Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của trái chuối hột ( musa balbisiana colla ) họ musaceae

do cyclomusalenon[7]. Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 7 3. CÁC CHẤT ĐÃ ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CHUỐI HỘT CH2OH OH HOOC OH HOOC CHO OHC O OH O H (1) Công thức phân tử: C23H28O12 Khối lượng phân tử: 496 CH2OH OH HOOC OH OHC COOH O OH O H OH (2) Công thức phân tử: C23H30O12 Khối lượng phân tử: 498 Musabalbisianes A [14]: Musabalbisianes B [14]: Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 8 CH3 O (CH2)n CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2OH OH HOOC O HOH2C CH2OH HOH2C O OH O H O CH3 CH3 (3) Công thức phân tử: C28H40O12 Khối lượng phân tử: 568 (4) C3 (CH2)n O (CH2)n CH3 O (5) Musabalbisianes C[14]: Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 9 β- sitosterol[6]: (6) Công thức phân tử: C29H45O Khối lượng phân tử: 414 (7) Công thức phân tử: C29H48O Khối lượng phân tử: 412 Tinh thể hình kim không màu, mp. 1700C (ethanol) CH3 CH3 CH3 CH3CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3CH3 CH3 OH H H Stigmasterol[7]: Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 10 O OH OH OH OH (8) Công thức phân tử: C15H14O5 Khối lượng phân tử: 274 Tinh thể hình kim màu trắng. mp. 248-251 0C (ethyl acetate) [ 9 ] Công thức phân tử: C30H48O Khối lượng phân tử: 424 Là tinh thể hình kim màu trắng, mp. 133- 1350C ( CHCl3 ) Rf = 0.75, dung môi n-hexane/ ethyl acetate ( 90: 10 ) (+) – Epiafzelechin[8]: Cyclomusalenon[7]: Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 11 1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1. 1. Phương pháp phân nhóm[10] Để chiết tách các hợp chất tự nhiên ra khỏi mẫu cây bằng dung môi có thể dùng lần lượt các dung môi có tính phân cực tăng dần để chiết hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng dung môi là ancol ( ethanol hay methanol), vì loại dung môi này có khả năng thấm xuyên qua màng tế bào thực vật, cũng như có thể tạo nói hydrogen liên phân tử với các nhóm phân cực khác, nên được xem là dung môi vạn năng, có thể chiết lấy được cả các hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa và yếu. Trong mẫu cây có nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại rất phân cực đến loại không phân cực, vì thế muốn cô lập hợp chất mà áp dụng sắc ký cột trực tiếp ngay lên trên cao thô ban đầu sẽ rất khó đạt được kết quả mong muốn. Vì thế cần chia ra từng đoạn với độ phân cực khác nhau để cho quá trình cô lập chất được dễ dàng hơn. Muốn có các loại cao có độ phân cực khác nhau chỉ cần sử dụng các loại dung môi chiết có độ phân cực khác nhau, dựa trên nguyên tắc “ các chất giống nhau sẽ hòa tan nhau” Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết SoxhletChiết siêu âm là phương pháp chiết ngâm dầm cổ điển (Maceration) kết hợp với siêu âm. Tức là, ngâm mẫu cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của mẫu cây. Đặt bình chứa vào máy siêu âm, giữ ở nhiệt độ 60o trong 30 phút, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc của tế bào thực vật và hòa tan các chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa mẫu cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Dung môi thu hồi có thể được tiếp tục sử dụng cho các lần chiết sau. Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 12 1. 2. Phương pháp tinh chế 1.2. 1. Phương pháp kết tinh Trong hóa học các hợp chất tự nhiên, người ta mong muốn cô lập chất có độ tinh khiết cao. Do đó, sau khi thực hiện sắc ký nhiều lần cần tiến hành kết tinh lại hợp chất để đạt độ tinh khiết 90- 95%. Có thể thực hiện kết tinh phân đoạn nhờ vào độ hòa tan khác nhau của các chất trong một dung môi nào đó hoặc kết tinh nhờ vào nhiệt độ lạnh. 1.2. 2. Phương pháp sắc ký Phương pháp sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại chất đó với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh) Phương pháp sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography) dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ. Pha tĩnh là một lớp mỏng silica gel khoảng 25mm phủ lên bề mặt một tấm nhôm phẳng. Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi. Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình. Khi pha động di chuyển chầm chậm dọc theo tấm bản mỏng vào tính mao quản sẽ lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Nhờ vào đó có thể nhận biệt được sự hiện diện của các hợp chất khác nhau trong mẫu chất. Phương pháp sắc ký cột Pha tĩnh là là các hạt silicagel như silica gel 60, silica gel C18... Pha động là dung môi hay hỗn hợp dung môi. Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 13 Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển các hợp chất sẽ tách nhau ra. 1. 3. Phương pháp xác định cấu trúc 1.3.1. Phương pháp khối phổ MS [8] (Mass spectroscopy) Khối phổ là một kỹ thuật để để đo khối lượng phân tử của một phân tử. Bên trong máy đo khối phổ, ở áp suất thấp, phân tử cần phân tích đang ở trạng thái khí, bị bắn phá bởi những chùm tia điện tử có năng lượng cao. Sự bắn phá này sẽ tách một điện tử ra khỏi phân tử khảo sát làm cho phân tử biến thành một ion mang điện tích dương hoặc gốc tự do. Có nhiều cách tạo ra ion như bằng cách bắn phá điện tử (EI- MS), bằng hóa học (IC-MS) hoặc bằng cách phun ion (ESI-MS).Chùm tia điện tử không chỉ làm tách một điện tử ra khỏi phân tử để tạo ra một ion phân tử mà còn làm đứt gẫy những nối hóa trị phân những ion phân tử thành những mảnh nhỏ hơn mang điện tích dương hay trung hòa. Những ion này sẽ đi qua một vùng tử trường mạnh và sẽ được phân loại dựa trên khối lượng/điện tích (m/z) của ion. Giá trị m/z của mỗi ion sẽ là khối lượng của nó. Do đó, dựa trên phổ MS có thể biết thông tin vể khối lượng, công thức nguyên của phân tử. 1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [9] NMR là phương pháp phổ phân tích hiện đại, quan trọng trong hóa học, đặc biệt là hóa học hữu cơ. Cùng với phương pháp phân tích sắc ký, NMR là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong việc nghiên cứu cấu trúc. Có nhiều loại hạt nhân hoạt động bằng cách tự xoay quanh trục của nó. Do các hạt nhân mang điện nên khi chúng tự xoay quanh trục của mình sẽ làm nảy sinh ra từ trường có thể tương tác với một từ trường bên ngoài nếu có. Chỉ một số hạt nhân có số proton lẻ hoặc notron lẻ mới có đặc trưng này (1H, 13C). Khi đó, các spin hạt nhân này sẽ định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường bên ngoài. Hai định hướng này không có cùng mức năng lượng (song song cùng chiều có mức năng lượng thấp hơn định hướng song song ngược chiều). Khi các hạt nhân này hấp thụ năng lượng được cung cấp từ một bức xạ điện từ có tần số thích hợp thì spin trạng thái năng Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 14 lượng thấp sẽ nhảy lện spin trạng thái có mức năng lượng cao hơn. Một máy rất nhạy ghi nhận sự hấp thụ năng lượng này và cho tín hiệu trên phồ đồ. Trên nguyên tắc chung này nhưng dựa vào nguyên tử khảo sát mà có nhiều loại phổ NMR một chiều (1H-NMR, 13C-NMR). Bên cạnh đó còn có các loại phổ NMR hai chiều là sự kết hợp của các loại phổ NMR một chiều (HMBC, HSQC, COSY) 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC[19] Phương pháp ức chế men α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại 2 là phương pháp ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyền hóa đường hay cải thiện chức năng insulin hoặc kích thích sự sản sinh insulin của tế bào beta tuyến tụy như các phương pháp khác. Những hoạt chất có khả năng ức chế hoạt động men α-glucosidase như là Acarbose, Miglitol là những chất làm giảm nhanh lượng đường huyết sau bữa ăn [17]. Phương pháp in vitro để khảo sát hoạt tính ức chế men α-glucosidase dựa trên nguyên tắc: − Men α-glucosidase khi gặp nối α-D-glucose sẽ cắt đứt nối này để giải phóng đường D-glucose − Sử dụng chất nền có liên kết α với đường D-glucose như p-nitrophenyl-α-D- glucoryranoside, dưới tác dụng của men α- glucosidase sẽ bị thủy phân cho ra đường α-D- glucose và p-nitrophenol PNP- Glc α-D- glucopyranoside + p-nitrophenol − Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với p- nitrophenol. p- nitrophenol hấp thu trong ánh sáng nhìn thấy được, nên tiến hành đo hấp thu ở bước sóng λ=405nm. Từ đó xác định được đường D- glucose sinh ra. − So sánh hàm lượng đường D- glucose sinh ra giữa mẫu có ức chế và mẫu không ức chế để xác định % ức chế. Dựng đường biểu diễn giữa % ức chế và nồng độ chất ức chế để xác định nồng độ chất ức chế tại đó có thể ức chế 50% khả năng hoạt động của men α-glucosidase (IC50) α-glucosidase Nghiên cứu thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 15 % ức chế được tính theo công thức % ứ𝑐 𝑐ℎế = [PNP]0 − [PNP]i[PNP]0 × 100 Vỉ [PNP] tuyến tính bậc 1 với mật độ quang nên % ứ𝑐 𝑐ℎế = [A]0 − [A]i[A]0 × 100 Trong đó: [PNP]0: nồng độ PNP sinh ra khi không sử dụng chất ức chế (mM) [PNP]i: nồng độ PNP sinh ra khi sử dụng chất ức chế có nồng độ Ci (mM) [A]0: độ hấp thu trung bình khi không sử dụng chất ức chế [A]i: độ hấp thu trung bình khi sử dụng chất ức chế có nồng độ Ci Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 16 1. HÓA CHẤT- DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 1. 1. Hóa chất  Acarbose 50mg (Standard chem & pharm. Co.)  Chloroform (PA) Trung Quốc  DMSO (A) Merck  Ethanol 96o (T) Việt Nam  Ether petrol (A)Trung Quốc  Ethyl acetate (PA) Trung Quốc  H2SO4 10%/EtOH ( Pha 50ml H2SO4 đậm đặc trong 500 ml EtOH 95 %)  KH2PO4 (A) Prolabo  Methanol (PA) Trung Quốc  NaHPO4 (A) Prolabo  n-hexan (T) Trung Quốc  Nước khử ion  Nước tinh khiết HPLC  p-nitrophenol (PNP) (PA) Merck  p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (PNP-Glc) (PA) Merck  Tween 80 Sigma  α – glucosidase (α – Glc) Sigma 1. 2. Dụng cụ  Bảng mỏng sắc ký (TLC) là bản nhôm tráng sẵn silica gel Merck–GF60F254, kích thước 20 × 20 cm, độ dày lớp hấp phụ 0,2 mm (Merck, Germany)  Bếp điện dùng nướng bản mỏng Blacker®  Bình định mức 100 ml  Bình giải ly TLC  Bình phun xịt thuốc thử.  Cột cao áp.  Micropipette 20 – 200μl và micropipette 100 – 1000μl  Pipette 10ml  Silica gel 60, MERCK, đường kính hạt 0,06–0,2 mm Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 17 1. 3. Thiết bị  Cân điện tử (TANITA KD–200, Nhật và PRECISA XB 220ª, Đức).  Máy cô quay chân không (BUCHI Rotavapor R–200, Đức)  Máy đo mật độ quang EL x 800 (Biotek, Mỹ)  Máy đo nhiệt độ nóng chảy (Electrothermal IA 9000 Series)  Máy đo pH (inolab, Đức)  Máy đo phổ NMR, 500 MHz (Brucker Advant, Đức)  Máy sấy (UE 400)  Máy sắc ký điều chế NovaPrep 200 (Merde Hitadu,Mỹ)  Máy siêu âm (Elma S 100 H Elmasonic)  Máy soi UV , λ=254 nm (MINERALIGHT ® LAMP, Mỹ) Hình 8: Cân điện tử hiệu TANITA KD–200 Hình 11: Máy thổi khí Nitogen N2LCMS Claind Hình 9: Máy siêu âm Elma S 100 H Elmasonic Hình 10: Cân điện tử PRECISA XB 220ª Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 18 Hình 15: Máy cô quay chân không hiệu BUCHI Rotavapor R–200 Hình 14: Máy sắc ký điều chế NovaPrep 200 Hình 13: Máy soi UV MINERALIGHT ® LAMP(U.S.A) Hình 16: Máy đo pH Hình 12: Máy đo nhiệt độ nóng chảy Electrothermal IA 9000 Series Hình 17: Máy đo mật độ quang EL x 800(Biotek, Mỹ) Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 19 2. THỰC NGHIỆM 2. 1. Nghiên cứu thành phần hóa học 2. 1. 1. Nguyên liệu 10,6 kg mẫu trái chuối hột tươi (trái chuối còn xanh gồm vỏ, thịt và hột) thu hái tại huyện Thuận An, tỉnh Bình Dương vào tháng 8 năm 2011 được thái mỏng rồi sấy ở nhiệt độ 45oC thu được 3,4 kg mẫu trái chuối hột khô. 2. 1. 2. 2. 1. 3. 2. 1. 4. 2. 1. 2. Trích ly cao thô Mục tiêu: Phân chia các hợp chất tự nhiên trong mẫu ra từng nhóm với độ phân cực khác nhau. Tiến hành: Chiết kiệt 3,4 kg mẫu chuối khô với ethanol 96o bằng phương pháp chiết siêu âm. Toàn bộ dịch chiết được đem cô quay áp suất thấp, thu hồi dung môi nhận được cao ethanol ở dạng sệt (m=135g). Trong cao ethanol xuất hiện nhiều chất rắn màu Hình18: Mẫu nải chuối hột tươi Hình19: Mẫu trái chuối hột đã được thái mỏng tươi i Hình 20: Mẫu trái chuối hột đã được thái mỏng khô Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 20 trắng dạng hạt, tan tốt trong nước nhưng tan rất ít trong methanol. Khi đem đốt, chất rắn trở thành dạng bột màu xám. Điều này chứng tỏ chất rắn không phải là một hợp chất hữu cơ. Phần bã còn lại đem chiết kiệt với nước cất bằng phương pháp siêu âm, rồi cô quay áp suất thấp thu hồi dung môi được cao nước ở dạng sệt (m=12g). Hòa tan hoàn toàn cao ethanol trong methanol rồi lọc qua giấy lọc để loại bỏ chất rắn trên. Phần dịch methanol được đem cô quay áp suất thấp thu hồi dung môi, nhận được cao tổng (m=105g). Lần lượt chiết kiệt cao tổng bằng n-hexane, ethyl acetate theo phương pháp chiết siêu âm. Phần cắn còn lại là cao methanol (m=80g ) chiếm 76,2 % khối lượng cao tổng . Cô quay áp suất thấp, thu hồi dung môi lần lượt các dịch chiết, thu được 13 g cao n-hexane ở dạng sệt (chiếm 12,4 % khối lượng cao tổng), 4g cao ethyl acetate ở dạng sệt (3,8 % khối lượng cao tổng) theo thứ tự. Cao n-hexane (cao H) Cao ethyl acetate (cao E) Cao methanol (cao M) Cao nước (cao W) Khối lượng 13 g 4 g 80 g 12 g TLC Bảng 1 : Kết quả quá trình trích ly cao thô Cao n- C:M 9:1 Cao n- C:M 9:1 Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 21 Sơ đồ 1: Quy trình trích ly các cao từ trái chuối 2. 1. 3. Phân lập các chất 2. 1. 3. 1. Chất Mb01 Thí nghiệm 1: Mục tiêu: Tiến hành sắc ký cột cao áp cao H nhằm phân chia cao H thành những phân đoạn gồm những chất có độ phân cực khác nhau. Tiến hành: Thông số khi chạy cột cao áp: o Khối lượng mẫu: 13gam. Mẫu khô 3,4 kg Cao ethanol ( m=135g) Phần còn lại Chất rắn màu trắng (m= 26,6g) Cao tổng ( m =105g ) Cao nước (cao W) ( m=12g ) Phần bã Cao n-hexane (cao H) ( m=13g) Phần cắn Cao ethyl acetate (cao E) ( m = 4g) Cao methanol (cao M) ( m=80g ) − Chiết với ethanol 96o − Thu hồi dung môi − Chiết với nước cất − Thu hồi dung môi  Hòa tan bằng methanol  Lọc bằng giấy lọc − Chiết với n-hexane − Thu hồi dung môi − Chiết với ethyl acetate − Thu hồi dung môi Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 22 o Kích thước cột: 40x300mm o Pha tĩnh: silica gel 60, 0,06- 0,2mm o Tốc độ dòng : 30 ml/ phút o Hệ dung môi: n-hexane/ethyl acetate Thí nghiệm 2: Mục tiêu: Tiến hành sắc ký cột cao áp phân đoạn HA nhằm phân lập chất Mb01. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột cao áp: o Khối lượng mẫu: 413mg o Kích thước cột: 15x 400mm o Pha tĩnh: silica gel 60, 0,06- 0,2 mm o Tốc độ dòng: 5 ml/ phút 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Phân đoạn Thời gian chạy (phút) TLC HA 10-30 Có 1 vết đậm → Mb01 HB 31-55 Có 4 vết đậm HC 56-120 Nhiều vết HD 121-210 Nhiều vết HE 211-235 Có 3 vết đậm→ Mb02, Mb04 HF 236-280 Nhiều vết HG 281-315 Có 3 vết đậm HH 316-390 Có 3 vết đậm % ethyl acetate t (phút) Biểu đồ 1: chương trình chạy cột cao áp cao H Bảng 2: Kết quả chạy cột cao áp cao H Kết quả : Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 23 o Hệ dung môi: n-hexane/ethyl acetate 98: 2 o Thời gian chạy: 180 phút Kết quả: 2. 1. 3. 2. Chất Mb02 Thí nghiệm 1: Mục tiêu: tiến hành sắc ký cột P-HPLC phân đoạn HE nhằm phân lập chất Mb02. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột P-HPLC: o Khối lượng mẫu: 93 mg o Kích thước cột: 15x 400 mm o Loại silica gel: silica gel C18, 15 µm o Tốc độ dòng: 5 ml/ phút o Dung môi: methanol/ nước Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HA1 0-38 Nhiều vết HA2 39 - 83 2 vết HA3 84 - 127 1 vết→Mb01 HA4 127- 152 2 vết HA5 153- 180 2 vết Bảng 3: Kết quả chạy cột trung áp phân đoạn HA 60 70 80 90 100 0 20 40 60 80 100 120 140 t ( phút) % methanol Biểu đồ 2: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 24 Kết quả: Thí nghiệm 2: Mục tiêu : chạy cột P-HPLC phân đoạn HE1 nhằm phân lập chất Mb02. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột P-HPLC o Khối lượng mẫu: 10mg o Kích thước cột: 10x 250 mm o Loại silica gel: silica gel C18, 15 µM o Tốc độ dòng: 2 ml/ phút o Dung môi: methanol/ nước Kết quả: Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HE1 46- 52 1 vết đậm→ Mb02 HE2 53- 78 Nhiều vết HE3 80- 87 1 vết đậm HE4 88- 123 Nhiều vết 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Bảng 4: Kết quả chạy cột P-HPLC phân đoạn HE t ( phút) Biểu đồ 3: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE1 % methanol Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 25 Bảng 5: Kết quả chạy cột HPLC phân đoạn HE1 2. 1. 3. 3. Chất Mb04 Thí nghiệm 1: Mục tiêu: chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3 nhằm phân lập chất Mb04. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột P-HPLC o Khối lượng mẫu: 40 mg o Kích thước cột: 10x 250 mm o Pha tĩnh: silica gel C18, 15 µm o Tốc độ dòng: 3 ml/ phút o Dung môi: methanol/ nước Kết quả : Thí nghiệm 2: Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HE1A 17,6 – 22,5 1 vết→Mb02 HE1B 22,6 - 29 Nhiều vết Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HE3A 6- 18 Nhiều vết HE3B 18.1 - 26 1 vết đậm→Mb04 HE3C 26.1 - 42 Nhiều vết % methanol t ( phút) Biểu đồ 4: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3 Bảng 9: Kết quả chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3 90 95 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 26 Mục tiêu: chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3B nhằm phân lập chất Mb04. Tiến hành: Các thông số khi chạy cột P-HPLC: o Khối lượng mẫu: 10 mg o Kích thước cột: 10x 250 mm o Pha tĩnh: silica gel C18, 15 µm o Tốc độ dòng: 3 ml/ phút o Dung môi: methanol/ nước Kết quả : 2 Tinh chế các chất tinh khiết 2. 1. 4. 1. Chất Mb01 Chất Mb01 thu được từ phân đoạn HA3 được rửa nhiều lẩn bẳng methanol lạnh rồi kết tinh lại nhiểu lần trong hỗn hợp chloroform/ methanol. Sau đó, hòa tan trong chlorofrom, kiểm tra bẳng TLC giải ly nhiều lần với dung môi triển khai là n-hexane/ ethyl acetate (98: 2) thu được 117 mg chất Mb01 tinh khiết. 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 Phân đoạn Thời gian chạy ( phút) TLC HE3B1 46.1-56 Nhiều vết HE3B2 56.1 - 60 1 vết→Mb04 % methanol t ( phút) Biểu đồ 5: Chương trình chạy cột P-HPLC phân đoạn HE3B Bảng 6: Kết quả chạy cột P-PHPLC phân đoạn HE3B Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 27 Đặc tính Mb01  Tinh thể hình kim, màu trắng.  Hấp thu bước sóng 254 nm.  Tan trong chloroform.  Sắc ký lớp mỏng (TLC) triển khai bằng hỗn hợp dung môi n-hexane/ ethyl acetate (96: 4) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol cho vết tròn màu vàng nhạt có Rf = 0,34 khi hơ nóng.  Mp.: 133oC-135oC 2. 1. 4. 2. Chất Mb02 Chất Mb02 được hòa tan trong methanol, kiểm tra bằng TLC giải ly nhiều lần với dung môi triển khai là chloroform/ methanol (96: 4) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, thu được 2mg chất Mb02 tinh khiết. Đặc tính Mb02  Dạng vô định hình màu cam.  Tan trong methanol.  Sắc ký lớp mỏng (TLC) triển khai bằng hỗn hợp dung môi chloroform/ methanol (9: 1) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, cho vết tròn màu hồng có Rf = 0,57 khi hơ nóng. Hình 21: Tinh thể Mb01 Hình 22: TLC của Mb01 hiện hình bằng H2SO4 10% trong ethanol Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 28 2. 1. 4. 3. Chất Mb04 Chất Mb04 thu được từ phân đoạn HE3B được kết tinh nhiều lần trong hỗn hợp chloroform/ methanol rồi hòa tan trong methanol, kiểm tra bằng TLC giải ly nhiều lần với dung môi triển khai là chloroform/ methanol (98:2) thu được 3,4 mg chất Mb04 tinh khiết. Đặc tính Mb04  Dạng vô định hình màu trắng.  Tan trong methanol.  Sắc ký lớp mỏng (TLC) triển khai bằng hỗn hợp dung môi chloroform:methanol (96: 4) hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, cho vết tròn màu xanh dương có Rf = 0,32 khi hơ nóng. Hình 23: dạng vô định hình của Mb02 Hình 24: TLC của Mb02 hiện hình bằng H2SO4 10% trong ethanol Hình 25: Dạng vô định hình của Mb04 Hình 26: TLC của Mb04 hiện hình bằng H2SO4 10% Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 29 Cao tổng Chiết lần lược với n-hexan; ethyl acetate Cô quay thu hồi dung môi Sơ đồ 2: Tổng kết quá trình cô lập và tinh chế các chất Cao H Cao E Cao M Chạy sắc ký cột HPLC Dung môi: gradient từ n-hexane/ethyl acetate 100:0 đến n-hexane/ethylacetate 0: 100 Chạy sắc ký cột P-HPLC, pha thuận Dung môi: n-hexane/ethyl acetate 98: 2 Mb01 PĐ HE1 PĐ HE2 PĐ HE3 PĐ HE4 Chạy sắc ký cột P-HPLC, pha đảo Dung môi:gradient methanol/ nước 85: 15 đến methanol/ nước 100: 0 Mb02 Chạy sắc ký cột P-HPLC, pha đảo Dung môi: gradient methanol/nước 75:25 đến methanol/ nước100: 0 Chạy sắc ký cột P- HPLC, pha đảo Dung môi: gradient M/W 95: 5 đến M/W 100: 0 Chạy sắc ký cột P- HPLC Dung môi: gradient methanol/ nước 90:10 đến methanol/ nước 100: 0 Mb04 PĐ HE3A PĐ HE3B PĐ HA PĐ HB PĐ HC PĐ HD PĐ HE PĐ HF PĐ HG PĐ HH Khảo sát thành phần hóa học NHDKH: ThS. Phùng Văn Trung của trái chuối hột (Musa balbisiana Colla ) họ Musaceae NTH: Lê Thị Thu Hiền Trang 30 2. 2. Nghiên cứu hoạt tính sinh học 2. 2. 1. Mục tiêu: Khảo sát hoạt tính ức chế men α- glucosidase của cao tổng, cao n-hexan và chất Mb01 và thuốc Acarbose 2. 2. 2. Tiến hành: 2. 2. 2. 1. Chuẩn bị hóa chất Pha dung dịch đệm pH= 6,8: cân 122 mg Na2HPO4 và 57,3mg KH2PO4 pha trong 5 ml nước khử ion. Pha h