành một dòng điện thẩm thấu hướng về phía catod Mẫu có thể được bơm vào trong hệ thống nhờ áp suất hoặc điện áp. Dưới tác dụng của điện áp cao, các cấu tử đi qua một cửa sổ của mao quản, một detector UV – DAD chọn lọc – bước sóng phát hiện chúng và truyền một tín hiệu điện tỉ lệ với độ hấp thu của mẫu đến máy ghi, tích phân kế hay máy tính. Các tín hiệu này sẽ 23 được vẽ dưới dạng được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất. Kĩ thuật điện di mao quản được sử dụng để phân tích nhiều loại mẫu : acid amin, protein, đoạn DNA, acid nucleic và đặc biệt thích hợp cho việc phân tích các chất quý giá có hoạt tính sinh học.  Ƣu điểm Lượng mẫu đòi hỏi rất bé 5 - 30 µl, với thể tích bơm mẫu thực sự chỉ 10 - 50 nl, ngưỡng phát hiện thấp. Thời gian phân tích mẫu ít hơn so với các phương pháp truyền thống khác, thời gian phân tích cơ bản chỉ cần vài phút, trường hợp đặc biệt lên đến 30 phút. Xác định được danh tính và nồng độ các phân tử trong hỗn hợp dựa vào chất chuẩn.  Các yếu tố có khả năng ảnh hƣởng đến kết quả phân tích trên CE - Khi sử dụng dung dịch đệm có pH quá cao hay quá thấp gây ra tính không đồng nhất của điện tích bề mặt thành cột làm ảnh hưởng đến sự phân tách các cấu tử mẫu. - Nhiệt độ thay đổi dẫn đến thay đổi độ nhớt và dòng điện thẩm (EOF) cũng ảnh hưởng đến quá trình tách chất. - Điện thế sử dụng bị thay đổi làm thay đổi tương ứng thời gian lưu. Kĩ thuật sắc kí lỏng cao áp (HPLC) và kĩ thuật điện di mao quản (CE) đều là những phương pháp có độ chính xác cao. Tuy nhiên CE có nhiều ưu điểm hơn về mặt thời gian phân tích, dung môi hóa chất sử dụng và giá thành cho một lần thử nghiệm. 2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cƣờng sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật [26] Zenk và cộng sự (1977) đã kiểm tra sự sản xuất serpentine, một loại indole alkaloid trên những môi trường cơ bản khác nhau, kết quả cho thấy lượng serpentine tạo ra phụ thuộc vào thành phần môi trường đã sử dụng. Trong tất cả môi trường đã sử dụng, môi trường MS là thích hợp nhất cho sự tạo thành alkaloid này thông qua nuôi cấy huyền phù tế bào Catharanthus roseus [21]. Trong các thành phần của môi trường chứa chất kích thích sinh trưởng, auxin và kinetin có ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát triển và trao đổi chất ở thực vật. Ví dụ như auxin được thêm vào môi trường để kích thích tạo ra mô sẹo nhưng thêm một lượng ít. 24 2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao Những đặc tính sinh lý học của mỗi loại tế bào thực vật không phải lúc nào cũng giống nhau, Zenk cùng cộng sự ở Đức đã thu được dòng tế bào Trường xuân hoa chứa hàm lượng ajmalicine và serpentine cao [21]. Điều này cũng tương tự như việc phân lập đơn khuẩn lạc. Tiếp sau những kết quả của họ, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp tạo dòng như là một con đường hứa hẹn để gia tăng các chất chuyển hóa. 2.8.2. Xử lý với Elicitor Mẫu cấy thực vật nhiễm vi sinh vật có thể tạo ra sự tổng hợp các chất thứ cấp đặc trưng. Nấm là tác nhân gây bệnh được hiểu rõ nhất, nó có các phân tử điều hòa như glucan polymer, glycoprotein và các acid hữu cơ trọng lượng phân tử thấp. DiCosmo và Towers [26] đã xét về sự tương quan giữa stress và sự trao đổi chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy. Các yếu tố gây stress được ứng dụng thông qua chu trình nuôi cấy hoặc như là một yếu tố gây sốc chính tại một vài điểm của chu trình nuôi cấy để làm tăng lượng alkaloid tích lũy. Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng những phân tử hữu cơ và vô cơ có thể tác động đến sự tích lũy các sản phẩm thứ cấp như vanadyl sulphate tác động đến sự tích tụ indole alkaloid trong nuôi cấy Catharanthus roseus. Những chất khác có thể kích thích sự tích lũy alkaloid trong cây Trường xuân hoa gồm có sodium chloride, potassium chloride, abscisic acid và sorbitol. Những quy trình này với việc tận dụng những elicitor đơn giản và rẻ tiền hứa hẹn cho sản xuất tế bào thực vật quy mô công nghiệp. 2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp hay những hợp chất liên quan đôi khi cũng làm kích thích sự sản xuất các chất thứ cấp. Phương pháp này rất có lợi nếu giá thành của các tiền chất không đắt. Từ khi Chan và Staba [26] thử nghiệm sản xuất alkaloid bằng cách này vào thập niên 60, nhiều thí nghiệm 25 tương tự cũng đã được thực hiện. Ví dụ như, amino acid đã được thêm vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất tropane alkaloid, indole alkaloid, ephedorin và vài hiệu quả kích thích đã được quan sát. Thật sự thì amino acid là tiền chất của những alkaloid khác nhau, nhưng các bước sinh tổng hợp từ amino acid thành alkaloid rất phức tạp đến nỗi người ta nghi ngờ rằng có hay không việc các amino acid được kết hợp trực tiếp để tạo thành alkaloid trong nuôi cấy tế bào. Có lẽ, các amino acid không chỉ tác động lên sự sinh tổng hợp trực tiếp các alkaloid với vai trò như một tiền chất mà còn tác động gián tiếp thông qua những con đường trao đổi chất khác trong tế bào [26]. 2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học Thay vì bổ sung những tiền chất vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, thì người ta còn có thể sử dụng các cơ chất thích hợp để chuyển hóa thành sản phẩm mong muốn trong tế bào thực vật. Phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong lên men công nghiệp bằng việc sử dụng vi sinh vật và các enzym của chúng. Công ty Allelix Inc. ở Canada (Misawa và cộng sự, 1988) đã thiết lập quy trình sản xuất một loại thuốc chống u bướu rất đắt tiền là vinblastine từ catharanthine và vindoline. Cũng quan tâm đến việc sản xuất những hợp chất liên quan đến vinblastine, Bede và DiCosmo (1992) cho rằng sự chuyển hóa catharanthine và vindoline thành anhydrovinblastine là nhờ sử dụng enzyme peroxidase và glucose oxidase để kết hợp vindoline và catharanthine [6]. Tóm lại, tiến trình chuyển hóa liên quan đến sự bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy là một trong những phương án thiết thực nhất xét về phương diện thương mại trong nuôi cấy mô thực vật. Tuy nhiên việc kiếm được những tiền chất không đắt vẫn là vấn đề chính. Do đó việc nuôi cấy mô thực vật tạo ra nhiều tiền chất như catharanthine và vindoline là rất đáng quan tâm. 26 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Nội dung nghiên cứu Nội dụng 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA trên môi trường nuôi cấy. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 29/1/2007 đến 13/08/2007 tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro 3.3.1. Vật liệu 3.3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus). Nguồn mẫu để tiến hành thí nghiệm trong đề tài này được thu từ cây trồng trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học. Các cây Trường xuân hoa có độ tuổi từ 1 năm đến 1 năm rưỡi, cây khỏe và cho hoa đẹp. 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô như tủ cấy vô trùng, autoclave, bình tam giác, đĩa petri, bình nuôi cấy 500 ml, dao cấy, đèn cồn, máy đo pH, cân phân tích… 3.3.2. Điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS (Murashiga & Skoog, 1962) có bổ sung các hormone tăng trưởng BA, NAA, IAA tùy thí nghiệm. Điều kiện phòng nuôi in vitro: nhiệt độ: 24 ± 2oC, ẩm độ: 55 % - 60 %, chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng là 1000 - 2000 lux. 27 3.3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro theo thời gian trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA Thí nghiệm được tiến hành để xác định giai đoạn cây sinh trưởng tạo rễ tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA. Vì NAA thường được sử dụng ở nồng độ 0,5 mg/l cho nhiều loại cây nuôi cấy mô nên nồng độ này được chọn để thực hiện trong thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, gồm 9 cây in vitro. Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Hormone NAA 0,5 mg/l 1 2 - + (-) không có NAA trong môi trường nuôi cấy (+) có NAA trong môi trường nuôi cấy Số nghiệm thức: 2 Tổng số mẫu: 270 mẫu Để đánh giá tác động của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro, tiến hành đo chiều cao của cây - được tính từ chóp lá cao nhất đến gốc của cây, ghi nhận sự thay đổi về chiều dài rễ và số rễ được tạo thành trên cây. Đơn vị tính là mm. Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy. 3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Thí nghiệm được tiến hành với mục tiêu xác định nồng độ và loại chất kích thích sinh trưởng thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích cây tạo rễ. Thí nghiệm thực hiện trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (NAA, IAA) với các nồng độ 0,1 mg/l, 0,5 mg/l, 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l tùy từng nghiệm thức. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố, 6 nghiệm thức cho mỗi loại chất kích thích sinh trưởng với nghiệm thức 1 là đối chứng. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 9 cây in vitro. 28 Thí nghiệm 2a: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) 1(Đ/C) 0 2 0,1 3 0,5 4 1 5 5 6 10 Số nghiệm thức: 6 Tổng số mẫu: 162 mẫu Thí nghiệm 2b: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Nồng độ IAA (mg/l) 1(Đ/C) 0 2 0,1 3 0,5 4 1 5 5 6 10 Số nghiệm thức: 6 Tổng số mẫu: 162 mẫu 29 Các chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây (mm): được tính từ chóp lá cao nhất đến gốc của cây. - Chiều dài rễ (mm): được tính từ gốc cho đến phần tận cùng của rễ và tính theo chiều dài của rễ dài nhất. - Số rễ/cây: chỉ tính số rễ chính trên một cây. 3.3.4. Phƣơng pháp tiến hành Tạo nguyên liệu ban đầu Mẫu cấy: mẫu chồi nách được cắt từ cây Trường xuân hoa ngoài thiên nhiên và được khử trùng bề mặt với javel có nồng độ chlor là 38 g/lít được pha loãng với nước theo tỉ lệ 1/4 trong 20 phút, rửa sạch 3 – 5 lần với nước vô trùng, sau đó mẫu được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MS. Nhân chồi từ đoạn thân mang chồi bên và chuẩn bị mẫu thí nghiệm Sau 2 tuần vô mẫu, tách chồi và cấy chuyền trong tủ cấy vô trùng. Chồi được tái nuôi cấy thường xuyên để tăng số lượng chồi cho mô cấy. Cắt mỗi đoạn thân dài khoảng 2 cm từ cây con in vitro, trên môi trường MS có mang một nách lá cắm vào môi trường có NAA, IAA để kích thích cho cây ra rễ. 3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA trên môi trƣờng nuôi cấy 3.4.1. Vật liệu 3.4.1.1. Mẫu kiểm tra Cây Trường xuân hoa in vitro đã qua nuôi cấy ở nội dung 1. 3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg Bình lóng 100 ml Bình tam giác Dụng cụ thủy tinh Máy đông khô Tủ âm 20oC, tủ mát 4 oC Pipet, máy xay sinh tố 30 3.4.1.3. Hóa chất Hoá chất chiết alkaloid HCl 1 N Chloroform CH3Cl NH4OH 25% Methanol Cyclohexan Isopropyl alcohol Acid acetic 0,01 M Hóa chất định tính alkaloid Thuốc thử Wagner: Hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 100 ml nước cất. Hoá chất sử dụng cho máy CE Amonium acetate 0,2 M NaOH 0,1 M Nước khử ion Các chất chuẩn để chạy máy CE Vinblastine sulfate, vincristine sulfate, catharanthine, vindoline 3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner Thí nghiệm 1a: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có NAA bằng thuốc thử Wagner Mục tiêu của thí nghiệm là kiểm tra sự hiện diện của alkaloid trong cây nuôi cấy mô sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có và không có bổ sung NAA và xác định giai đoạn cây Trường xuân hoa in vitro sản xuất nhiều alkaloid nhất. Chỉ tiêu theo dõi: quan sát phản ứng của dịch chiết alkaloid khi có mặt của thuốc thử. Phản ứng dương tính khi có vòng nhẫn màu nâu đỏ, nếu alkaloid nhiều có thể quan sát thấy kết tủa. 31 Thí nghiệm 1b: Định tính alkaloid trong thân lá và rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có chứa IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner Thí nghiệm được tiến hành để xác định chất kích thích sinh trưởng với nồng độ thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích cây sản xuất nhiều alkaloid nhất. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát phản ứng của dịch chiết alkaloid trong từng bộ phận cây nuôi cấy mô trên môi trường MS có bổ sung IAA, NAA ở nồng độ khác nhau khi có mặt của thuốc thử. 3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định quy trình ly trích tốt nhất các alkaloid trong cây Trường xuân hoa. Các mẫu ly trích thu thập từ cây Trường xuân hoa trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học. Dịch chiết alkaloid sẽ được xác định hàm lượng bằng CE. Quy trình ly trích được chọn sẽ sử dụng cho các thí nghiệm sau. Chỉ tiêu theo dõi Để đánh giá hiệu quả của hai quy trình ly trích, so sánh hàm lượng alkaloid thu được từ dịch chiết cây Trường xuân hoa in vivo sau khi phân tích bằng CE, dựa vào alkaloid chuẩn. Công thức tính hàm lượng alkaloid dựa vào chất chuẩn C alkaloid (mg/l) = x* Cc* S alkaloid /Sc x: độ pha loãng của mẫu Cc: nồng độ của chất chuẩn (ppm) Sc: diện tích của píc chuẩn 3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây Trƣờng xuân hoa in vivo Thí nghiệm được thực hiện để so sánh hàm lượng alkaloid có trong mẫu thu được từ cây nuôi cấy mô - in vitro và cây ngoài tự nhiên - in vivo. Từ đó đánh giá hiệu quả của việc sử dụng cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô sản xuất các hợp chất 32 mong muốn. Mẫu cây Trường xuân hoa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS và mẫu cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi kể từ khi hạt nảy mầm trong vườn ươm được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm này. Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo và cây in vitro được xác định bằng CE sau quá trình ly trích. 3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE Mục tiêu của thí nghiệm là xác định được hàm lượng catharanthine, vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng ở nồng độ thích hợp (đã xác định ở thí nghiệm 1b) qua các giai đoạn. Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng alkaloid thu được từ cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trưởng (7, 14, 21, 28, 35 ngày). 3.4.3. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trƣờng xuân hoa Phương pháp định tính qua 2 bước sau: - Chiết alkaloid ra khỏi tế bào thực vật bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm: mẫu vật liệu khô được xay nhuyễn và cân khoảng 2 gram bột tẩm kỹ với dung dịch NH4OH, để khô ngoài không khí, dùng 15 ml chloroform cho vào nguyên liệu, đậy nút ngâm trong 24 giờ. Sau đó mang đi lọc, dịch lọc được cô đặc và trích lại bằng dung dịch H2SO4 loãng (Nguyễn Ngọc Hồng, 2004). - Định tính bằng thuốc thử: nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết alkaloid, sẽ xuất hiện lượng kết tủa khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng alkalod trong mẫu phân tích. 3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trƣờng xuân hoa  Quy trình 1: Ly trích alkaloid từ vật liệu tƣơi Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu cây Trường xuân hoa Thu mẫu cây Trường xuân hoa, rửa sạch, để ráo nước. 33 Bƣớc 2: Ly trích alkaloid (xem sơ đồ 3.1) Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi [11].  Quy trình 2: Ly trích alkaloid từ vật liệu khô Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu cây Trường xuân hoa Mẫu cây được rửa sạch, để ráo nước và mẫu được trữ trong tủ âm 20oC ít nhất 30 phút trước khi đem đông khô. Sau khi đông khô mẫu được bảo quản trong tủ hút ẩm để tránh làm ảnh hưởng đến quá trình phân tích mẫu sau này. Bƣớc 2: Ly trích alkaloid (xem sơ đồ 3.2) Dịch chiết isopropanol Nguyên liệu tươi (0,6 g) Dịch chiết nước acid Dịch chiết nước acid Nghiền với 4 ml isopropanol Lắc 15 phút, lọc bỏ bã Thổi khô bằng khí nitơ Thêm 1 ml acid acetic 0,01M Thêm 1 ml cyclohexan, votex Loại lớp cyclohexan ( lặp lại 2 lần) Thổi khô bằng khí Nitơ Thêm 0,2 ml acid acetic 0,01M 34 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô [19]. 3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lƣợng alkaloid bằng CE Dịch chiết alkaloid sau quá trình ly trích được sử dụng trong phân tích bằng CE với các thông số sau [11]: - Cột mao quản silica 72 cm với đường kính 50 µm. - Dung dịch đệm ammonium acetat 0,2 M, pH 6,2. - Điện thế sử dụng để phân tích mẫu là 10 Kv. - Thời gian bơm mẫu là 3 giây ở 25 mbar, 25oC. Bột nguyên liệu (100 mg) Dịch chiết HCl Dịch chiết CHCl3 Cắn alkaloid Dịch chiết alkaloid 1 ml chloroform + 80 µl NH4OH đậm đặc  pH = 9 Lắc trên máy lắc 30 phút (250 vòng/phút) Votex 3 lần Ly tâm 13.000 vòng, 10 phút ở 5oC 2 ml methanol Bốc hơi tới khô Chiết bằng 1,5 ml HCl 0,1N Votex 30s Lắc trên máy lắc 30 phút (250 vòng/phút) Ly tâm 6000 vòng, 10 phút ở 5oC 35 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát khả năng sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro theo thời gian trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA Mẫu được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường MS có và không có bổ sung NAA (0,5 mg/l). Sau mỗi thời gian nuôi cấy, cây được đo chiều cao, chiều dài rễ và đếm số rễ. Kết quả được trình bày trong bảng 4.1, 4.2 và 4.3. Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình (mm) 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 27,4a 40,0a 45,2a 47,1a 49,7a 2 0,5 26,3 a 37,0 a 44,7 a 47,1 a 51,1 a P 0,36 0,09 0,72 0,98 0,40 CV (%) 16,1 16,9 11,9 14,2 12,7 * Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05) Kết quả phân tích thống kê cho thấy chiều cao trung bình của các nghiệm thức trên môi trường có và không có bổ sung NAA không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Chiều cao trung bình của cây Trường xuân hoa sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy lần lượt là 26,9; 38,5; 44,9; 47,1; 50,4 mm (phụ lục 2). Như vậy khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy không ảnh hưởng lên chiều cao cây. 36 Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều dài rễ trung bình (mm) 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 0,00a 2,22a 5,22a 5,63a 7,59a 2 0,5 0,00 a 7,59 b 5,77 b 10,07 b 12,44 b P 0,00 0,01 0,00 0,00 CV (%) 11 13,2 14,1 14,2 * Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Số rễ trung bình 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 0,00a 2,22a 3,00a 4,74a 8,33b 2 0,5 0,00 a 3,19 b 4,22 b 6,11 b 6,04 a P 0,00 0,00 0,00 0,00 CV (%) 19,6 9,2 13,5 11,4 * Đ/C: đối chứng môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột và các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự tác động của NAA là rất có ý nghĩa lên chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro. Cây được nuôi trên môi trường có bổ sung NAA tạo rễ dài hơn so với cây đối chứng và chiều dài rễ tỉ lệ thuận so với thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên sự tác động của NAA lên số rễ của cây có sự khác biệt 37 giữa các giai đoạn nuôi cấy (Bảng 4.3), trên môi trường có bổ sung NAA cây có số rễ cao nhất là sau 28 ngày nuôi cấy. Ở giai đoạn này cây có số rễ và chiều dài rễ dài gấp 1,5 lần so với cây sau 21 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, sau 35 ngày nuôi cấy số rễ của cây trên môi trường có NAA giảm dần. Điều này chứng tỏ khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy cây tạo rễ tốt nhất ở giai đoạn 28 ngày tuổi. Vì các tiền chất alkaloid được sản xuất nhiều ở rễ nên giả thiết đặt ra là hàm lượng alkaloid đạt được cao nhất ở cây 28 ngày tuổi nên thí nghiệm tiếp theo được theo dõi ở giai đoạn này. 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình (mm) Số rễ trung bình Chiều dài rễ trung bình (mm) 1 (Đ/C) 0 51,9ab 2,93c 4,19c 2 0,1 51,8 ab 3,00 c 5,22 d 3 0,5 55,7 b 4,19 e 5,48 de 4 1 55,9 b 3,67 d 5,63 e 5 5 49,5 a 1,93 b 2,44 b 6 10 49,3 a 0,67 a 1,11 a P 0,02 0,00 0,00 CV (%) 17,1 19,8 17,5 * Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone * Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Trong các nghiệm thức thí nghiệm thì sự bổ sung NAA ở nồng độ 0,5 mg/l và 1 mg/l tác động tốt lên chiều cao trung bình của cây nhưng khi nồng độ này quá 38 cao (5 – 10 mg/l) sẽ làm giảm khả năng phát triển của cây. Kết quả này cũng phù hợp với sự tác động của NAA lên sự hình thành rễ. Nồng độ tạo rễ tốt nhất trong thí nghiệm này là NAA 0,5 mg/l với số rễ trung bình là 4,19 trong khi ở nghiệm thức 6 (NAA = 10 mg/l) số rễ tạo thành là thấp nhất 0,67 (Bảng 4.4). Bên cạnh đó quan sát thấy ở nồng độ NAA cao (5 mg/l, 10 mg/l) có sự phát sinh mô sẹo ở phần gốc cây (Hình 4.1) bởi vì nồng độ auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự tạo sẹo (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Như vậy tác động của NAA phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, việc thay đổi nồng độ NAA trong môi trường nuôi cấy dẫn đến sự khác biệt về khả năng tạo rễ ở cây nuôi cấy mô. Ở thí nghiệm này nồng độ NAA thíc