Khóa luận Khảo sát thành phần loài phụ và thành phần kiểu huyết thanh của các chủng Salmonella nhiễm trong thực phẩm

ưng tỉ lệ ít hơn nhiều. Thực phẩm bị 12 nhiễm Salmonella thường không làm thay đổi tính chất lý hóa và trạng thái cảm quan của thực phẩm, vì thế rất khó bị phát hiện. Nhìn chung, thực phẩm gây ngộ độc thường có độ ẩm cao, pH không acid, đặc biệt là thức ăn đã nấu chín dùng làm thức ăn nguội như món đông, patê, xúc xích, dồi tiết thường là nguyên nhân của những vụ ngộ độc thức ăn do Salmonella. [25, 36] Ngoài ra, hoa quả và các loại rau ăn sống mặc dù có rửa sạch trước khi ăn nhưng không thể hết nguy cơ nhiễm Salmonella do chúng có thể phát triển thành số lượng lớn hơn nhiều nếu không qua chế biến, nguyên nhân chủ yếu là do sử dụng phân bón hữu cơ cho rau quả và sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm. [16] 2.2.2 Tình hình nhiễm Salmonella trong thực phẩm Theo CDC, mỗi năm nước Mỹ có khoảng 40 000 người là nạn nhân của vi khuẩn Salmonella, tuy nhiên con số này có thể còn cao hơn 30 lần. Số người tử vong vì nhiễm Salmonella hằng năm vào khoảng 600 người. Hầu hết số người bị vi khuẩn này tấn công đều có biểu hiện tiêu chảy, sốt và chuột rút ở bụng. Bệnh kéo dài 4 – 7 ngày.[23] Ở Hà Lan, từ năm 1996 đến năm 2001, có 13 970 trường hợp bị ngộ độc do Salmonella, trong đó S. enteritidis chiếm tới 43,6%, S. typhimurium chiếm 32%, S. typhi chiếm 0,8%. Ở các loài động vật được dùng làm thực phẩm thấy tỉ lệ nhiễm S. typhimurium cũng khá cao như ở bò là 32,9%, lợn chiếm 66,4%, riêng gia cầm chỉ có 5,3% nhưng có tỉ lệ nhiễm S. enteritidis tới 20,3%. [27] Ở Việt Nam, theo thống kê năm 2001 của Bộ Y tế thì trong quý III có 1684 trường hợp mắc bệnh thương hàn làm chết người. 2.2.3 Các chỉ tiêu về Salmonella trong thực phẩm Hầu hết các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của Việt Nam cũng như các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong thực phẩm. Vì vậy các phương pháp phân tích Salmonella là quy trình định tính trong một lượng mẫu thực phẩm nhất định. Sự hiện diện của chúng được kiểm tra gắt gao bởi các cơ quan chức năng. Theo tiêu chuẩn cho phép vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm của Bộ Y tế 4/1998, quy định không chấp nhận sự hiện diện của Salmonella trong 25 g hay 25 ml đối với tất cả các loại thực phẩm. Theo thông tư đã ban hành số 01/2000/TT – BYT 13 của Bộ Y tế đối với thực phẩm sản xuất trong nước thì chỉ tiêu Salmonella bắt buộc phải kiểm tra đối với tất cả các loại thực phẩm như Bảng 2.3. Ủy Ban Châu Âu quy định không được phát hiện Salmonella /25 g trong bất kỳ loại thực phẩm nào. Theo phương pháp truyền thống việc phát hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, các thử nghiệm sinh hóa và cuối cùng là thử nghiệm huyết thanh, tính chung mất khoảng 7 ngày để có kết quả. Hiện nay đã có nhiều nỗ lực để rút ngắn thời gian phát hiện Salmonella bằng những phương pháp như thử nghiệm ELISA, và thử nghiệm DNA. Việc khẳng định kết quả âm tính trong vòng 48 giờ đã là chuyện bình thường. Tuy nhiên một khi mẫu có khả năng dương tính, cần tiến hành các thao tác truyền thống để khẳng định sự có mặt của Salmonella. [1] Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh của Salmonella. Bảng 2.3 Yêu cầu của kiểm tra bắt buộc đối với Salmonella trong các loại thực phẩm theo Thông tƣ 01/2000/TT-BYT của Bộ Y tế Nhóm thực phẩm Phƣơng pháp kiểm tra Thịt và các cơ quan nội tạng dùng làm thực phẩm muối, sấy khô, hun khói TCVN 5153:90 Sữa và kem chưa cô đặc, chưa pha thêm đường hoặc chất ngọt khác TCVN 6402:98 Sữa nước tách bơ, sữa chua và sữa kem khác để lên men hoặc acid hóa TCVN 6402:98 Xúc xích và các sản phẩm tương tự làm từ thịt, cá làm từ bộ phận nội tạng hoặc tiết động vật; các chế phẩm thức ăn từ các sản phẩm đó TCVN 5153:90 Điều đáng lưu ý là chỉ tiêu Salmonella không phân biệt chủng có gây bệnh hay không. Trong thực tế các phòng phân tích vi sinh thực phẩm chỉ thực hiện các xét nghiệm để phát hiện Salmonella spp., không làm xét nghiệm để phân biệt loài hay định danh chủng gây bệnh. Đây là một rào cản lớn cho các nhà sản xuất và xuất nhập khẩu thực phẩm. 14 2.3 Phát hiện Salmonella bằng phƣơng pháp nuôi cấy Đây là phương pháp định tính và kết quả được báo cáo là có hay không phát hiện Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Do quy định không cho phép có mặt trong thực phẩm nhưng lại khó phát hiện, cho nên mẫu lấy tối thiểu phải 25 g và quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải có thêm giai đoạn tiền tăng sinh để đạt hiệu quả cao. Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình bảo quản chế biến và sự tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae, những vi khuẩn này sẽ cạnh tranh hay ức chế sự phát triển của Salmonella. [5, 9,15] Để phát hiện Salmonella cần tiến hành bốn giai đoạn: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh phù hợp. 2.3.1 Giai đoạn tiền tăng sinh (pre – enrichment) Đây là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình kiểm nghiệm đối với mẫu kiểm nghiệm không phải là mẫu bệnh phẩm. Người ta thường sử dụng môi trường tiền tăng sinh không chọn lọc, giàu dinh dưỡng, không chứa các chất ức chế đặc hiệu tạo điều kiện cho sự phục hồi sức sống và tăng trưởng của nhiều vi sinh vật hiện diện trong mẫu đã bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm. Ví dụ: nước peptone đệm Buffered Peptone Water (BPW) là môi trường tiền tăng sinh được khuyến khích sử dụng trong môi trường kiểm tra nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thuộc họ Enterobacteriaceae; riêng FDA của Mỹ thì thường sử dụng Lactose broth cho một số nhóm thực phẩm. [4, 13] Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu cần chọn quy trình tiền tăng sinh phù hợp. Thông thường tỉ lệ giữa mẫu và môi trường tiền tăng sinh là 1:9, tuy nhiên tùy trường hợp cụ thể tỉ lệ này có thể thay đổi. [9] 2.3.2 Giai đoạn tăng sinh chọn lọc (selective enrichment) Giai đoạn này làm tăng mật độ Salmonella so với các vi sinh vật khác bằng cách ức chế hoặc ngăn chặn sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật khác, tạo thuận lợi cho việc phát hiện vi khuẩn này trong bước phân lập. 15 Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmonella thường được dùng là Rappaport Vassiliadis (RV), Tetrathionate Mueler Kauffman Broth (TT), Selenite Cystein Broth (SC) [15, 24]…Thông thường môi trường TT được dùng để phân tích các loại mẫu có thành phần chính là những loại thịt tươi sống, các mẫu có mật độ nhiễm vi sinh vật cao, các loại thức ăn gia súc, hay các loại thực phẩm khác. Một vài nghiên cứu gần đây của AOAC (Association of Official Analytical Communities - Hiệp hội các nhà phân tích của Mỹ) cho rằng mặc dù môi trường Selenite Cystein Broth có chứa selenite ức chế mạnh các vi khuẩn khác ngoại trừ Salmonella nhưng muối sodium biselenite có thể gây ưng thư khi tiếp xúc với cơ thể người nên hạn chế sử dụng và thấy rằng môi trường RV có thể thay thế cho các loại môi trường trên để phân tích mẫu. Canh RV có tác dụng ức chế vi khuẩn khác nhờ vào MgCl2 bằng cách tác động lên thành tế bào vi khuẩn và nhờ vào màu xanh malachite ức chế các vi khuẩn Gram dương [14]. Cần lưu ý là không môi trường tăng sinh chọn lọc nào là môi trường tối ưu chung cho tất cả các dòng Salmonella. Mỗi loại môi trường tăng sinh chọn lọc được thiết lập dựa trên một số đặc điểm phát triển khác nhau của Salmonella, một số dòng Salmonella tăng trưởng được trong môi trường này nhưng lại không tăng trưởng được trong môi trường khác. Ví dụ: S. typhi không phát triển được trong môi trường RV và TT; S. dublin không phát triển được trong môi trường RV. Ngoài ra, mỗi môi trường chọn lọc được ủ ở một nhiệt nuôi cấy khác nhau như môi trường RV được ủ ở 42oC, môi trường TT và SC được ủ ở 37oC trong 22 – 24 giờ. [5, 15, 24] Ngày nay, các yêu cầu về vệ sinh thực phẩm đều khuyếch khích các phòng thí nghiệm sử dụng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc Salmonella để tăng cường khả năng phát hiện tất cả các serotype Salmonella trong mẫu. [19, 22] 2.3.3 Giai đoạn phân lập (isolation) Đây là bước tách biệt Salmonella trong canh khuẩn ra khỏi quần thể của chúng. Một số môi trường phân lập như Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD), Bismuth Suffite Agar (BSA), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose Agar (BGLS), Hektoen Entric Agar (HE)…Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau. [8, 15, 16, 24] 16 Một số đặc điểm chính của các môi trường trên là với sự hiện diện của nấm men, đường, peptone tạo thuận lợi cho sự tăng trưởng Salmonella và Shigella yếu ớt. Sự sản sinh ra H2S cũng có thể xảy ra nhờ sự hiện diện của sắt thiosufate và sắt citrate đã thể hiện bởi những khuẩn lạc có tâm đen do sự tạo nên sulfua sắt. Trên các môi trường phân lập khác nhau Salmonella sẽ cho các kiểu khuẩn lạc đặc trưng khác nhau. Trên môi trường XLD: khuẩn lạc màu hồng tròn, trong suốt, có hay không có tâm đen. Một số dòng Salmonella có khả năng sinh H2S, trừ S. typhi thì khuẩn lạc trong suốt và không có tâm đen. [19, 20] Trên môi trường BSA: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay đen, có hay không có ánh kim tím trên bề mặt khuẩn lạc, môi trường xung quanh có màu nâu chuyển sang đen khi tăng thời gian ủ ấm, gây khó khăn cho việc nhận biết khuẩn lạc vi khuẩn Salmonella. Một số chủng có thể sinh khuẩn lạc màu lục với môi trường xung quanh ít nhiều có màu đen. [16, 20] Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc Salmonella điển hình trong suốt và hơi đỏ trong môi trường, có màu đỏ hồng xung quanh khuẩn lạc. Một số Salmonella xuất hiện khuẩn lạc màu lục trong suốt nếu bao quanh là vi khuẩn lên men lactose hoặc glucose gây ra vùng đó màu vàng xanh hoặc xanh; dưới 1% Salmonella không điển hình, chúng lên men đường lactose và xuất hiện khuẩn lạc vàng lục hoặc lục. [9, 37] Trên môi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu xanh dương đến màu xanh lục, có hay không có tâm đen. Một số loài Salmonella có thể phát triển thành khuẩn lạc có các chấm màu đen bóng, lớn hay phần lớn các khuẩn lạc hoàn toàn có màu đen. Một cách điển hình, có mộ số ít loài Salmonella sinh ra khuẩn lạc màu vàng có hoặc không có tâm đen. [9, 20] Cũng như bước tăng sinh chọn lọc, việc sử dụng hai hay nhiều môi trường phân lập sẽ cho phép gia tăng sự phát hiện số lượng các kiểu huyết thanh khác nhau trong mẫu, trong đó môi trường XLD được khuyến khích sử dụng. Hơn nữa, qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào Salmonella bị già và suy thoái, vì vậy cần phải phục hồi chúng bằng một trong các môi trường như Tryticase Soya Agar (TSA) hay Brain Heart Infusion (BHI) để nhân sinh khối và được dùng tiếp cho các phản ứng sinh hóa và phản ứng ngưng kết kháng huyết thanh về sau. 17 2.3.4 Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa Đây là bước xác nhận các dòng vi khuẩn nghi ngờ Salmonella trên môi trường phân lập bằng các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh đặc trưng. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella như sau: glucose (+), lactose (-), indol (+), lysine decarboxylase (+), ornithine decarboxylase (+), urea (-), mannitol (+), sorbitol (+). Nếu các biểu hiện sinh hóa phù hợp, chủng phân lập được khẳng định lại bằng các thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá và H đa giá. Vi khuẩn sau khi phục hồi được cấy chuyển sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella. Thử nghiệm trên môi trường Triple Sugar Iron agar (TSI) hay Kligler Iron Agar (KIA) để phân biệt các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae. Môi trường TSI hay KIA thường dùng để khảo sát sự lên men đường glucose, lactose và khả năng sinh khí H2S, khí H2 và CO2 của vi khuẩn. Trong môi trường có chất chỉ thị màu phenol red dùng để phát hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn. Đây là môi trường rắn, được chuẩn bị trong ống nghiệm ở thể nghiêng sâu. Về cơ chế, đường glucose luôn được vi sinh vật sử dụng trong điều kiện yếm khí tương đối, vì vậy ở phần đáy ở ống nghiệm nuôi cấy luôn tạo ra nhiều acid và làm thay đổi màu của môi trường từ đỏ sang vàng, đồng thời sản sinh ra gas. Đối với Salmonella do không sử dụng đường lactose và sucrose nên sự phân hủy các acid amin rất mạnh trong điều kiện hiếu khí, sau 24 giờ ủ, làm trung hòa hay chuyển kiềm mặt thạch nghiêng làm chúng có màu đỏ. Khi có màu đen xuất hiện ở vùng nối hai phần nghiêng và sâu là do Salmonella có khả năng khử sulfate có trong môi trường, tạo thành khí H2S. Chất này phản ứng với Fe 2+ (ferrous sulfate) để tạo thành kết tủa sulfua sắt màu đen. Nếu có sinh hơi thì có những bọt khí xuất hiện sâu trong ống thạch. [5, 29] Thử nghiệm lên men đường mannitol: Salmonella có khả năng lên men đường mannitol sinh acid sẽ làm giảm pH, do môi trường có chất chỉ thị màu phenol red nên chuyển từ màu đỏ thành màu vàng. [5] Thử nghiệm Lysine Decarboxylase (LDC): với phản ứng tím LDC, các vi khuẩn Salmonella có khả năng tạo enzyme lysine decarboxylase trong môi trường có 18 lysine, ngoại trừ một vài chủng của S. gallinarum và S. choleraesuis. Vì cơ chế lên men decarboxylase có thể tác động lên nhóm carboxyl (-COOH) của acid amin sinh ra amin và khí CO2. Do trong môi trường LDC broth có chứa các thành phần như chất chỉ thị màu bromocresol purple, chất pyridoxal, lysine monohydrochloride và 1% glucose. Các sản phẩm cuối cùng của hệ enzyme này sẽ chuyển pH sang kiềm, môi trường có màu tím hoặc xanh và có sinh khối. Phản ứng âm tính được thể hiện ở màu vàng của môi trường. [20] Thử nghiệm Urea phenol red broth: Salmonella không phân giải được urea thành NH3 nên không làm thay đổi pH, môi trường sau khi nuôi cấy vẫn giữ nguyên màu tím ban đầu. Phản ứng dương tính môi trường có màu đỏ hồng. [5, 20, 29] Khi các phản ứng sinh hóa phù hợp với Salmonella thì có thể kết luận các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella spp. Bất kỳ một trong bốn phản ứng sinh hóa trên không phù hợp thì không phải là Salmonella. 2.3.5 Phản ứng huyết thanh ngƣng kết trên phiến kính để định nhóm hay loại vi khuẩn Salmonella có 3 loại kháng nguyên: kháng nguyên O bền với nhiệt, được dùng để chia thành nhóm, kháng nguyên H không bền với nhiệt dùng để định loại, kháng nguyên Vi không bền với nhiệt thường che lấp ngăn chặn phản ứng kháng nguyên O. Từ những mẫu phân lập dương tính Salmonella, tiến hành định serotype để xác định những nhóm nào thường hiện diện trong các loại nhóm thực phẩm cũng như cung cấp thêm những thông tin đánh giá về tình hình vệ sinh do những nhóm vi khuẩn Salmonella nào nhiễm nhiều nhất từ đó có ý nghĩa trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm. Vì có hàng ngàn serotype Salmonella, nên việc xác định Salmonella không phải là đơn giản. Người ta đi vào các nhóm hỗn hợp, rồi đến các nhóm đơn giản dần. Có những nhóm hỗn hợp O như OMA, OMB, OMC, OMD… Nhóm OMA gồm các nhóm thường gặp nhất: A, B, E, L. Nhóm OMB gồm C, F, G, H. Nhóm OMC gồm I, J, K, M, N, O, P… Kháng huyết thanh sản xuất tại Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh có kháng huyết thanh O đa giá, OMA, OMB, kháng huyết thanh O đơn giá như các nhóm A, B, D, E, và C. Muốn xác định serotype nào cần phải thử ngưng kết với kháng huyết 19 thanh H. Ví dụ: S. typhi và S. enteritidis đều có thể gây nhiễm trùng máu, nên khi ngưng kết với kháng huyết thanh O nhóm D xong chúng ta phải làm thêm kháng huyết thanh H: nếu ngưng kết với H : d kết luận là S. typhi, nếu ngưng kết với H : g, m thì kết luận là S. enteritidis. [14] Trước hết ta dùng huyết thanh ngưng kết đa giá (Polyvalent O antiserum), loại này chứa tất cả kháng thể O của Salmonella từ A đến F, ngưng kết nhanh, hoàn toàn hầu hết vi khuẩn thuộc giống Salmonella. Nếu dương tính, sau đó tiếp tục làm phản ứng gốc vi khuẩn đó với huyết thanh ngưng kết nhóm (grouping antiserum) từ A đến F, sự ngưng kết này sẽ xảy ra nhanh và hoàn toàn nếu huyết thanh ngưng kết và gốc vi khuẩn cùng nhóm. [2] Nếu làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá vô nghiệm ta phải thực hiện phản ứng với huyết thanh ngưng kết Vi. Trường hợp kết quả phản ứng dương tính với huyết thanh ngưng kết Vi, chứng tỏ gốc vi khuẩn có kháng nguyên Vi che lấp phản ứng của kháng nguyên O với kháng thể O, do đó ta phải đun cách thủy huyền trọc vi khuẩn ở nhiệt độ 100oC trong 30 phút để loại bỏ kháng nguyên Vi khỏi bề mặt tế bào. Sau khi để nguội, làm phản ứng với huyết thanh ngưng kết đa giá và huyết thanh ngưng kết nhóm C và D. Nếu kết quả âm tính với cả hai loại huyết thanh ngưng kết đa giá và Vi, gốc vi khuẩn không phải là Salmonella. [2] 2.3.6 Các phản ứng sinh hóa xác định các loài phụ Salmonella Để xác định các loài phụ Salmonella phải tiến hành các phản ứng sinh hóa được trình bày trong Bảng 2.4. 20 Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa các loài và loài phụ của Salmonella [35] (*) : Typhimurium, Dublin -, + : 90% hay hơn cho phản ứng dương, -: 90% hay hơn cho phản ứng âm tính; d: các kiểu huyết thanh khác nhau cho phản ứng khác nhau Có bốn thử nghiệm sinh hóa chính để xác định các loài phụ của Salmonella: Thử nghiệm lên men đường sorbitol và dulcitol: Vi sinh vật lên men hai nguồn carbonhydrate sinh ra acid hữu cơ làm pH môi trường giảm và môi trường thay đổi từ màu đỏ sang màu vàng. Các loài phụ của Salmonella có hay không có khả năng lên men hai loại đường này. Hầu hết các loài Salmonella cho phản ứng dương tính thể hiện ở sự hình thành khí bên trong ống nghiệm và pH acid (màu vàng) của môi trường. Sự hình thành acid được kết luận là test dương tính. Test âm tính thể hiện ở chỗ không Loài S. enterica S. bongori Loài phụ I II IIIa IIIb IV VI V Đặc điểm sinh hóa Dulcitol O.N.P.G (4h) Malonate Gelatinase Sorbitol Nuôi cấy với KCN Galacturonate - glutamyltransferase - glucuronidase Salicine Lactose + - - - + - - +(*) d - - + - + + + - + + d - - - + + + + - - - - - -(75%) - + + + + - + + + - +(75%) - - - + + + + + - + - d d - + - - + + d - d + + - - + + + + - - - 21 có khí tạo thành và môi trường có màu đỏ hồng. Tất cả các kiểu huyết thanh thuộc loài S. enterica I đều lên men hai loại đường này. [9] Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate: dùng để khảo sát khả năng sử dụng sodium malonate làm nguồn carbon duy nhất. Khi vi khuẩn sử dụng malonate sẽ phóng thích NH3 làm sinh ra phản ứng kiềm, biến đổi môi trường từ màu xanh lá cây sang màu xanh dương với chất chỉ thị màu là bromothymol blue. Các loài phụ của Salmonella đều có hoặc không có khả năng sử dụng malonate, riêng S. enterica I không có khả năng này. [5, 9] Thử nghiệm ONPG (o – Nitrophenyl - - D – Glucoside): xác định sự có mặt hay không có mặt enzyme - galactosidase nhờ vào sử dụng một chất hữu cơ tổng hợp o – Nitrophenyl - - D – galactopyranoside (gọi tắt ONPG) được xem như là cơ chất đối với enzyme - galactosidase. Khi vi khuẩn giải phóng enzyme - galactosidase thì chúng sẽ phân cắt cơ chất này để giải phóng orthonitrophenyl làm môi trường xuất hiện màu vàng. Mục đích của phản ứng để phân biệt các vi khuẩn có khả năng sử dụng đường lactose hay vi khuẩn không sử dụng được lactose (không có - galactosidase). S. enterica I do không có gen mã hóa enzyme - galactosidase nên phản ứng ONPG âm tính. [2, 13] 22 2.4 Một số phƣơng pháp kiểm tra nhanh Salmonella Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới vẫn đang áp dụng phương pháp nuôi cấy để phát hiện Salmonella trong thực phẩm. Đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn được chấp nhận rộng rãi. Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và công sức lao động cho các công việc như: chuẩn bị môi trường, dụng cụ, thực hiện quy trình… Thời gian để có kết quả phân tích phải mất từ 4 – 6 ngày. Với thời gian này đã không đáp ứng được các yêu cầu cho kết quả nhanh trong việc phục vụ các chương trình giám sát chất lượng thực phẩm trên dây chuyền sản xuất như hiện nay, hoặc gây thiệt hại cho các nhà quản lí doanh nghiệp vì các chi phí lưu kho để chờ kết quả phân tích…Thay vì phải tiến hành các test sinh hóa truyền thống trong ống nghiệm, có thể sử dụng bất kỳ một trong bốn hệ thống test sinh hóa có bán sẵn trên thị trường (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, hay MICRO-ID) để định danh các vi khuẩn Salmonella nói chung trong thực phẩm.[1, 9, 27] Ngoài phương pháp truyền thống để phân lập và định danh Salmonella, còn có một số phương pháp kiểm tra nhanh Salmonella có thể thực hiện việc kiểm tra trên nhiều mẫu trong thời gian ngắn: 2.4.1 Phƣơng pháp dựa trên DNA 2.4.1.1 Phƣơng pháp PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật dùng để khuyếch đại một trình tự DNA xác định trong điều kiện in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phản ứng dùng men DNA polymerase chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để nhân bản một đoạn DNA lên 200 000 lần. Phương pháp PCR hiện đang được áp dụng rộng rãi trên thế giới và trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp định tính Salmonella trong thực phẩm bằng kỹ thuật PCR dựa vào việc xác định đoạn DNA đích có hiện diện hay không. Kỹ thuật này bao gồm các bước như sau: tiền tăng sinh trong môi trường BPW, xử lý tế bào để thu nhận khuôn DNA, thực hiện phản ứng PCR, phân tích kết quả. Ưu điểm của PCR: (1) thời gian cho kết quả nhanh. (2) có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy. (3) hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ 23 lưu trữ hơn phương pháp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi tường chuẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường. (4) Ít tốn kém công lao động. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. [15] 2.4.1.2 Phƣơng pháp Realtime – PCR Phương pháp Realtime PCR cũng dựa trên cơ sở PCR nhưng trong quá trình phản ứng tổng hợp sẽ gắn vào một tác nhân phát hiện, thông thường là một chất phát huỳnh quang được gắn vào một mẫu dò như chất Silber green II. Cơ chế của Realtime – PCR là mỗi một sản phẩm tạo ra sẽ gắn với một chất huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với số lượng sản phẩm tạo thành. Số lượng bản đích ban đầu càng cao thì số chu kỳ để phát hiện sản phẩm khuyếch đại càng ít. 2.4.1.3 Phƣơng pháp lai phân tử Phương pháp này được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cũng như phương pháp PCR, phương pháp này hiện nay cũng được thương mại hóa dưới dạng những bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. 2.4.2 Phƣơng pháp dựa trên kháng nguyên – kháng thể 2.4.2.1 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi trong ngành y tế, ngoài việc định tính vi sinh vật gây bệnh, ELISA còn được sử dụng trong việc chuẩn đoán bệnh AIDS, sốt xuất huyết, viêm gan… Phương pháp có ưu điểm là cho kết quả nhanh chỉ trong vài giờ sau giai đoạn tăng sinh, có độ nhạy rất cao nhưng có độ đặc hiệu thấp, số mẫu cho kết quả dương tính giả cao. Vì thế phương pháp này được dùng để sàng lọc, tất cả các mẫu cho kết quả dương tính đều cần phải được xác nhận bằng phương pháp nuôi cấy. 2.4.2.2 Phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang Dựa vào kháng thể được nhuộm huỳnh quang để phát hiện Salmonella. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gồm: chuẩn bị kháng nguyên và cố định vết bôi kháng nguyên trên lam kính, nhuộm vết bôi bằng cách dùng chất ngưng kết có gắn chất phát huỳnh quang, kết quả được chụp qua kính hiển vi. Trên các các lam kính, Salmonella 24 phát quang vàng xanh trên nền đen, các vật khác hiện diện trên vết bôi phân biệt dễ dàng với Salmonella do chúng bắt thuốc nhuộm yếu hay không nhuộm và thiếu hình dạng phù hợp. Phương pháp này linh động, nhanh, kết quả được phát hiện sau vài giờ. Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian thực hiện Thời gian thực hiện đề tài từ 01/03/2005 đến 01/08/2005. 3.1.2 Địa điểm thực hiện Nơi lấy mẫu: Mẫu được lấy tại các chợ trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh như chợ Bà Chiểu và chợ Nguyễn Đình Chiểu quận Phú Nhuận, chợ Tân Phú quận Thủ Đức… Nơi tiến hành phân tích thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Môi trường tại Trung tâm Phân tích Hóa sinh – Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu 3.2.1 Dụng cụ và thiết bị 25 3.2.1.1 Dụng cụ Bình tam giác, cốc, ống đong hình trụ 50, 100, 500 ml, pipetman, ống nghiệm, hộp đĩa petri, que cấy vòng, que cấy thẳng, đèn cồn, bao PE vô trùng, kéo cắt, pince kim loại, khay kim loại, lame, màng lọc có kích thước lỗ lọc là 0,45 m, và bơm hút chân không. 3.2.1.2 Thiết bị Cân phân tích, máy đo pH, máy dập mẫu, kí