Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học vỏ thân cây đinh lăng trổ polyscias guilfoylei bail. họ nhân sâm (araliaceae)

foylei var. quinquefolia Bail. Năm 2011, Văn Bá Lãnh [6] đã cô lập từ lá cây 2 hợp chất là:  3-O-β-D- glucopyranosylstigmasterol (19)  3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic-28-O-β- D-glucopyranosyl ester (8) (1) H3C CH3H H3C H CH3 CH3 CH3 COOH CH3 HO (2) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 CH3 O OH HO HOOC HO COOH (3) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 CH3 O OH O HOOC HO COOH O OH HO HO HO (4) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O OH HO O OH HO HO HOOC O OH (5) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O OH O HOOC O O OH HO HO OH O OH HO HO OH (6) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O O HO HOOC O O OH HO HO OH O OH HO HO OH (7) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 C CH3 O OH HO HOOC O O OH HO HO OH O OH HOHO HO O O (8) CH3 CH3H CH3 H H3C O CH3 CH3 COOH H3C O OH HO OH OH (9) CH3 CH3H CH3 H H3C O CH3 CH3 COOH H3C O OH HO O OH O OH HO OH OH (10) CH3 CH3H CH3 H H3C O CH3 CH3 COOH H3C O OH HOOO OH HO OH OH (11) CH3 CH3H CH3 H H3C O CH3 CH3 COOH H3C O OH HO O O OH HO HO OH (12) CH3 CH3H CH2OH HH3C O CH3 CH3 COOH H3C O OH HO OH (13) CH3 CH3H H3C H CH2OH O CH3 CH3 COOH H3C O O HO OH O OH HO HO H3C (14) H3C CH3H H3C H CH2OH O CH3 CH3 COOH CH3 O O HO OH O OH HOHO HO (15) H3C CH3H H3C H CH2OH O CH3 CH3 COO CH3 O O HO OH O OH HO HO HO O OH HO HO H3C (16) HO CH3 HCH3 H H H3C H (17) HO CH3 CH3 H H H3C H (18) OCH3 HCH3 H H H3C H O OH HOHO OH (19) OH3CO CH3O OCH3 OCH3 OCH3 O (20) OO OH O O O OHHO HO H3C O OHHO HO H3C OH (21) H3C CH3H H3C H CH2OH O CH3 CH3 COO CH3 O OH HO HO O O OH HO O HO O OH HO HO H3C O O HO OH O OH HO HO H3C (22) OHO OH O OH OH O O OH HO HO HO (23) O H3C CH3 CH3 CH2OH CH3 O HO O HO HO CH3 O OH OH O OHHO HO H3C (24) HO CH3 HCH3 H H H3C H (25) O CH3 HCH3 H H H3C H O OH OH HO HO (26) O OCH3 OH H3CO O (27) H3C CH3H H3C H CH2OH CH3 CH3 COOH CH3 HO (28) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O O HO OH O OH HO HO H3C (29) O H3C CH3 CH3 H3C COOH CH2OH CH3 O OH HO CH3 OH HO (30) O H3C CH3 CH3 H3C COOH CH3 CH3 CH3 OH O O HO OH O OH HO HO H3C (31) N O OH HO OH HO H 6 6 (32) N O OH HO OH O H OHO OH HO OH 6 6 (33) (34) (35) (36) (37) OH OH (38) HO O O OH (39) (40) OH (41) OH O (42) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O O HO O OH HO OH HO OH OH (43) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COO CH3 O OH HO O OH O OH HO HO HO O OH HO HO H3C (44) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O O HO HOOC HO O OHHO HO HO (45) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O O HO HOOC O O OH HO OH O OH HO HO OH (46) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O O O HOOC HOO OH HO HO OH O OH HO HO HO (47) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 C CH3 O O HO HOOC O O OH HO HO OH O OH HOHO HO O O O OH HO HO OH (48) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COO CH3 O O HO HOOC O O OH HOHO HO O OH HO OH O OH HO HO OH (49) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COO CH3 O O O HOOC HO O OH HOHO HO O OHHO HO OH O OH HO HO HO (50) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COO CH3 O OH HO HOOC O O OH OHO HO O OH HO HO OH O OH HO HO H3C (51) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COO CH3 O O HO HOOC O O OH OHO HO O OH HO HO OH O OH HO HO H3C O OHHO HO HO (52) HO O O N (53) O HO OH HO O OH O O O HO (54) OH O OH HO O OH O O O HO (55) HO OH O (56) HO OH O OH (57) OH O OH HO O OH O O O HO OH OH (58) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O OH HO HOOC HO (59) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 CH3 O OH O HOOC HO O OH HO OH HO COO O OH HO HO HO (60) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOCH3 CH3 O OH HO O OH HO HO HOOC O OH (61) O O HO (62) O CH3 CH3 H H H3C H O OH HO HO OH (63) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COO CH3 O OH HO HO OH O OH HO OH HO (64) OO OH O OH O OCH3 O OH HO HO H3C O OH HO HO H3C (65) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O OH O O OH HO HO C HO OH O OCH3 (66) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O OH HO O OH HO HO C O OH O OCH3 (67) H3C CH3H H3C H CH3 O CH3 CH3 COOH CH3 O O O HOOC O O OH HOHO HO O OH HO HO OH O OH HOHO HO (68) 1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH Theo bác sĩ Huỳnh Ngọc Tựng [15], các loài cây đinh lăng được trồng ở Việt Nam đều dùng làm thuốc được. Tuy nhiên, có một số loài cây đinh lăng vẫn chưa tìm thấy tài liệu nghiên cứu một cách cụ thể về dược tính. Theo các tài liệu tham khảo, chỉ tìm thấy một nghiên cứu về dược tính trên cây Polyscias guilfoylei Bail., đó là nghiên cứu trên lá tươi : dịch trích nước và dịch trích diclorometan của lá cây Polyscias guilfoylei Bail. có khả năng quyến rũ ruồi trái cây. Chính vì cây Polyscias guilfoylei Bail. chưa được nghiên cứu nhiều nên chúng tôi xin trình bày thêm dược tính của một số cây khác cùng chi. 1.3.1. Polyscias fruticosa (L.) Harms. Cây đinh lăng có tác dụng làm tăng sức chịu đựng của cơ thể đối với một số yếu tố như: kiệt sức, nóng,[3] Các thí nghiệm trên chuột cho thấy cây Polyscias fruticosa có khả năng làm tăng tiết niệu gấp trên năm lần so với bình thường, làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các bức xạ siêu cao tầng, kéo dài thời gian sống của chuột bị nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium berghei, làm tăng tác dụng của thuốc chống sốt rét cloroquin [8,16]. Thực nghiệm trên người cho thấy, cây Polyscias fruticosa làm tăng khả năng chịu đựng của bộ đội, vận động viên thể thao [7], khác với nhân sâm, Polyscias fruticosa không làm tăng huyết áp [2, 16]. Năm 2001, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự [5] đã dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm tác dụng chống trầm cảm và stress của Polyscias fruticosa. Kết quả cho thấy cao Polyscias fruticosa có tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, ở liều 45-180 mg/kg thể trọng, khoảng liều này cũng có tác dụng khác như tăng lực, kích thích hoạt động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch. Theo dân gian, đinh lăng được dùng làm thuốc bổ, chữa cơ thể suy nhược, gầy yếu, mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho, ho ra máu, đau tử cung, kiết lỵ, làm thuốc lợi tiểu và chống độc. Dưới đây là một số bài thuốc dân gian có đinh lăng [1,2,3]. Một số bài thuốc dân gian từ cây Polyscias fruticosa: Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: Rễ đinh lăng phơi khô thái mỏng, 0,50g thêm 100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2-3 lần uống trong ngày. Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau tức ngực, nước tiểu vàng: Đinh lăng tươi (rễ, cành) 30g, lá hoặc vỏ chanh 10g, vỏ quýt 10g, lá tre tươi 20g, cam thảo đất 30g, rau má tươi 30g, me chua đất 20g. Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250ml, chia uống 3 lần trong ngày. Lợi sữa: Lá đinh lăng tươi 50 – 100g, bong bóng lợn 1 cái, băm nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu cháo ăn. Hoặc rễ Đinh lăng tươi 30 - 40g, thêm 500ml nước, sắc còn 250ml, uống nóng, ngày uống 1-2 lần, uống trong 2 – 3 ngày. Chữa đau tử cung: Cành và lá đinh lăng sao vàng, sắc uống như chè. Chữa mẫn ngứa do dị ứng: Lá đinh lăng 80g, sao vàng, sắc uống, dùng trong 2 -3 tháng. Lá đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc trải giường cho trẻ em nằm giúp phòng bệnh kinh giật. 1.3.2. Polyscias amplifolia (Baker) Harms. Chaturvedula v.s.prakash và cộng sự [38] đã cho biết ba hợp chất từ quả là: acid 3-O-β-D- galactopyranosyloleanolic; acid 3-O-β-D- Hình 2: Thực phẩm chức năng CERATO galactopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranosyloleanolic và acid 3-O-β-D-galactopyranosyl- (1→4)-α-L-arabinopyranosyloleanolic có hoạt tính ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư buồng trứng A2780 ở người. 1.3.3. Polyscias balfouriana Bail. Theo Phan Quốc Kinh [42], thực phẩm chức năng với tên thương mại là CERATO, có bán trên thị trường với thành phần chứa là cao tật lê, cao dâm dương hoắc và cao đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana) có tác dụng giúp nam giới bồi bổ sức khỏe, nâng cao thể trạng, giảm đau mỏi lưng gối, ù tai, di tinh, mộng tinh. Sản phẩm này đã được công ty cổ phần dược vật tư y tế Thành Vinh nghiên cứu và sản xuất dựa vào công thức của Genix (sản phẩm được sử dụng rộng rãi ở Bắc Mỹ và Tây Âu), nhưng cải biến một thành phần của Genix để CERATO có hoạt tính cao hơn, mạnh hơn, đó là thay thế cao đinh lăng - Polyscias fruticosa bằng cao đinh lăng lá tròn - Polyscias balfouriana. Dịch trích butanol của lá và rễ cây Polyscias balfouriana đều có tác dụng chống loét khi thử nghiệm trên chuột, trong đó, dịch trích butanol từ lá có tác dụng mạnh hơn dịch trích từ rễ [39]. 1.3.4. Polyscias filicifolia Bail. Dịch trích từ sinh khối của tế bào cây Polyscias filicifolia có khả năng kháng rất mạnh chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và kháng yếu với 3 chủng: Micrococcus flavus, Streptococcus pyogenes và Streptococcus agalatiae [21,23]. Dịch trích 40% etanol từ sinh khối của những tế bào nuôi cấy của cây Polyscias filicifolia áp dụng lên giống Salmonella typhimurium TA 98 và TA 100 cho hoạt tính mạnh về kháng đột biến gen [20]. Rượu thuốc từ cây Polyscias filicifolia có tác dụng bảo vệ và phục hồi quá trình tổng hợp protein khi tim heo thiếu oxygen [27]. 1.3.5. Polyscias murrayi Harms. Một số dẫn xuất của acid 3-(4-hydroxyphenyl)propanoic được cô lập từ cây Polyscias murrayi như 3-(4-hydroxyphenyl)propionylcholine; acid 3,4 -di-O-3- (4- hydroxyphenyl)- 1,5-dihydroxypropionylcyclohexancarboxylic; acid 3,5-di-O-3-(4-hydroxyphenyl)-1,4- dihydroxypropionylcyclohexancarboxylic và acid 3- (4-hydroxyphenyl)propanoic có khả năng ức chế hoạt tính xúc tác của men Itk (interleukin-2-inducible T-cell) [30]. 1.3.6. Polyscias scutellaria Merr. Cao trích có chứa saponin của cây Polyscias scutellaria áp dụng trên chuột albino cho thấy có khả năng làm vết thương nhanh lên da non [19]. Chương 2: THỰC NGHIỆM 2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1. Hóa chất + Dung môi: clorofom, metanol, n-hexan, etyl acetat, n-butanol, eter dầu hỏa, etanol 96o. + Silica gel: silica gel 60, 0.04 – 0.06 mm, Merck dùng cho sắc kí cột. + Sắc kí bản mỏng loại 25DC – Aflufolein 20 x 20, Kiesel gel 60F254, Merck. + Sắc kí bản mỏng loại 25DC, RP – 18, Merck. + Thuốc thử hiện hình sắc kí bản mỏng: H2SO4 đặc. 2.1.2. Thiết bị + Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. + Cột sắc kí. + Máy cô quay chân không Heidolph, máy sấy. + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.20, tần số cộng hưởng 500MHz. + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AC.200, tần số cộng hưởng 500MHz. Tất cả phổ được ghi tại phòng phân tích cấu trúc, Viện Hóa Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, 18 - Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. 2.2. KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Thu hái và xử lí mẫu Cây đinh lăng trổ Polyscias guilfoylei Bail. được thu hái tại Khánh Hòa vào tháng 7 năm 2011 và được nhận danh bởi Th.S Liêu Hồ Mỹ Trang – Bộ môn Hóa Thực Vật – Trường Đại học Y Dược Tp. HCM. Vỏ thân cây tươi sau khi thu hái, loại bỏ những phần sâu bệnh, rửa sạch, để ráo, sấy khô, nghiền nhuyễn thành bột được sử dụng cho phần nghiên cứu. 2.2.2. Xác định độ ẩm Độ ẩm của cây được xác định theo công thức Độ ẩm (%) = Trọng lượng tươi – Trọng lượng khô x 100 Trọng lượng tươi Mẫu cây tươi sau khi làm sạch được sấy khô ở nhiệt độ 60 – 65oC đến khi khối lượng không đổi, thực hiện 3 lần, so sánh lượng vỏ thân tươi và khô, suy ra độ ẩm trung bình của mẫu. Bảng 1: Độ ẩm của vỏ thân cây Polyscias guilfoylei Bail. Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Độ ẩm (%) 3621 1442 49.8 2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT: 2.3.1. Điều chế các loại cao 2.3.1.1. Điều chế cao etanol Sử dụng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng để điều chế cao etanol của vỏ thân. Bột khô của vỏ thân được ngâm dầm bằng dung môi etanol 96o trong 24 giờ. Sau đó lọc, lấy dịch trích, thu hồi dung môi. Tiếp tục thực hiện nhiều lần cho đến khi lượng cao thu được đáng kể, thu được cao etanol của vỏ thân là 111.73g. 2.3.1.2. Điều chế các loại cao khác Cao etanol của vỏ thân được chiết lỏng – lỏng trong các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm : n-hexan, etyl acetat, n-butanol. Sau đó lấy dịch trích, thu hồi dung môi để thu được các loại cao tương ứng. Dùng sắc kí bản mỏng pha thường để so sánh các cao : hexan, etyl acetat và butanol, kết hợp với các tài liệu tham khảo, chọn cao hexan và cao butanol để làm thực nghiệm. Sơ đồ điều chế các loại cao được trình bày trong sơ đồ 1. 2.3.2. Cô lập hợp chất từ cao hexan. Sắc kí cột silica gel áp dụng cho 5.000g của cao hexan, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 500ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 4 phân đoạn (H.1 – H.4), các phân đoạn được trình bày trong bảng 2. 2.3.2.1. Sắc kí cột cho phân đoạn H.3 (Bảng 2) Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn H.3 (1.080g) trong bảng 2, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 250ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 3 phân đoạn (H.3.1 – H.3.3), các phân đoạn được trình bày trong bảng 3. 2.3.2.2. Sắc kí cột cho phân đoạn H.3.2 (Bảng 3) Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn H.3.2 (0.640g) trong bảng 3, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 3 phân đoạn (H.3.2.1 – H.3.2.3), các phân đoạn được trình bày trong bảng 4. Trong hủ bi chứa phân đoạn H.3.2.2 xuất hiện một lớp kết tủa màu trắng, lắng xuống đáy hủ, lọc lấy kết tủa, rửa kết tủa nhiều lần bằng dung môi clorofom, để khô đem cân có khối lượng là 0.034 g. Sau đó tiếp tục sắc kí cột silica gel, giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Kết quả thu được chất bột màu trắng (20mg). Kiểm tra bằng sắc kí bản mỏng với hệ giải li là C 100%, xuất hiện một vết tròn, màu đen, có Rf = 0.38. Hợp chất này được kí hiệu là ED-1. 2.3.3. Cô lập các hợp chất từ cao Butanol vỏ thân Sắc kí cột silica gel áp dụng cho 20.100g cao Butanol, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 500ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 6 phân đoạn (B.1 – B.6), các phân đoạn được trình bày trong bảng 5. 2.3.3.1. Sắc kí cột cho phân đoạn B.4 (Bảng 5) Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn B.4 (5.280g) trong bảng 5, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các bình tam giác 250ml. Sau đó, dùng máy cô quay thu hồi dung môi, phần cao thu được đựng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 4 phân đoạn (B.4.1 – B.4.4), các phân đoạn được trình bày trong bảng 6. 2.3.3.2. Sắc kí cột cho phân đoạn B.4.3 (Bảng 6) Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn B.4.3 (2.080g) trong bảng 6, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 3 phân đoạn (B.4.3.1 – B.4.3.3), các phân đoạn được trình bày trong bảng 7. 2.3.3.3. Sắc kí cột cho phân đoạn B.4.3.2 (Bảng 7) Sắc kí cột silica gel áp dụng cho phân đoạn B.4.3.2 (67 mg) trong bảng 7, giải ly bằng các hỗn hợp dung môi có độ phân cực tăng dần. Dịch giải ly từ cột sắc kí được hứng vào các hủ bi. Dùng sắc kí bản mỏng để kiểm tra phần cao thu được, những phần giống nhau gom lại thành một phân đoạn. Kết quả được 2 phân đoạn (B.4.3.2.1 – B.4.3.2.2), các phân đoạn được trình bày trong bảng 8. Cao thu được từ phân đoạn B.4.3.2.2 (Bảng 8) được rửa nhiều lần trong dung môi metanol. Sau đó, tiếp tục sắc kí cột silica gel, giải ly bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Kết qủa thu được là một chất bột màu trắng, có khối lượng 9.2 mg. Dùng sắc kí bảng mỏng pha thường kiểm tra với hệ giải li là C : M : H2O = 14 : 6 : 1 thì hiện lên một vết tròn, rõ, màu tím, có Rf = 0.43. Hợp chất này được kí hiệu là BU-1. Bảng 2: Sắc kí cột silica gel trên cao hexan (5.000g) Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bản mỏng Ghi chú H.1 Ed : C (3 : 2) 0.900 Vết không rõ Chưa khảo sát H.2 Ed : C (1 : 1) 1.200 Vết không rõ Chưa khảo sát H.3 Ed : C (2 : 3) 1.080 Vết rõ Khảo sát H.4 Ed : C (2 : 3) 1.120 Nhiều vết Chưa khảo sát Bảng 3: Sắc kí cột trên phân đoạn H.3 (1.080g) Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bản mỏng Ghi chú H.3.1 Ed : C (1 : 1) 0.120 Một vết, có lẫn nhiều vết dơ Chưa khảo sát H.3.2 Ed : C (2 : 3) 0.640 Vết rõ, tròn, tách rõ Khảo sát H.3.3 Ed : C (2 : 3) 0.130 Vết dài Chưa khảo sát Bảng 4: Sắc kí cột trên phân đoạn H.3.2 (0.640g) Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bản mỏng Ghi chú H.3.2.1 Ed : C (2 : 3) 0.190 Vết mờ Chưa khảo sát H.3.2.2 Ed : C (2 : 3) 0.200 Vết màu đen, còn vết dơ rất mờ Khảo sát H.3.2.3 Ed : C (2 : 3) 0.050 Vết mờ Chưa khảo sát Bảng 5: Sắc kí cột silica gel trên cao butanol (20.100g) Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bản mỏng Ghi chú B.1 C 100% 1.340 Vết không rõ Chưa khảo sát B.2 C : M (19 : 1) 1.200 Vết không rõ Chưa khảo sát B.3 C : M (9 : 1) 2.50 Vết rõ SV Nguyễn Thị Kim Liên khảo sát B.4 C : M (4 : 1) 5.280 Vết rõ Khảo sát B.5 C : M (4 : 1) 5,220 Vết rõ SV Nguyễn Thị Kim Liên khảo sát B.6 C : M : H2O ( 14 : 6 : 1) 1.450 Vết không rõ Chưa khảo sát Bảng 6: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn B.4 (5.280g) Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bản mỏng Ghi chú B.4.1 C : M (17 : 3) 0.770 Vết dài, có nhiều vết dơ Chưa khảo sát B.4.2 C : M (4 : 1) 1.350 Một vết tròn, có lẫn nhiều vết dơ Chưa khảo sát B.4.3 C : M (4 : 1) 2.080 Một vết rõ, tròn, có ít vết dơ hơn Khảo sát B.4.4 C : M (4 : 1) 0.650 Nhiều vết Chưa khảo sát Bảng 7: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn B.4.3 (2.080g) Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bản mỏng Ghi chú B.4.3.1 C : M (17 : 3) 1.030 Vết tròn, có lẫn vết dơ Chưa khảo sát B.4.3.2 C : M : H2O ( 40 : 10 : 1) 0.067 Một vết rõ, tròn, có lẫn vết dơ mờ Khảo sát B.4.3.3 C : M : H2O (40 : 10 : 1) 0.680 Nhiều vết Chưa khảo sát Bảng 8: Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn B.4.3.2 (0.067) Phân đoạn Dung môi giải ly Khối lượng (gam) Sắc kí bản mỏng Ghi chú B.4.3.2.1 C : M : H2O (40 : 10 : 1) 0.032 Vết rõ tròn, có lẫn vết dơ Chưa khảo sát B.4.3.2.2 C : M : H2O (40 : 10 : 1) 0.027 Một vết rõ, tròn, có lẫn vết dơ mờ Khảo sát thu được BU-1 Sơ đồ 1: Điều chế các loại cao từ cao etanol vỏ thân Cao Etanol 111.730g + Chiết lỏng – lỏng trong n-hexan. + Cô quay thu hồi dung môi. Cao hexan 5.000g Phần còn lại + Chiết lỏng – lỏng trong etyl acetat. + Cô quay thu hồi dung môi. Cao etyl acetat 16.420g Phần còn lại + Chiết lỏng – lỏng trong n-butanol + Cô quay thu hồi dung môi. Cao butanol 20.100g Sơ đồ 2: Sơ đồ cô lập BU-1 từ cao butanol vỏ thân + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C : M + Cô quay thu hồi dung môi. Cao Butanol vỏ thân 20.100g Phân đoạn B.1(1.340g) + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C : M + Cô quay thu hồi dung môi. Phân đoạn B.4.1 0.770g BU-1 9.2 mg + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C : M : H2O + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C : M : H2O. Phân đoạn B.4.3.1 1.030g Phân đoạn B.4.3.2 0.067g Phân đoạn B.4.3.3 0.680g Phân đoạn B.2(1.200g) Phân đoạn B.4(5.280g) Phân đoạn B.3(2.500g) Phân đoạn B.5(5.200g) Phân đoạn B.6(1.450g) Phân đoạn B.4.4 0.650g Phân đoạn B.4.3 2.080g Phân đoạn B.4.2 1.350g Phân đoạn B.4.3.2.2 0.025g Phân đoạn B.4.3.2.1 0.032g + Rửa nhiều lần bằng metanol + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly C : M : H2O Sơ đồ 3: Sơ đồ cô lập ED-1 từ cao hexan vỏ thân Cao Hexan vỏ thân 5.000g + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly Ed : C + Cô quay thu hồi dung môi. + Lọc kết tủa, rửa nhiều lần bằng clorofom. + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly Ed : C ED-1 20mg Phân đoạn H.1 0.900g Phân đoạn H.2 1.200g Phân đoạn H.3 1.080g Phân đoạn H.4 1.120g + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly Ed : C + Cô quay thu hồi dung môi. Phân đoạn H.3.3 0.130g Phân đoạn H.3.2 0.640g Phân đoạn H.3.1 0.220g + Sắc kí cột silica gel. + Giải ly Ed : C + Cô quay thu hồi dung môi. Phân đoạn H.3.2.3 0.050g Phân đoạn H.3.2.2 0.200g Phân đoạn H.3.2.1 0.190g Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT BU-1 Hợp chất BU-1 (9.2mg) thu được từ phân đoạn B.4.3.2.2 của vỏ thân cây Polyscias guilfoylei Bail. có những đặc điểm như sau: Phổ 1H-NMR (pyridin-d5), (phụ lục 1), δH = 5.38 ppm (1H, br s, =CH-, H-12); 5.30 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1''); 4.86 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1'). Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT - NMR (pyridin-d5), (phụ lục 2, 3); δC = 144.4 (=C<, C-13); 122.2 (=CH-, C-12); 105.8; 104.9 (-O-CH-O, C-1', C-1''); 61.9 (-CH2-OH, C-6''). Độ chuyển dịch hóa học của các carbon khác được trình bày trong bảng 9. Phổ COSY, HSQC, HMBC (phụ lục 4, 5, 6) BIỆN LUẬN CẤU TRÚC: Phổ 1H-NMR cho thấy sự xuất hiện của proton olefin cộng hưởng tại δH = 5.38 ppm (1H, br s, =CH-) kết hợp với sự xuất hiện của 7 mũi đơn ở vùng trường cao (δH = 1.22; 1.20; 1.20; 0.90; 0.88; 0.87; 0.68) ứng với các proton của nhóm -CH3 gắn trên carbon tứ cấp, sự hiện diện của tín hiệu cộng hưởng tại vị trí δH = 3.27 (1H, dd, J = 11.5/4.0 Hz, H-3) và δH = 3.17 (1H, dd, J = 13,8/3.0 Hz, H-18), đây là những tín hiệu đặc trưng cho phần aglycon là acid oleanolic. Sự xuất hiện của 2 proton anomer ở các vị trí δH = 5.30 (1H, d, J = 8.0 Hz); 4.86 (1H, d, J = 7.5 Hz) cho phép dự đoán BU-1 là một saponin có gắn 2 phân tử đường, hai phân tử đường này đều có cấu hình β do hằng số ghép của 2 proton anomer này là J = 7.5 Hz và J = 8 Hz. Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT – NMR cho thấy BU-1 có sự xuất hiện của 42 tín hiệu carbon, trong đó có 7 tín hiệu carbon loại -CH3, 10 tín hiệu carbon loại -CH2-, 3 tín hiệu carbon loại >CH-, 1 tín hiệu carbon loại =CH-, 6 tín hiệu carbon loại >C<, 1 tín hiệu carbon loại =CCH-O và 2 tín hiệu carbon loại >C=O. Phần aglycon là acid oleanolic còn được tái khẳng định qua phổ 13C-NMR. Sự xuất hiện của 2 tín hiệu cộng hưởng tại các vị trí δC = 144.4 ppm và δC = 122.2 ppm đặc trưng cho 2 carbon olefin C-12 (=CH-) và C-13(=C<) của acid oleanolic. Sự hiện diện của 2 carbon anomer tại δC = 105.8 ppm và δC = 104.9 ppm cùng 8 tín hiệu carbon xuất hiện trong vùng từ 86.5 – 71.0 cho phép tái khẳng định aglycon có gắn 2 phân tử đường. Phổ HMBC cho thấy tương quan giữa proton anomer có δH = 4.85 ppm (d, J = 7.5 Hz ) với C-3 (δC3 = 89.1 ppm), như vậy phân tử đường thứ nhất gắn vào C-3 của acid oleanolic. Phổ COSY xuất hiện sự tương tác giữa proton anomer H-1' (δH = 4.85 ppm) với proton có δH = 4.05 ppm nên H-2' có δH2' = 4.05 ppm. Tương tự phổ COSY còn cho thấy sự tương tác khác của H-2' với H-3' nên H-3' có δH3' = 4.29 ppm. Từ đó, suy ra các tín hiệu proton trên phân tử đường thứ nhất. Phổ HSQC cho thấy mối tương quan giữa proton H-1' (δH = 4.85 ppm, d, J = 7.5 Hz) với carbon δC = 106.0 ppm, nên C ano