Khóa luận Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào sừng người trong điều kiện In Vitro

lại với nhau, tạo thành một khối thống nhất [11]. Các khối tế bào hình thành ở lớp hạt di chuyển lên trên bề mặt da, các tế bào này ngưng phân chia hoàn toàn, chúng lắng lại. Các protein liên kết chéo ở dưới màng tế bào chất tạo thành một lớp vững chắc bao bọc các tế bào này, hình thành Lê Quang Hưng Trang 20 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu nên các hạt nhỏ dẹt chứa lipit, các hạt lipit được nhô ra trên lớp bao bọc. Điều này giải thích cho việc hình thành một lớp bảo vệ không thấm nước ở biểu bì, giúp ngăn chặn sự mất nước không điều hòa. Lớp tiền bảo vệ này gồm hai thành phần chính : (1) tiền protein bao bọc hóa sừng giàu lysine và glutamin, (2) Các hạt dẹt mỏng chứa đầy các lớp đôi lipit. Khi các tế bào đi vào pha cuối của biệt hóa, một dòng Ca2+ đựơc tuôn ra, hoạt hóa enzyme chuyển hóa glutamin, liên quan về mặt sinh học với protein biểu bì hóa sừng thông qua cầu nối isopeptide và chúng sẽ hoạt hóa sự đẩy ra của các lớp đôi lipit lên trên mạng lưới. Sau khi sản xuất xong các sản phẩm trên, các tế bào ngừng sao mã và các hoạt động trao đổi chất. Sau đó, tế bào đi vào chương trình chết tương tự như apoptosis. Các tế bào để lại xác của mình tạo thành một lớp vảy mỏng là các tấm sừng chắc chắn, không thấm nước. Các lớp vảy sừng này cuối cùng bị tróc ra khỏi bề mặt da và được thay thế tiếp tục bằng các lớp tế bào bên trong đang di chuyển dần lên [18]. Hình 2.16 Sự di chuyển và biệt hóa của tế bào sừng ở biểu bì Lê Quang Hưng Trang 21 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu II.3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN TẾ BÀO SỪNG Hiện nay, có nhiều phương pháp tách biểu bì ra khỏi trung bì và thu những tế bào biểu bì đơn. Sau đây là một số phương pháp thông dụng: • Mẫu sinh thiết da khoảng 5cm2 rửa trong dung dịch muối và ủ bằng Dispase ở 37oC trong 30-40 phút, sau đó chuyển biểu bì vào dung dịch trypsin và ủ tại 37oC trong 10 phút [9]. • Mẫu da đặt trong dung dịch Dipase, ủ trong 18 giờ tại 2-8oC. Tách biểu bì ra khỏi trung bì cho vào ống ly tâm chứa 2ml Trypsin-EDTA (0,25%-0,02mM) ủ ở 37oC trong 10-12 phút. • Ủ mẫu da trong dung dịch Trypsin 0,25%-EDTA 0,02% tỷ lệ 1:4, ủ ở 4oC trong khoảng 16-20h [10]. • Ủ mẫu mô qua đêm với dung dịch Trypsin 0,17%, sau đó xử lý tiếp trong dung dịch Trypsin-EDTA (0,25%-0,02mM) để tách thành những tế bào đơn [5]. • Ủ mẫu mô với dung dịch Trypsin 0,25%-EDTA 0,02% tỷ lệ 1:4 ở 37oC trong 2 giờ, sau đó tách phần trung bì và biểu bì, thu nhận tế bào sừng [4]. II.3.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI TẾ BÀO SỪNG Môi trường nuôi tế bào sừng đã được phát triển cách đây gần 25 năm từ khi hệ thống nuôi tế bào sừng được thiết lập. Môi trường cơ bản đầu tiên được sử dụng để tạo dòng tế bào bất tử và nuôi cấy sơ cấp và thứ cấp tế bào sừng trên lớp nâng đỡ nguyên bào sợi có bổ sung huyết thanh động vật. Trong hệ thống cơ bản này, tế bào sừng có thể được cấy chuyền cho đến khi chúng được 20-50 thế hệ. Gần đây có một số môi trường cải tiến từ môi trường cơ bản, nhưng vẫn dựa trên huyết thanh động vật và lớp nâng đỡ nguyên bào sợi [4]. Lê Quang Hưng Trang 22 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu II.3.4.1 MÔI TRƯỜNG CÓ HUYẾT THANH Huyết thanh động vật thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy như một nguồn dinh dưỡng cho tế bào phát triển. Nguồn huyết thanh tốt nhất là huyết thanh bào thai bò (FCS), huyết thanh bò mang thai (FBS). Trong môi trường nuôi cấy, huyết thanh hoạt động như một đệm pH; cung cấp hormon, nhân tố tăng trưởng cần cho chức năng tế bào; chứa những protein cần cho sự ổn định và phân tán hormon, chất dinh dưỡng đến tế bào; cung cấp chất ức chế các protease… Tuy nhiên huyết thanh không được xem là chất tốt nhất để tạo nên một môi trường tối ưu cho sự tăng trưởng và biểu hiện chức năng của tế bào do chúng ta khó xác định được nguồn gốc tự nhiên của huyết thanh, dễ bị biến đổi thành phần, dễ bị nhiễm các tác nhân vi nấm, virus,… có thể gây hại đến sức khoẻ người nghiên cứu lẫn bệnh nhân được chữa trị. Ngoài ra, một vài nhân tố trong huyết thanh (như lipoprotein có tỷ trọng cao (HDL), lipoprotein có tỉ trọng thấp (LDL), vitamin C…) không bền khi bảo quản lâu dài ở nhiệt độ thấp. Huyết thanh còn kích thích sự biệt hoá của những tế bào tiến tới trạng thái không phân bào nguyên nhiễm, làm cho những tế bào này không duy trì như một dòng tế bào bất tử. Nồng độ huyết thanh thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào sừng là 5%, 10%, và 20% [25]. II.3.4.2 FEEDER NGUYÊN BÀO SỢI Phương pháp này đầu tiên được mô tả bởi Rheinwald và Green (1979), dựa trên sự nuôi cấy đồng thời tế bào sừng với nguyên bào sợi bị chiếu xạ. Nguyên bào sợi chuột của dòng tế bào 3T3 lấy từ khối u của chuột nhắt bị chiếu xạ liều cao để các tế bào này không tăng sinh nhưng vẫn tiết ra một số chất giúp cho sự tăng trưởng của tế bào sừng. Nguyên bào sợi chuột được nuôi cấy trong môi trường D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium) có nồng độ glucose cao, bổ sung 10% FBS, Penicillin/ Streptomycin (100 UI/ml-100 μg/ml), dung dịch đệm bicarbonate sodium 1N với một lượng phù hợp tế bào được chiếu xạ. Khi những tế bào này tạo được 50% mật độ trong đĩa nuôi cấy, được sử dụng như một giá thể trực tiếp cho việc nuôi cấy tế Lê Quang Hưng Trang 23 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu bào sừng. Môi trường nuôi cấy tế bào sừng là hỗn hợp tỷ lệ 3:1 của môi trường DMEM (nồng độ glucose cao) và môi trường Ham’s F12 bổ sung 10% FBS. ợi chuột Hình 2.17 Nguyên bào s Hiện nay, với sự tiến bộ của kỹ thuật mô, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều loại màng nhân tạo, bán nhân tạo bằng polymer, collagen… cũng được sử dụng như một lớp nâng đỡ, tạo điều kiện tốt cho sự tăng trưởng của tế bào sừng [18]. II.3.4.3 MÔI TRƯỜNG KHÔNG HUYẾT THANH Do những hạn chế của môi trường nuôi cấy có bổ sung huyết thanh, nhiều nhà khoa học mong muốn tìm ra những hệ thống môi trường mới.Tiến sĩ Richard G. Ham và cộng sự lần đầu tiên thiết lập một hệ thống nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường in vitro mà không sử dụng huyết thanh hay lớp nâng đỡ. Trong môi trường nuôi cấy mới này, có sự thay đổi cả số lượng lẫn chất lượng các thành phần cơ bản như: các acid amin, các nguyên tố vi lượng, nguyên tố đa lượng, các vitamin, các ion, …[31]. Mặt khác, cần phải bổ sung vào môi trường cơ bản không có huyết thanh các thành phần như: EGF, insulin, transferrin, độc tố tả, hydrocortisone, dịch trích tuyến yên bò (BPE), nhằm cho phép sự tăng trưởng, tăng sinh của tế bào sừng. Tuy nhiên, môi trường nuôi cấy mới này có những hạn chế: số lượng lần cấy chuyền sau khi nuôi sơ cấp tế bào sừng trong những môi trường này thì ít hơn (chỉ khoảng 15-25 thế hệ) so với hệ thống môi trường có bổ sung huyết thanh, để tế bào sừng tăng sinh mạnh trong nuôi cấy sơ cấp và tăng số lần cấy chuyền thì cần phải bổ sung BPE và một số thành phần có nguồn gốc từ động vật khác. Những thành phần này rất hiếm và khá đắt và cũng là những thành phần không xác định, dễ bị nhiễm khuẩn [20]. Lê Quang Hưng Trang 24 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu Hiện nay trên thị trường có nhiều môi trường nuôi cấy chuyên biệt tế bào sừng không bổ sung huyết thanh như: môi trường MCDB 151, MCDB 153, MCDB 154, môi trường Epilife…. Trong đó, môi trường Epilife là môi trường cơ bản nuôi cấy cả sừng và những tế bào biểu bì khác. Trong môi trường Epilife, tế bào sừng tăng trưởng, tăng sinh mạnh, khoảng thời gian sống dài và có thể tạo được 45-60 thế hệ [19]. II.3.4.4 MÔI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG NHÂN TỐ TỪ THỰC VẬT Sự tồn tại môi trường nuôi cấy tế bào sừng được bổ sung những chất có nguồn gốc từ động vật hay lớp nâng đỡ có nhiều bất lợi do chúng khá đắt, dễ bị nhiễm các tác nhân như vi nấm, virus,.. có thể gây hại đến sức khoẻ cả người nghiên cứu lẫn người được điều trị [25]. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện ra những chất chiết từ thực vật , không có nguồn gốc từ động vật (APF: animal product- free) có thể thay thế cho những chất có nguồn gốc từ động vật mà vẫn có thể làm tăng trưởng và lan rộng cả tế bào sừng biểu bì người mới sinh hay trưởng thành. Sử dụng hệ thống nuôi cấy APF này, tế bào sừng có thể được nhân giống tới 55 thế hệ sau khi đã nuôi cấy sơ cấp và ít bị nhiễm. Kết quả thí nghiệm đã chứng minh được hệ thống môi trường APF có thể sử dụng để nuôi cấy sơ cấp những tế bào động vật từ mô. Đó là môi trường nuôi cấy tế bào sừng mới không sử dụng albumin huyết thanh, transferrin, FBS, BPE hay lớp nâng đỡ. Hệ thống môi trường APE thật sự cho phép những nhà y sinh và những nhà thử nghiệm lâm sàng có thể sử dụng tế bào sừng người hay những sản phẩm từ tế bào sừng trong chữa trị vết thương hay trong các protocol trong liệu pháp gen. Những chất chiết có nguồn gốc từ thực vật là hỗn hợp của những nhân tố tăng trưởng và hormon hình thành hỗn hợp bổ sung nồng độ 100X, gọi là môi trường bổ sung cho sự tăng trưởng tế bào sừng người (Human Keratinocyte Growth supplement-V2 (HKGS-V2) [25]. Lê Quang Hưng Trang 25 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu Thí nghiệm so sánh khả năng tăng trưởng của tế bào sừng nuôi cấy sơ cấp trong môi trường cơ bản có bổ sung HKGS-V2 với môi trường cơ bản có bổ sung những thành phần cần cho sự tăng trưởng sừng có chứa dịch trích tuyến yên bò (BPE). Tỷ lệ tăng trưởng của tế bào sừng trong môi trường Epilife bổ sung HKGS- V2 bằng hay cao hơn tỷ lệ tăng trưởng của tế bào sừng cũng trong môi trường Epilife bổ sung BPE truyền thống [25]. II.3.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN TẾ BÀO SỪNG Ngày nay, người ta đã tìm hiểu được vai trò của các hormon và các nhân tố tăng trưởng lên sự tồn tại, tăng sinh và biệt hóa của tế bào sừng. Tế bào sừng được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng không bổ sung huyết thanh, sau đó người ta tiến hành khảo sát các yếu tố bằng cách bổ sung các thành phần cần thiết và các yếu tố cần khảo sát vào môi trường. Tiến hành quan sát sự phát triển và biệt hóa của tế bào sừng trong môi trường in vitro đó [4]. II.3.5.1 HORMONE VÀ CÁC NHÂN TỐ TĂNG TRƯỞNG Các hormone thường được khảo sát trên tế bào sừng là Insulin. Thông thường trong môi trường nuôi cấy không có huyết thanh, người ta bổ sung một số hormone: Insulin, … và EGF điều khiển sự tăng trưởng tế bào sừng. EGF là một protein được sản xuất từ tá tràng và tuyến nước bọt, có thể thúc đẩy sự tăng sinh tế bào và kích thích sự tăng trưởng mới ở da cũng như ở bề mặt ruột và màng sừng [6]. Tuy nhiên, nhược điểm của nhân tố này là khá đắt. Trên màng của tế bào sừng người chứa receptor của insulin-giống nhân tố tăng trưởng (IGF-IR). Trong suốt sự phát triển bình thường của tế bào, hoạt động của IGF-IR làm tăng khả năng tăng sinh của tế bào [25]. Hydrocortisone và một số hormon khác ảnh hưởng đến kích thước của quần thể tế bào và sự vắng mặt của chúng làm quần thể giảm đi một cách đáng kể [3]. II.3.5.2 VAI TRÒ CỦA CANXI Ion Ca2+ ảnh hưởng đến sự biệt hoá và tăng trưởng của tế bào sừng. Thay đổi nồng độ ion Ca2+ ngoại bào trong nuôi cấy mô in vitro có thể điều chỉnh được quá Lê Quang Hưng Trang 26 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu trình tăng sinh và phân tầng của tế bào sừng. Sự điều chỉnh này tương ứng với sự điều chỉnh sinh lý bình thường như trong cấu trúc biểu bì, có sự chênh lệch nồng độ ion Ca2+ rõ ràng giữa những tế bào của lớp đáy so với những tế bào lớp trên. Khoảng nội bào giữa những tế bào sừng lớp đáy có nồng độ Ca2+ thấp, ngược lại với khoảng trống giữa những tế bào lớp cao hơn. Nồng độ ion Ca2+ thấp thích hợp thúc đẩy sự tăng sinh và nồng độ cao làm giảm sự biệt hoá của tế bào sừng [11]. Trong nuôi cấy in vitro, số lượng tế bào tăng nhanh khi nồng độ Ca2+ giữa 0,03- 0,1mM. Trong môi trường nuôi DMEM, số lượng tế bào tăng khi nồng độ Ca2+ khoảng 0.03-0.1 mM. Nếu tăng nồng độ ion này sẽ làm giảm số lượng tế bào [11]. II.3.6 ỨNG DỤNG CỦA VIỆC NUÔI TẾ BÀO SỪNG II.3.6.1 TRONG Y HỌC Nghiên cứu cơ bản về tế bào sừng là tìm cách phát hiện các tế bào gốc biểu bì, từ đó định hướng tới khả năng cuối cùng là việc thu nhận tế bào sừng có khả năng phân chia mạnh từ mẫu da của bệnh nhân, nhân chúng lên rồi cấy ghép lên lại để chữa trị các bệnh về da hay các vết thương. Hình 2.18 Chứng loét da Lê Quang Hưng Trang 27 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu Một ứng dụng lâm sàng nổi bật nhất của việc nuôi cấy tế bào sừng là lấy vùng da khác của bệnh nhân đưa vào tái lập lại vùng biểu mô bị hủy, các vết thương sâu hay các vết loét. Sự thuận lợi của phương pháp này đó là có thể sử dụng chính nguồn da của bệnh nhân để tái lập da trong thời gian tốt nhất. Do đó, kỹ thuật cấy ghép da được sử dụng nhiều nhất là dùng những mảnh biểu bì từ vùng da lành của người bệnh. Phương pháp này được đánh giá là hiệu quả nhưng nó bị hạn chế bởi phải sử dụng nguồn da của bệnh nhân ở vùng lành, điều này có thể gây ra một số chấn thương khác cho người bệnh.Việc sử dụng tế bào sừng trong nuôi cấy cho phép đem lại một bề mặt bao phủ rộng hơn rất nhiều và chỉ đòi hỏi một vùng da nhỏ để làm nguồn tế bào nuôi cấy. Hạn chế của phương pháp này là cần phải có một thời gian cần thiết để tế bào sừng mọc và tăng trưởng trong điều kiện in vitro, trong thời gian đó, bệnh nhân rất dễ bị nhiễm khuẩn qua vùng da bị hư hại hay qua miệng vết thương. Ngoài ra, mảnh biểu mô trong nuôi cấy rất mỏng manh và có thể không bám dính tốt vào vết thương hay bề mặt bị bỏng. Trong quá trình tái lập da mới, các mảnh da có được từ nuôi cấy có chức năng tạo cân bằng biểu mô từ đó giúp tăng sinh các tế bào sừng, tăng cường sự bám dính vào vết thương hay vết bỏng, tạo một lớp bao phủ tạm thời, tránh nguy cơ lây nhiễm. Nếu tế bào sừng có thể tăng trưởng trên vết thương, chúng sẽ tạo thành một lớp bao phủ tạm thời, giúp vết thương mau lành và tái thiết lập da bình thường cho người bệnh mà không để lại sẹo [6]. Trong những thử nghiệm lâm sàng gần đây, cấy ghép da nuôi cấy đã được ứng dụng cho nhiều loại bệnh và tổn thương về da khác nhau như: những vết loét do bệnh tiểu đường, bệnh Leukoderma, vết xăm, và nhất là bỏng. Có thể chia nguồn gốc của những loại tế bào da nuôi cấy: dùng da đồng loại, dùng da tự thân. Trong cả hai loại, mảnh da sử dụng ghép lên vết thương được tạo ra bằng cách nuôi cấy tế bào sừng hay nguyên bào sợi hay kết hợp cả hai loại tế bào. Ngoài ra hiện nay còn sử dụng da dị loại để nuôi cấy [3]. Lê Quang Hưng Trang 28 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu II.3.6.2 TRONG NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ Trước đây các dược phẩm bôi da hay mỹ phẩm được thử trên da động vật, sau đó thử trên người tình nguyện trước khi đưa sản phẩm vào thử nghiệm rộng rãi. Gần đây, nhờ nuôi cấy mô và tế bào biểu bì, người ta tạo ra mô da người từ những tế bào biểu bì và dùng để thử dược phẩm và mỹ phẩm. Điều này giúp tiết kiệm thời gian, tiết kiệm ngân sách cũng như đảm bảo an toàn cho người tham gia thử nghiệm [1]. II.3.6.3 TRONG LIỆU PHÁP GEN Việc cấy ghép tế bào biểu bì và nhất là tế bào gốc biểu bì còn có một ứng dụng khác, đó là được sử dụng trong nghiên cứu và thử nghiệm liệu pháp gen. Người ta tiến hành nuôi cấy các tế bào biểu bì thu nhận được từ người có rối loạn dị tật biểu mô và sau đó khảo sát đột biến của gen hay các biểu hiện gen lặn ở mức độ phân tử, từ đó đưa ra một phương pháp điều trị hiệu quả cho người bệnh. Các tế bào gốc biểu bì được sử dụng để dần thay thế những nơi dị tật. Hình 2.19 Gen Math-1 chuyển vào tế bào sừng biểu hiện đốm Lê Quang Hưng Trang 29 Luận văn Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương II Tổng quan tài liệu Những sai sót di truyền hay các đột biến được sữa chữa bằng liệu pháp gen và trình tự đính sẽ được đưa trở lại tế bào bằng bacteriophage hay bằng phương pháp chuyển gen nhờ lentivirus. Tế bào sừng đã đựoc sữa chữa sẽ được nhân lên trong môi trường in vitro đến mật độ cần thiết, sau đó tiến hành cấy trở lên lại bệnh nhân, thay thế dần vùng da bị đột biến. Việc sử dụng tế bào gốc biểu bì trong liệu pháp gen đem lại những triển vọng to lớn trong việc chữa trị hiệu quả những căn bện di truyền hay các đột biến về da ở người. Đây là một hướng triển vọng mà rất nhiều nhà khoa học trên thế giới đang tiến tới. II.3.7 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC Tình hình nghiên cứu ngoài nước (phân tích, đánh giá) Năm 1960 Cruickhanh và cộng sự, năm 1967 Briggaman và cộng sự, năm 1970 Yuspa và cộng sự, năm 1971 Fusenig ...đã có nhiều nghiên cứu nuôi tế bào sừng. Năm 1978, Liu và Karasek thực hiện nuôi cấy tế bào trên màng collagen. Năm 1975, Rheinwald và Green đã nuôi cấy tế bào sừng trên lớp đơn 3T3. Năm 1983, Paul W. Cook và cộng sự tiến hành nuôi cấy tế bào sừng trên môi trường nuôi cấy khác nhau chứa các hợp chất: BSA (bovine serum albumin), transferrin, serum (FBS)...và lớp feeder nguyên bào sợi. Năm 1993, Wantanabe K và cộng sự đã thử nghiệm nuôi cấy tám loại tế bào trên màng BC (Bacteria Cellulose) để so sánh với hiệu quả khi nuôi trên đĩa nhựa Petri. Tính đến tháng 7/2006 đã có 2429 công trình nghiên cứu liên quan đến tế bào sừng (NCBI Database). Tình hình nghiên cứu trong nước (phân tích, đánh giá) Nuôi tế bào sừng là kỹ thuật tương đối mới ở Việt Nam, chưa có một công trình nghiên cứu nào được công bố ứng dụng nuôi cấy tế bào sừng. Lê Quang Hưng Trang 30 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học CHÖÔNG III VAÄT LIEÄU PHÖÔNG PHAÙP Lê Quang Hưng Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp III.1. VẬT LIỆU III.1.1. Dụng cụ • Khay inox • Lưỡi dao phẫu thuật No.22 (SAFRI) và Cán dao phẫu thuật No.4 (SAFRI) • Kéo thẳng và kéo cong (SAFRI) • Kẹp thẳng và kẹp cong (SAFRI) • Becher 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500ml, 1000 ml • Ống tiêm và kim tiêm (VINAHANKOOK) loại 1cc, 5cc, 10cc • Đĩa petri thủy tinh (d=10 cm) • Đĩa nuôi tế bào (COSTAR, kích thước 35x10 mm) • Đĩa nuôi tế bào 4 giếng (NUNC) • Đĩa nuôi tế bào 96 giếng (CORNING) • Erlen 50 ml, 100 ml, 250 ml • Đèn cồn • Ống đong • Bình định mức 500 ml, 1000 ml • Gòn không thấm • Gòn thấm nước • Bình xịt cồn 700 • Cá khuấy từ • Pipette thủy tinh 5 ml, 10 ml • Micropipette 2-20 µl,10 – 100 µl và 100 – 1000 µl (FINNPIPETTE) • Đầu tip (10 – 100 µl, 100 – 1000 µl) Lê Quang Hưng Trang 31 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp • Eppendorf 2,0 ml • Buồng đếm hồng cầu (NEUBAUER) • Lame, lamelle • Găng tay phẫu thuật vô trùng (MERUFA) • Màng lọc Minisart có đường kính lỗ lọc 0,20 µm (SARTORIUS) • Màng Parafilm (PM-999) • Lọ thủy tinh chứa mẫu • Bóp cao su III.1.2. Thiết bị • Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II (NUAIRE TMBio-Safety Cabinet Class II) • Tủ ấm CO2 (NUAIRE TM DH Autoflow, SANYOTM Incusafe) • Tủ mát (ALASKA® BD-800) • Tủ lạnh – 20oC (LG® GR-051SF) • Tủ sấy dụng cụ (SNIKE®) • Kính hiển vi đảo ngược (OLYMPUS® CK40) • Kính hiển quang học (OLYMPUS® CH30) • Kính hiển vi và hệ thống vi thao tác (NIKON® Eclipse TE300, Narishige) • Máy đo pH (WTW®) • Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA® WERKE) • Máy ảnh (PANASONIC® DMC-FZ30) • Máy ly tâm (MIKRO® 22) • Cân điện tử (HR®-200) • Autoclave (DAIHAN®) • Máy cất nước 2 lần Lê Quang Hưng Trang 32 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp Đèn cồn Đầu típ Pipette thủy tinh Dao phẫu thuật Bóp cao su Kéo thẳng Micropipette Kẹp thẳng Găng phẫu thuật Màng lọc khuẩn Màng Parafilm Erlen Đĩa nuôi Tủ nuôi tế bào Tủ thao tác Máy ly tâm Máy khuấy từ Cân điện tử Lọ đựng mẫu Buồng đếm tế bào Lê Quang Hưng Trang 32 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp III.1.3. Quy trình vô trùng dụng cụ Vô trùng dụng cụ và hóa chất Dụng cụ • Dụng cụ bằng thủy tinh và kim loại được xử lý bằng nước javel sau khi sử dụng, ngâm cồn 700 trong 12 giờ, vô trùng bằng cách hấp khử trùng hơi nước với autoclave (121oC, 1 atm trong 30 phút). Bảo quản trong tủ chứa dụng cụ vô trùng. • Dụng cụ nhựa được xử lý bằng nước javel sau khi sử dụng, ngâm cồn 700 trong 12 giờ, để khô tự nhiên và chiếu UV 30 phút trước khi sử dụng. Hóa chất • Hóa chất được khử trùng theo quy định của nhà sản xuất, tùy theo từng loại mà có phương pháp khử trùng khác nhau. Vô trùng hệ thống phòng làm việc Khu vực thao tác • Lau bề mặt làm việc của tủ thao tác bằng cồn 700, chiếu UV trong 30”. • Đặt dụng cụ thao tác thí nghiệm như: đèn cồn (đã khử trùng bề mặt bằng cồn 700), dụng cụ thí nghiệm, hóa chất (hấp khử trùng hoặc lọc tùy theo quy trình pha chế) vào trong tủ thao tác. • Chiếu UV tủ thao tác 1 lần nữa sau khi đã sắp xếp xong dụng cụ, hóa chất. Trang phục bảo hộ • Quần áo blouse, khẩu trang, nón, vớ, giày bảo hộ được treo trong tủ áo phòng thí nghiệm, chiếu UV tủ áo trong 30 phút. Lê Quang Hưng Trang 33 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp III.1.4. Hóa chất • Môi trường D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) • Môi trường Defined Keratinocyte-SFM (Serum_Free Medium) • Dispase II 0,5% • Trypsin 0,25% • EDTA 1% • Trypsin/EDTA • Penicillin • Streptomicin • Gentamycin • Povidine Iod 10% (Betadine) • Huyết thanh bò mang thai (FBS- Fetal Bovine Serum) • Yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF-Epithelium Growth Factor) • NaHCO3 • PBS (-) (Phosphate Buffer Saline) • Trypan blue 0,4% • Cồn 700 • Cồn 900 • Nước cất 2 lần • Nước javel Lê Quang Hưng Trang 34 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp Trypsin Huyết thanh bò mang thai D’MEM Defined Keratinocyte –SFM Betadine Trypan Blue Lê Quang Hưng Trang 35 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp III.1.5. Chuẩn bị hóa chất Trước khi tiến hành thí nghiệm, hóa chất được chuẩn bị như sau: III.1.5.1. Dung dịch PBS (-) (không có ion Ca2+ và Mg2+) Bảng 1. Công thức pha dung dịch PBS (-) Thành phần Hàm lượng (g) NaCl 8 g KCl 0,25 g Na2HPO4 1,44 g KH2PO4 0,25 g Nước cất vừa đủ 1000 ml • Chuẩn pH đến 7,20; hấp vô trùng ở 1210C, 1 atm trong 20 phút • Bảo quản kín ở nhiệt độ phòng (<300C) • Lưu ý: Ủ 370C trước khi dùng, không đông đá hoặc giữ ở nhiệt độ >390C Sử dụng trong vòng 30 ngày kể tính từ lần sử dụng đầu tiên. III.1.5.2. Dung dịch Dispase II Bảng 2. Công thức pha Dispase II 0,5% Thành phần Hàm lượng (g) Dispase II (Sigma) 0,25 g PBS (-) vừa đủ 50 ml • Lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 0,20µm. • Dispase II 0,05% được bảo quản trong tối ở 40C. Lê Quang Hưng Trang 36 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp III.1.5.3. Dung dịch thu mẫu Bảng 3. Công thức pha 200 ml dung dịch thu mẫu Thành phần Thể tích (ml) Streptomycin 100 mg/ml 0,8 ml Penicillin 200.000 IU/ml 0,4 ml PBS (-) vừa đủ 200 ml • Dung dịch PBS (-) bổ sung kháng sinh với nồng độ Penicillin 400 IU/ml và Streptomycin 400 µg/ml. • Lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 0,20µm. • Bảo quản kín ở nhiệt độ phòng (<300C) • Lưu ý: Không nên pha trộn các loại kháng sinh với nhau, trừ Pen/Strep. Sử dụng trong vòng 30 ngày kể tính từ lần sử dụng đầu tiên. III.1.5.4. Môi trường D’MEM (Dulbecco’ Modified Eagle Medium) Bảng 4. Công thức pha 200 ml môi trường D’MEM Thành phần Hàm lượng (g) D’MEM (Sigma) 2,0 g NaHCO3 0,74 g Nước cất 2 lần 180 ml • Chỉnh pH môi trường đến 7,4 bằng dung dịch HCl 1N. • Thêm nước cất 2 lần vào dung dịch cho đủ 200 ml. • Lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 0,20µm.. • Lưu ý: Môi trường D’MEM được bảo quản ở 40C. Lê Quang Hưng Trang 37 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp III.1.5.5. Môi trường D’MEM bổ sung 5% huyết thanh Bảng 5. Công thức pha 50 ml môi trường D’MEM bổ sung 5% huyết thanh Thành phần Thể tích (ml) D’MEM (Sigma) 47,5 ml FBS 2,5 ml • Lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 0,20µm.. • Lưu ý: Môi trường D’MEM 5% FBS được bảo quản ở 40C. III.1.5.6. Môi trường D’MEM bổ sung 10% huyết thanh Bảng 6. Công thức pha 50 ml môi trường D’MEM bổ sung 10% huyết thanh Thành phần Thể tích (ml) D’MEM 45 ml FBS 5 ml • Lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 0,20µm.. • Lưu ý: Môi trường D’MEM 10% FBS được bảo quản ở 40C. III.1.5.7. Môi trường D’MEM bổ sung 20% huyết thanh Bảng 7. Công thức pha 50 ml môi trường D’MEM bổ sung 20% huyết thanh Thành phần Thể tích (ml) D’MEM 40 ml FBS 10 ml • Lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 0,20µm.. • Lưu ý: Môi trường D’MEM 20% FBS được bảo quản ở 40C. Lê Quang Hưng Trang 38 Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhân Khoa học Chương III Vật liệu Phương pháp III.1.5.8. Dung dịch Penicillin/Streptomycin 200X Bảng 8. Công thức pha 50 ml dung dịch Penicillin/Streptomycin 200X Thành phần Thể tích (ml) Penicillin G 1.000.000 I