Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của các cao petroleum ether từ nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps sinensis)

....................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... Xác nhận của Giảng Viên LỜI CẢM ƠN Đề tài được thực hiện và hoàn thành tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ với sự hướng dẫn của thầy Bùi Xuân Hào và thầy Đặng Hoàng Phú. Trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài, em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Đặng Hoàng Phú và thầy Bùi Xuân Hào đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chia sẻ những kinh nghiệm, truyền đạt kiến thức chỉ dẫn tận tình, chu đáo, tạo mọi điều kiện để hoàn thành tốt đề tài này. Cảm ơn các anh chị, các bạn trong phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ đã chia sẻ, giúp đỡ và hỗ trợ rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn. i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................................... 1 1.1. Giới thiệu chung về cây Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps sinensis) ........................... 1 1.1.1. Tên gọi .............................................................................................................. 1 1.1.2. Nguồn gốc ......................................................................................................... 1 1.1.3. Mô tả thực vật ................................................................................................... 2 1.1.4. Phân bố ............................................................................................................. 2 1.1.5. Trồng trọt, thu hái ............................................................................................. 3 1.2. Thành phần hóa học ....................................................................................................... 3 1.3. Hoạt tính sinh học .......................................................................................................... 8 2. THỰC NGHIỆM .................................................................................................................. 9 Điều kiện thực nghiệm .................................................................................................... 9 Giới thiệu chung............................................................................................................ 10 Tiến hành thực nghiệm ................................................................................................. 10 Sơ đồ quá trình cô lập các hợp chất .............................................................................. 11 Quá trình cô lập phân đoạn P3.1 ................................................................................... 12 3. KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN ................................................................................................... 13 KẾT LUẬN PHỤ LỤC ii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên ................................................................. 2 Hình 1.2: Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200m trên mực nước biển tại Tibet .......................................................................................................................................... 3 Hình 2.1: Cấu trúc hợp chất CS ............................................................................................. 13 iii DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất CS so sánh với hợp chất 22-hydroxyisohopane trong dung môi chloroform-d. ................................................................................................ 14 Sơ đồ 2.1: Quá trình cô lập các hợp chất .............................................................................. 11 iv DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT PE Petroleum ether D Doublet (Mũi đôi) Dd Doublet of doublets (Mũi đôi - đôi) S Singlet (Mũi đơn) SKLM Sắc ký lớp mỏng SKC Sắc ký cột NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Hz, MHz Hertz, Megahertz ppm Part per million J Hằng số ghép 𝛿 Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton 1H) 13C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbon 13C) v DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1.1: Phổ 1H NMR của hợp chất CS trong dung môi chloroform-d Phụ lục 1.2: Phổ 13C NMR của hợp chất CS trong dung môi chloroform-d vi LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển, chất lượng cuộc sống con người ngày càng được nâng cao nhất là nhu cầu về sức khỏe. Việc tìm kiếm và sử dụng các loại dược liệu quý với nguồn gốc từ thiên nhiên đang được quan tâm và rất phổ biến. Đông trùng hạ thảo là một trong số các dược liệu quý đó, đã được sử dụng lâu đời trong lịch sử Đông y. Đông trùng hạ thảo là một dạng kí sinh giữa loài nấm túi Cordyceps với ấu trùng của một số loài côn trùng. Ngoài ra, Đông trùng hạ thảo còn được biết đến với các ứng dụng trong y học như: điều trị ho, điều trị bệnh ở thận, suy nhược, tăng cương chức năng hệ miễn dịch, Do vậy, việc nuôi trồng và phân tích các thành phần hoạt tính sinh học từ Đông trùng hạ thảo để thu được các hợp chất có tính ứng dụng trong các lĩnh vực đã và đang được các nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, việc nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo còn gặp nhiều khó khăn về cơ sở vật chất và kiến thức. Vì vậy, đề tài này nhằm nghiên cứu cấu trúc, khảo sát thành phần hóa học của cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis). vii PHẦN 1: TỔNG QUAN 1 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung về cây Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps sinensis) 1.1.1. Tên gọi Đông trùng hạ thảo (Chinese caterpillar fungus), còn gọi là trùng thảo, hạ thảo đông trùng hay đông trùng hạ thảo, là một loại đông dược quý có bản chất là dạng ký sinh của loài nấm Cordyceps sinensis (thuộc nhóm Ascomycetes) trên cơ thể sâu Hepialus fabricius [1]. C. sinensis còn được gọi là “nấm sâu bướm” vì thực chất nó kí sinh trên ấu trùng (sâu non) của các loài bướm thuộc bộ Cánh vẩy [2]. Vào cuối mùa thu, các chất trên biểu bì của sâu non ngày đêm tương tác với các bào tử nấm và hình thành các sợi nấm đâm sâu vào ấu trùng. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát triển mạnh và gây chết vật chủ, sau đó hình thành quả thể, phát triển và chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu vật chủ [3]. Do đó có nó tên là Đông trùng hạ thảo vì mùa đông nấm sống trên cơ thể côn trùng, mùa hè lại phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ [4]. Nấm C. sinensis được phân loại như sau: [5] Giới: Fungi Phân giới: Dikarya Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipitaceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps sinensis 1.1.2. Nguồn gốc Đông trùng hạ thảo là hiện tượng loài sâu thuộc chi Hepialus trong tổng Họ Lepidoptera (Cánh bướm) bị kí sinh bởi một loài nấm túi có tên khoa học là Cordyceps sinensis (Berk) thuộc tổng Họ Ascomycetes (Nang Khuẩn). Thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus Fabricius hoặc Hepialus Armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh [1,6]. 2 1.1.3. Mô tả thực vật Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae. Hiện nay người ta đã tìm thấy hơn 680 loài trong chi Cordyceps, nhưng thuật ngữ Cordyceps thường được đề cập chính xác loài C. sinensis [7]. Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sấy khô, nó có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm [8]. Phần lá có hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4 - 11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành. Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0.3 – 0.8 cm. Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn [1]. Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất. Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút. Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà [1]. Hình 1.1: Nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 1.1.4. Phân bố Cordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo ) là một loại nấm dược liệu quý hiếm, nổi tiếng ở Trung Quốc và được sử dụng trong Y học cổ truyền Trung Hoa hàng ngàn thế kỷ qua. Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo hay các loài thuộc chi Cordyceps phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng của môi trường. Nó phân bố rộng rãi khắp Trung Quốc, 3 cao nguyên Tây Tạng, Bhutan, Nepal và vùng đông bắc Ấn Độ, ở độ cao 3500 – 5000m so với mực nước biển [4]. Hình 1.2: Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200m trên mực nước biển tại Tibet Và theo một số nghiên cứu cho thấy, các loài của chi nấm Cordyceps còn được tìm thấy ở Thái Lan, Nhật Bản và Việt Nam [8]. Như vậy, có thể thấy thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo khá phong phú ở trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều loài có phạm vi phân bố rộng, các loài có đặc điểm phân bố đặc hữu cho từng vùng. 1.1.5. Trồng trọt, thu hái C. sinensis được Cục Quản lý thực phẩm và dược phẩm hoa Kỳ xem như một loại thực phẩm chức năng [9], vì vậy nhu cầu mua bán loài nấm này trên thị trường rất phổ biến và ngày càng tăng ở nhiều quốc gia. Tuy nhiên, với mức độ phổ biến của C. sinensis đã dẫn đến việc khai thác quá mức và hậu quả là sự cạn kiệt nguồn tài nguyên này trong tự nhiên [10]. Do đó, các nhà nghiên cứu đã nỗ lực tìm cách nuôi trồng C. sinesis trong môi trường nhân tạo nhằm đáp ứng nhu cầu sản xuất với quy mô lớn [10]. Hiện nay, nhờ áp dụng các phương pháp nuôi cấy lên men hiện đại như công nghệ nuôi cấy trong lò phản ứng sinh học (bioreactor) [9], người ta đã có thể dễ dàng cô lập được các chủng nhân tạo từ nấm thiên nhiên, đáp ứng nhu cầu của con người và góp phần bảo tồn nguồn tài nguyên thiên niên [11]. 1.2. Thành phần hóa học Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của Đông trùng hạ thảo có 17 đến 19 loại acid amin khác nhau: lipid và nhiều nguyên tố vi lượng (Na, K, Ca, Mg, 4 Al, Mn, Cu, Zn, Bo, Fe... trong đó cao nhất là P [12]. Đông trùng hạ thảo còn chứa nhiều loại vitamin (trong 100 g đông trùng hạ thảo có 0.12 g vitamin B12; 19 mg vitamin A; 116.03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K...), ngoài ra còn có khoảng 25 - 30 % protein, 8% chất béo và đường mannitol [1]. Bằng các phương pháp sắc ký, phổ nghiệm, các thành phần hóa học của Cordyceps tự nhiên được phân lập bao gồm: polysaccharide, cordycepin acid, glutamic acid, acid amin, polyamines, saccharide và các dẫn xuất đường, steroid, nucleotide và nucleoside, 28 acid béo bão hòa và không bão hòa,....[1].  Polysaccharide Công trình của Xiao JH. năm 2008 về cấu trúc hóa học của polysaccharide trong nấm Cordyceps [13]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Guan đã đề ra phương pháp “Saccharide mapping” để phân tích định tính các polysaccharide trong C. sinensis [14]. J. Guan và các cộng sự cho rằng các monomer tạo thành polysaccharide trong nấm chủ yếu thông qua các liên kết (1→4)-𝛽, (1→4)-𝛼, (1→6)- 𝛼-glucosidic và (1→4)- 𝛽-D-mannosidic [15]. Một loạt các phương pháp như methyl hóa, giảm cấp Smith, aceto-giải, thủy giải trong môi trường acid và phổ NMR đã được thực hiện để xác định các đặc trưng về cấu trúc của D-glucan tìm thấy trong C. sinensis với khung sườn bao gồm các đơn vị (1→4)-D-glucosyl liên kết với nhau và một đơn vị (1→6)-D-glucosyl phân nhánh [16]. Cấu trúc của một mannoglucan trung hòa (tỉ lệ mol của các đơn vị Man và Glc là 1:9) cũng được xác định bằng các phương pháp phân tích hóa học và phổ nghiệm cho thấy nó bao gồm khung sườn 𝛼-D-glucan với các liên kết (1→4) và (1→3) và mạch nhánh là các (1→6)- 𝛼-D-mannopyranosyl liên kết với mạch chính thông qua O-6 của các đơn vị (1→3)- 𝛼-D-glucopyranosyl [17]. Từ quả thể C. sinensis, bằng cách chiết với nước nóng và phân đoạn với ethanol, người ta thu được galactomanan với cấu trúc bao gồm mạch chính mannan chứa các đơn vị (1→2)- 𝛼-D-mannopyranosyl và mạch nhánh galactosyl chứa các đơn vị (1→3), (1→5), (1→6)-D-galactofuranosyl [18]. Ngoài ra, bằng phương pháp sắc ký ghép nối đầu dò khối phổ GC-MS, thành phần các carbohydrate được chiết tách từ cả C. sinensis tự nhiên và nhân tạo đều được xác định, bao gồm 10 monosaccharide (rhamnose, ribose, arabinose, xylose, mannose, glucose, galactose, mannitol, fructose và sorbose) [18]. 5  Nucleosides Nucleosides là một trong những thành phần chính trong Cordyceps. Năm 1964, 3-deoxyadenosine, cụ thể là cordycepin, được phân lập từ Cordyceps militaris [11], một loài liên quan thường được sử dụng thay thế C. sinensis. Kể từ đó, hơn 10 nucleoside và các hợp chất liên quan của nó đã được phân lập từ Đông trùng hạ thảo bao gồm: adenine, adenosine, uracil, uridine, guanine, guanosine, hypoxanthine, inosine, thymine, thymidine, deoxyuridin [1]. R=NH2: adenine guanine R=OH: hypoxanthine Xylose Rhamnose Arabinose Mannose Ribose Fructose Sorbose Galactose D-mannosidic R=H: uracil R=CH3: thymine 6 R=NH2: adenosine R=OH: inosine R=NHCH2CH2OH: N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine Guanosine  Amio acids Tổng hàm lượng acid amin trong sợi nấm lên men được xác định là 9.23%, thấp hơn so với Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên (18.10%). Ba acid amin chính trong quả thể nấm là acid glutamic, acid aspartic, arginine, và hàm lượng của chúng lần lượt là 2.64–2.66%, 1.70–1.84% và 1.53–1.60% [1,20].  Steroid Ergosterol, một trong những thành phần hóa học từ tế bào của sợi nấm, là steroid chiếm phần lớn và được tìm thấy trong hầu hết các loại nấm [20]. Hàm lượng ergosterol trong chất nền của C. sinensis được tìm thấy là khoảng 0.92 g /L và cao hơn khoảng ba lần so với hàm lượng trong sinh khối [1]. myriocine cordycepin uridine ergosterol peroxide Ergosterol 7 Stigmasterol daucosterol Cholesterol cholesteryl palmitate Ergosteryl-3-O- 𝛽-D-glucopyranoside cereisterol campesterol 𝛽-sitosterol 8  Peptides Theo nghiên cứu, hơn 20% axit amin có thể được tìm thấy trong Cordyceps. Trong đó, một số hợp chất tiêu biểu như: Cyclodipeptides, Cordymin,...[1]. 1.3. Hoạt tính sinh học Nhiều hoạt chất trong Đông trùng hạ thảo có hoạt tính sinh học cao. Dưới đây là một số hợp chất có hoạt tính sinh học tiêu biểu:  Polysaccharides: là thành phần chủ yếu tạo nên hầu hết các hoạt tính sinh học của C. sinensis như: tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ gan, hạ huyết áp, tăng lipid trong máu, chống ung thư và chống oxy hóa,... [21,22].  Adenosine: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ thể. Giúp cải thiện tuần hoàn tim mạch, giảm sinh trưởng các tế bào thoái hóa và tăng lượng oxy trong máu,... [21].  Cordycepin: có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống virus, ngăn ngừa ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch,...[21].  Mannitol: với công dụng làm giảm mỡ, đường máu và cholesterol và phòng chống bệnh tim mạch,...[23].  Cordymin: Các peptide cordymin từ C. sinensis , có tác dụng bảo vệ thần kinh trong não thiếu máu do ức chế viêm và tăng hoạt động chống oxy hóa liên quan đến bệnh sinh bệnh, có thể được sử dụng như một tác nhân phòng ngừa tiềm năng chống lại chấn thương do thiếu máu cục bộ não [5].  Cordysinin: Năm cordysinin, A-E, từ sợi nấm của C. sinensis đã được xác định và đã được chứng minh là có hoạt tính kháng viêm và 1-(5-hydroxymethyl-2-furyl) β- carboline được chứng minh là ức chế đáng kể nhất anion superoxide thế hệ và elastase [7]. PHẦN 2: THỰC NGHIỆM 9 2. THỰC NGHIỆM Điều kiện thực nghiệm Việc nghiên cứu thành phần hóa học của cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo được thực hiện với các điều kiện sau:  Sắc kí cột - Silica gel pha thường (Merk, DC Kieselgel 60 F254).  Sắc kí lớp mỏng - Silica gel pha thường (Merk, DC Kieselgel 60 F254). - Silica gel pha đảo RP18 (Whatman, KC18F, 200𝜇𝑚).  Thuốc thử - Dung dịch vanillin.  Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân: - Máy Bruker Avance 500 [500 MHz (1H) và 125 MHz (13C)].  Máy ghi phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS: - Máy Bruker Micro OTOF-QII.  Đèn UV: - Máy Spectroline MODEL ENF-240C/FE (USA) hai bước sóng 254nm và 365nm.  Dung môi thực nghiệm: Là các dung môi chưng cất: - Methanol - n-Hexane - Ethyl acetate - Acetone - Chloroform  Phổ cộng hưởng từ của hợp chất CS1 và CS2 được ghi tại phòng phân tích trung tâm, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Tp.HCM.  Phổ HR-ESI-MS được ghi tại Viện hàn lâm khoa học và công nghệ, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Tp.HCM. 10 Giới thiệu chung Trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) được nuôi cấy ở Phòng thí nghiệm Sinh Hóa, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên. Sinh khối nấm được định danh bởi PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy, giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở, Tp.HCM. Tiến hành thực nghiệm Sinh khối nấm C. sinensis sau khi được chiết ngấm kiệt với ethanol. Dung môi được thu hồi dưới áp suất kém, thu được cao ethanol thô. Cao ethanol khô được hòa tan vào nước và trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi petroleum ether, ethyl acetate và n-butanol, thu được các cao tương ứng và dịch nước sau khi chiết. Cao petroleum ether (15.3 g), sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ giải ly n-hexane: ethyl acetate (độ phân cực tăng dần từ 0% - 100% ethyl acetate), thực hiện sắc ký bản mỏng thu được 250 lọ. Từ đây gom lại thành 10 phân đoạn (P1-10). Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành khảo sát phân đoạn P3. 11 Sơ đồ quá trình cô lập các hợp chất 250 g Sinh khối nấm 51.021 g Cao ethanol Cao ethyl acetate (0.247 g) Cao n-butanol (4.329 g) Cao nước (5.435 g) P3 (2.6172 g) Phân đoạn P3.1 (104.3 mg) CS (3.0 mg) Chiết ngấm kiệt với EtOH Thu hồi dung môi dưới áp suất kém Hòa tan vào nước chiết với dung môi: petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol Thu hồi dung môi dưới áp suất kém SKC (n-hexane : ethyl acetate) (0 → 100%) thu được 12 phân đoạn từ P3.1→ P3.12 Sắc kí điều chế H : CHCl3 (8:2) SKC (n-hexane : ethyl acetate) (0 → 100%) thu được 10 phân đoạn từ P1 → P10 Sơ đồ 2.1: Quá trình cô lập các hợp chất 12 Quá trình cô lập phân đoạn P3.1 Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của cao petroleum ether được trích ly từ nấm Đông trùng hạ thảo. Sắc kí cột hấp phụ trên silica gel cao petroleum ether (15.3 g) với hệ dung môi n- hexane : ethyl acetate có độ phân cực tăng dần (0→100% EtOAc), dựa trên sắc kí lớp mỏng hiện màu bằng dung dịch vanilin nung nóng gom thành 10 phân đoạn (P1 → P10). Sắc kí cột hấp phụ trên silica gel phân đoạn P3.1 (104.3 mg) với hệ dung ly n-hexane : chloroform có độ phân cực tăng dần (0→100% CHCl3), dựa trên sắc kí lớp mỏng hiện màu với dung dịch vanilin nung nóng thu được 5 phân đoạn (𝑃3.1.1 → P3.1.5). Thực hiện tách phân đoạn trên bản mỏng silica gel pha thường (Merk DC Kieselgel 60 F254) đối với phân đoạn P3.1.2 (11.6 mg) và phân đoạn P3.1.3 (27.9 mg). Sau đó tiến hành sắc kí bản mỏng điều chế với hệ dung môi giải ly n-hexane : chloroform : acid acetic (8 : 2 : 0.01) thu được hợp chất là CS. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 13 3. KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN Hợp chất CS thu được có đặc điểm sau: màu trắng, kết tủa vô định hình, tan trong dung môi chloroform. Sắc ký lớp mỏng với hệ giải ly H : CHCl3 : AcOH (9 : 1 : 0.01) cho 1 vết không hấp thu UV, hiện màu bằng dung dịch vanillin/H2SO4 nung nóng cho màu hồng. Phổ 1H NMR của hợp chất CS (phụ lục 1.1) cho thấy sự xuất hiện của 7 tín hiệu proton nhóm methyl tại δH (ppm) 0.76 (3H, s), 0.81 (3H, s), 0.82 (3H, s), 0.85 (3H, s), 0.96 (6H, s), 1.18 (3H, s), 1.21 (3H, s). Đây là các tín hiệu đặc trưng của khung lupan. Phổ 13C NMR (phụ lục 1.2) cho thấy sự xuất hiện 1 tín hiệu carbon gắn với oxygen tại 𝛿𝐶 (ppm) 73.6, 6 tín hiệu carbon nhóm methyl tại 𝛿𝐶 (ppm) 33.4, 21.5, 16.1, 16.7, 17.0, 15.8 và các tín hiệu carbon nhóm methylene, carbon tứ cấp tại 𝛿𝐶 (ppm) 18.7 – 54.0. Từ những dữ liệu phổ trên, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo của hợp chất 22- hydroxyisohopane cho thấy có sự tương đồng. Vậy cấu trúc của hợp chất CS2 được đề nghị là 22-hydroxyisohopane. Hình 2.1: Cấu trúc hợp chất CS 14 Bảng 2.1: Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất CS so sánh với hợp chất 22- hydroxyisohopane trong dung môi chloroform-d. Vị trí CS2 22-hydroxyisohopane δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 Tín hiệu của khung lupan (27H ở vùng δH 0.72 – 2.40) 40.3 Tín hiệu của khung lupan (27H ở vùng δH 0.72 – 2.40) 40.3 2 18.7 18.7 3 42.1 42.1 4 33.3 33.3 5 56.1 56.1 6 18.7 18.7 7 34.4 34.4 8 41.9 41.9 9 50.4 50.4 10 37.4 37.4 11 20.9 20.9 12 22.0 22.0 13 49.9 49.9 14 41.9 41.9 15 33.3 33.3 16 26.6 26.6 17 54.0 53.9 18 44.1 44.1 19 41.3 41.3 20 24.2 24.2 21 51.2 51.1 22 74.0 74.0 23 0.96 (6H, s) 33.4 0.95 (6H, s) 33.4 24 0.96 (6H, s) 21.6 0.95 (6H, s) 21.6 25 0.79 (3H, s) 16.1 0.79 (3H, s) 16.2 26 0.82 (3H, s) 16.7 0.81 (3H, s) 16.7 27 0.85 (3H, s) 17.0 0.81 (3H, s) 17.0 28 0.76 (3H, s) 15.8 0.76 (3H, s) 15.8 29 1.18 (3H, s) 30.8 1.18 (3H, s) 30.9 30 1.21 (3H, s) 33.4 1.21 (3H, s) 33.4 15 KẾT LUẬN Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học phân đoạn P3 cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis). Bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng trên silica gel pha thường và pha đảo, sắc kí bản mỏng điều chế đối với các hệ dung môi giải ly khác nhau đã cô lập hợp chất ký hiệu là CS. Thông qua các kết quả phân tích phổ nghiệm (1H NMR, 13C NMR) và so sánh với các tài liệu tham khảo, chúng tôi đã xác định được cấu trúc của hợp chất là: 22-hydroxyisohopane. 22-hydroxyisohopane Trong đó, hợp chất CS lần đầu tiên được cô lập ở chi Cordyceps. 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hui-Chen Lo,1 Chienyan Hsieh, 2 Fang-Yi Lin, 3 and Tai-Hao Hsu3, “A Systematic Review of the Mysterious Caterpillar Fungus Ophiocordyceps sinensis in Dong- ChongXiaCao (冬蟲夏草 Dōng Chóng Xià Cǎo) and Related Bioactive Ingredients”, J Tradit Complement Med, vol.3, no.1, pp. 16–32, 2013. 2. W. Chen, W. Zhang, W. Shen and K.Wang, “Effects of the acid polysaccharide fraction isolated from a cultivated Cordyceps sinensis on macrophages in vitro”, Cell. Immunol, vol. 262, no. 1, pp. 69-74, 2010. 3. J. S. Zhu, G. M. Halpern and K. Jones, “The Scientific Rediscovery of an Ancient Chinese Herbal Medicine: Cordyceps sinensis Part I”, J. Altern. Complement. Med, vol. 4, no. 3, pp. 289-303, 1998. 4. S. P. Li, F. Q. Yang and K. W. K. Tsim, “Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine”, J. Pharm. Biomed. Anal, vol. 41, no. 5, pp. 1571-1584, 2006. 5. J Wang, YM Liu, W Cao, KW Yao, ZQ Liu, JY Guo, “Anti-inflammation and antioxidant effect of cordymin, a peptide purified from the medicinal mushroom Cordyceps sinensis, in middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats”, Metab Brain Dis, vol.27, pp. 159–65, 2012. 6. G.D. Wang, “Cordyceps: Ecology Culture and Application”, Science & Technology Documents Publishing House, Beijing, 1995. 7. ML Yang, PC Kuo, TL Hwang, TS Wu, “Anti-inflammatory principles from Cordyceps sinensis”, J Nat Prod, vol. 74, pp. 1996–2000, 2011. 8. H. John, C. Matt, M Inc Aloha, SantaCruz, California, U.S.A, “Cordyceps. Wasser SP Institute of Evolution”, University of Haifa, Mt.Carmel, Haifa, Israel, 2005, thesis. 9. M. G. Shaashidhar, P. Giridhar, K. Udaya Sankar and B. Manohar: “Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement – A review”, J. Funct. Foods, vol. 5, no. 3, pp. 1013-1030, 2013. 17 10. J. C. Holliday, P. Cleaver, M. Loomis-Powers and D. Patel, “Analysis of quality and techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk) Sacc (Ascomycetes)”, Int. J. Med. Mushroom, vol. 6, pp. 151-164, 2004. 11. C. H. Dong and Y. J. Yao, “In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis”, LWT – Food Sci. Technol, vol. 41, no. 4, pp. 669-677, 2008. 12. FQ Yang, K Feng, J Zhao, SP Li, “Analysis of sterols and fatty acids in natural and cultured Cordyc