Khóa luận Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nước uống

ngay khi tiếp xúc với không khí. Thường được tìm thấy trong đất, trong phân các loài động vật và người. Là loài gây bệnh uốn ván rất nguy hiểm. Sự sản sinh vi khuẩn và độc tố chỉ diễn ra nơi các vết thương có các quá trình oxy hóa khử ở mức thấp, chẳn hạn như những vết thương có chứa các mô tế bào đã mất sức sống, các dị vật hoặc nhiễm trùng đang hoạt động. C. tetani bản thân nó không gây ra viêm. Tuy nhiên, các bào tử của nó có thể tồn tại hàng năm trong một số môi trường với đủ loại thuốc khử trùng và không bị diệt khi đun sôi 20 phút. 2.3.4. Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa trước đây là Bacterium aeruginosa do Schroeter mô tả vào năm 1872, đến năm 1900 Migula chuyển chúng sang giống Pseudomonas, từ đó vi khuẩn mang tên Pseudomonas aeruginosa (Psedes: tiếng Hy Lạp: giả; monas: tiếng Hy Lạp: đơn vị; aeruginosa: gỉ đồng) thường được gọi là trực khuẩn mủ xanh [43].  Sự phân bố P. aeruginosa phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, trên bề mặt động thực vật, đặc biệt là những nơi môi trường ẩm ướt chúng sinh sôi và phát triển rất mạnh. Trong tự nhiên người ta tìm thấy chúng trên bề mặt nhiều loại rau quả, trên cơ thể và phân một số động vật. Trong cơ thể người, P. aeruginosa hiện diện thường xuyên trong đường tiêu hóa và một số nơi ẩm ướt trong cơ thể như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay, … Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh trưởng trong các môi trường hạn chế sự có mặt của các vi sinh vật khác như chất khử trùng, thuốc mỡ, xà phòng, nước cất, …  Hình thái P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, hình dạng thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, 2 đầu tròn, kích thước 0,5-1 µm x 1,5-5 µm. Có một lông duy nhất ở 1 cực, các pili của chúng dài khoảng 6 nm, là nơi tiếp nhận nhiều loại 14 phage và giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ. P. aeruginosa là loài không sinh bào tử.  Đặc điểm nuôi cấy Vi khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, điều kiện hiếu khí tuyệt đối. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C, phát triển được ở nhiệt độ 50C- 42 0C, pH thích hợp là 7,2-7,5 (có thể chịu được pH từ 4,5-9). Trên môi trường đặc thường có 2 loại khuẩn lạc: một loại to, dẹt, nhẵn, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi.  Sắc tố Tính chất đặc trưng của loại vi khuẩn này là sinh sắc tố và chất thơm. Có 2 loại sắc tố chính: pyocyanin có màu xanh lam tan trong nước và chlorofoc làm cho môi trường nuôi cấy và khuẩn lạc có màu xanh, pyoverdin là sắc tố phát huỳnh quang tan trong nước nhưng không tan trong chlorofoc. Chất thơm do trực khuẩn sinh ra là Kimetylamin [18]. Có khoảng 10% P. aeruginosa không sinh sắc tố. Trong những trường hợp này chẩn đoán vi khuẩn học gặp nhiều khó khăn. Người ta phải dùng các môi trường tăng sinh sắc tố: môi trường King A (tăng sinh pyocianin) và môi trường King B (tăng sinh pyoverdins).  Đặc điểm sinh hóa P. aeruginosa có đủ các cytochrom (b, c, a và oxidase) trong hệ thống vận chuyển điện tử. Trong thực hành người ta thường dùng “oxidase test” để tìm sự có mặt của cytochrom oxidase. Các tính chất sinh hóa thường sử dụng trong lâm sàng gồm: urease (-), indol (-), H2S (-); citrat Simmon, agrinin dihydrolase và gelatinase (+); khử NO3 - thành N2. Trên môi trường OF (Oxidation-Fermentation) nhiều loại carbohydrat bị thoái hóa theo lối oxy hóa có sinh acid: glucose, mannitol, glycerol, ethalnol, arabinose, fructose và galactose. 15  Khả năng đề kháng Chết nhanh chóng ở 1000C; trong môi trường ẩm, thoáng và không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu; 50C, chúng sống được hơn 6 tháng.  Kháng nguyên Kháng nguyên O chịu nhiệt, bản chất hóa học là lipopolysaccharid (LPS), dựa vào kháng nguyên này người ta chia P. aeruginosa thành 12 nhóm. Kháng nguyên H không chịu nhiệt, là kháng nguyên lông. Vì khó khăn trong việc điều chế, nên việc định týp huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chưa được áp dụng rộng rãi.  Khả năng gây bệnh P. aeruginosa là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mạn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện, việc sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc các vết bỏng, vết thương hở,…. Chúng có thể gây ra nhiêu bệnh khác nhau: gây viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu, viêm màng não mủ và áp xe não, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh hóa sừng ở mắt, gây nhiễm trùng da, mô mềm, … [15]. P. aeruginosa xâm nhiễm vào trong mắt thường gây ra những tổn thương giác mạc, sự nhiễm này thường liên quan đến việc sử dụng kính sát tròng [23]. Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu tại Viện Mắt trong vòng khoảng 20 nǎm trở lại đây, P. aeruginosa đã vượt lên với trên 70% các trường hợp xét nghiệm vi khuẩn dương tính trong viêm loét giác mạc do vi khuẩn. Hiện nay, vi khuẩn này là nguyên nhân hàng đầu gây viêm loét giác mạc sau chấn thương nông nghiệp[15]. Các bệnh nhân nằm viện bị mắc các chứng bệnh về tim mạch, tiểu đường hay bị các u ác tính bị sốc do nhiễm trùng máu thường có tỉ lệ tử vong khá cao. Tác nhân thường gặp là P. aeruginosa chiếm từ 5% đến 50% so với các tác nhân vi khuẩn khác. 16 P. aeruginosa dẫn đầu trong các tác nhân nhiễm trùng hô hấp bệnh viện, đặc biệt đối với những bệnh nhân có hỗ trợ các máy thông khí, khả năng bị viêm phổi cao gấp 20 lần và tỉ lệ tử vong cao. Một số nghiên cứu còn cho thấy P. aeruginosa giữ vai trò gây bệnh trong giai đoạn đầu và cuối của bệnh đái tháo đường [23]. Loài này còn là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh. Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và các yếu tố di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng biến nạp và tải nạp tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới. P. aeruginosa hiện kháng với rất nhiều loại kháng sinh nên việc làm kháng sinh đồ trước khi điều trị là cần thiết [15]. 2.4. Kháng sinh và tính kháng thuốc của vi khuẩn 2.4.1. Thuốc kháng sinh 2.4.1.1. Định nghĩa Kỷ nguyên hiện đại của hóa trị liệu kháng khuẩn được bắt đầu từ việc tìm ra sulfonamid (Domagk, 1936) “Thời kỳ vàng son” của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng trong lâm sàng (1941). Khi đó, “kháng sinh được xem là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác”[3][4]. Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể: Tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (cloramphenicol). Tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon. Chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn”. 2.4.1.2. Phân loại Một số thuốc kháng sinh có cấu trúc hóa học giống nhau, do đó chúng có chung cơ chế tác động và hoạt phổ tương tự nhau. Dựa trên cấu trúc hóa học, người ta có thể xếp kháng sinh theo các nhóm như sau: 17 Nhóm -lactam: penicillin, ampicillin, cephalosporin, … Nhóm tetracyclines: tetracyclin, oxytetracyclin, … Nhóm phenicol: chloramphenicol, thamphenicol, … Nhóm aminoglycosides: gentamycin, kanamycin, amikacin , … Nhóm macrolides: tylosin, spiramycin, … Nhóm kháng sinh gần gũi với macrolides: lycomycin, virginiamycin, … Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin,… Nhóm sulfamides: sulfamethoxazol, sulfadimidin, … Nhóm quinolones: oxfloxacin, ciprofloxacin, … Ngoài ra còn có một số nhóm khác như glycopeptid, nitrofuran, … Bên cạnh việc phân loại theo cấu trúc hóa học, ta cũng có thể phân loại kháng sinh theo tác động kháng khuẩn: Nhóm kháng sinh kiềm khuẩn: tetracylin, macrolid, phenicol, sulfamid, … Nhóm kháng sinh diệt khuẩn: -lactam, amynosid, quynolones, polypeptid,… 2.4.1.3. Cơ chế tác động Ức chế tổng hợp vách tế bào: gồm các kháng sinh: penicillin, cephalosporins, bacitracin, vancomycin, … Khác với tế bào động vật, vi khuẩn có một lớp vỏ cứng bên ngoài gọi là vách tế bào, có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào. Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của thuốc kháng sinh, các vi khuẩn Gram dương biến thành dạng hình cầu không có vách và vi khuẩn Gram âm có vách không hoàn chỉnh. Những hình thức này làm cho tế bào bị vỡ trong điều kiện có trương lực bình thường. Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào: gồm nhóm thuốc chống nấm: colistin, imidazol, polymycin, nistatin, amphotericin B, … Tế bào chất của tất cả tế bào sống đều được bao bọc bởi một màng tế bào chất. Màng này được xem như một hàng rào có khả năng thẩm thấu chọn lọc, thực hiện chức năng vận chuyển chủ động và như vậy kiểm soát các thành phần ở bên 18 trong tế bào. Nếu sự toàn vẹn chức năng của màng tế bào chất bị phá vỡ thì những đại phân tử và những ion sẽ thoát ra khỏi tế bào làm tế bào chết. Ức chế tổng hợp protein: gồm các họ chloramphenicol, tetracyclines, lincomycins, … Vi khuẩn có ribosom 70 S, gồm 2 đơn vị là 30 S và 50 S. Kháng sinh có thể gắn lên các đơn vị này để ngăn cản sự tạo thành polysom trong dịch mã. Ức chế tổng hợp acid nucleic: Kháng sinh tác động vào quá trình sao chép DNA (nhóm quinolones), ức chế sao mã RNA (nhóm rifampicin) và ức chế tổng hợp các nucleotid (nhóm sulfamid và trimethoprim). 2.4.2. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Trong cuộc cạnh tranh giữa sự phát triển kháng sinh mới với sự đề kháng mới của vi sinh vật, thì cho đến nay vi sinh vật vẫn chiếm ưu thế. Quá trình này được thúc đẩy mạnh, nếu thiếu sự hiểu biết và sử dụng thuốc sai trong điều trị. Có hai dạng đề kháng: đề kháng giả và đề kháng thật. 2.4.2.1. Đề kháng giả Khi hệ thống miễn dịch của cơ thể suy giảm (do dùng corticoid, tia xạ, …) hoặc chức năng của đại thực bào bị hạn chế (ví dụ ở ổ mủ), thì cơ thể không đủ khả năng loại trừ được những vi khuẩn đã bị kháng sinh ức chế ra khỏi cơ thể. Khi vi khuẩn tự đề kháng: Ở trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa do thiếu oxy, pH thay đổi …), vi khuẩn không chịu tác dụng của kháng sinh. Khi có vật cản, tuần hoàn ứ trệ, kháng sinh không thấm tới ổ viêm thì vi khuẩn cũng tỏ ra đề kháng. 2.4.2.2. Đề kháng thật  Đề kháng tự nhiên: Một số loại vi khuẩn luôn luôn không chịu tác dụng của một số kháng sinh. Ví dụ P. aeruginosa kháng với penicillin G, tụ cầu không chịu tác dụng của colistin. Một số vi sinh vật không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách như penicillin, cephalosporin, vancomycin. 19  Đề kháng thu được: Do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng. Đột biến gen: Biến cố này có thể xảy ra trước hoặc sau khi tiếp xúc với kháng sinh. − Đột biến một bước: Mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng rất cao. − Đột biến nhiều bước: Mức độ đề kháng có liên quan đến mức độ kháng sinh. Trong trường hợp này, kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sẽ cao hơn lần trước. Gen đề kháng sau khi xuất hiện sẽ lan truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Nhận gen đề kháng: Gen đề kháng có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức vận chuyển chất liệu di truyền như sau: − Tiếp hợp: Hai vi khuẩn tiếp xúc nhau và truyền cho nhau gen đề kháng. − Biến nạp: Khi vi khuẩn đề kháng bị ly giải, giải phóng các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác. − Tải nạp: Phage mang gen đề kháng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. 20 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2007 đến tháng 07 năm 2007 tại Phòng vi sinh thực phẩm – Khoa LAM – Viện Pasteur Tp. HCM. 3.2. Vật liệu Nhóm 1: nước uống đóng chai Nhóm này gồm 2 loại: nước uống tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên. Nhóm 2: nước uống xử lý: nước uống được xử lý không theo quy trình công nghiệp khép kín, nước nguồn có thể là nước giếng hoặc nước máy được lọc bằng các máy lọc nước thông thường hoặc bằng cách đun sôi. Nhóm này gồm các loại: nước uống trường học, nước uống gia đình, nước uống công ty được khách hàng mang đến viện Pasteur phân tích. Ngoài ra, được xếp vào nhóm này còn có các mẫu nước được chúng tôi lấy từ các bình lọc nước uống trong các bệnh viện trong thành phố. 3.3. Thiết bị, hóa chất và môi trƣờng 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ Tủ sấy để khử trùng khô và một nồi hấp áp lực. Tủ ấm hoặc nồi cách thủy kiểm tra được nhiệt độ 350C ± 0,50C hoặc ở 37 0C ± 0,50C. Tủ ấm hoặc nồi cách thủy kiểm tra được nhiệt độ 440C ± 0,250C hoặc ở 44,50C ± 0,250C. Bình ủ kỵ khí. pH mét, nhiệt kế. Dụng cụ lọc màng. Đèn UV. Kẹp để giữ màng lọc, găng tay. 21 Màng lọc thông thường có đường kính 47mm hoặc 50mm, có đặc tính lọc tương đương với lỗ có đường kính định danh là 0,45µm, nếu chưa được khử trùng thì phải khử trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phiến kính và lá kính. Pipette Pasteur, pipette 2ml, 5ml. Đĩa petri. 3.3.2. Hóa chất Cồn Nước cất, nước nuối sinh l ý Thuốc thử oxidase, Kovac’s, Nessler, oxy già (H2O2) 3.3.3. Môi trƣờng Sử dụng các môi trường, thuốc thử và hóa chất của hãng Biorad, thành phần môi trường xem thêm chi tiết ở phụ lục B. Thạch lactoza TTC với Tegitol 7 Nước pepton lactoza Nước trypton Canh thang manitol lauryl trypto với tryptophan Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Thạch mật asculin-nitrua Thạch sunphit triptoza Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường King’s B Thạch dinh dưỡng Canh thang acetamide Thạch Mueller-Hinton 22 Hình 3.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng Hình 3.2: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc và đọc kết quả kháng sinh Hình 3.3: Bình ủ kỵ khí 23 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Áp dụng theo TCVN 5992-1995 (ISO 5669-2:1991) [11]  Nguồn gốc mẫu thí nghiệm: Nước uống đóng chai: nước tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên. Nước uống xử lý: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống bệnh viện, nước uống gia đình.  Quá trình lấy mẫu: Sát trùng bên ngoài vòi nước, mở vòi cho nước chảy một lúc rồi hứng vào các chai đựng. Dụng cụ chứa nước là các chai thủy tinh có thể tích 1,25 ml được vô trùng trước khi lấy mẫu. Lấy mẫu xong phải đậy kín bình chứa rồi nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm và lọc ngay trong ngày. Nếu để sang ngày hôm sau phải được trữ trong tủ mát ở nhiệt độ 40C. 3.4.2. Xử lý số liệu Từ các kết quả phân lập vi khuẩn của nước uống đóng chai và nước uống xử lý, chúng tôi xử lý số liệu theo thống kê mô tả. Tiếp theo các kết quả về tỉ lệ phần trăm khác biệt được phân tích về mặt ý nghĩa thống kê với P < 0,05 bằng phép kiểm 2 test. Tính đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa cũng được phân tích sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê theo nhóm (nước uống đóng chai hoặc nước uống xử lý). Trong trường hợp mẫu nhỏ, phép kiểm sẽ được xử lý hiệu chỉnh Yates. 24 3.4.3. Đánh giá kết quả Chỉ tiêu vi sinh vật kiểm tra áp dụng theo TCVN 6096:2004 [1] + Đọc kết quả: Trong một chỉ tiêu, nếu số vi khuẩn hiện diện ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai. Nếu số vi khuẩn ≥ 2 thì coi như chỉ tiêu đó không đạt tiêu chuẩn. + Biện giải kết quả: Nếu một mẫu bị vi phạm bất cứ chỉ tiêu nào trong các chỉ tiêu trên thì đều không đạt tiêu chuẩn vi sinh. Kiểm tra lần đầu Giới hạn Coliforms tổng số 1x250 ml Không được phát hiện trong bất kỳ mẫu nào Nếu ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai Nếu ≥ 2 thì loại bỏ Coliform fecal hoặc E. coli 1x250 ml Streptococcus fecalis 1x250 ml Pseudomonas aeruginosa 1x250 ml Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphite 1x50 ml 25 3.4.4. Phƣơng pháp thử nghiệm vi sinh vật 3.4.4.1. Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và Escherichia coli giả định Áp dụng theo TCVN 6187-1:1996; ISO 7899-2:1990(E) [12].  Nguyên tắc Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc trên môi trường nuôi cấy thạch lactoza chọn lọc hoặc một miếng đệm hấp thụ bão hòa bằng môi trường lỏng chọn lọc chứa lactoza. Nuôi cấy màng lọc trong 24 giờ ở nhiệt độ 350C hoặc 370C để phát hiện vi khuẩn Coliform, hoặc ở 440C để phát hiện Coliform fecal. Đếm trực tiếp các khuẩn lạc đặc trưng được hình thành trên màng; cấy chuyển các khuẩn lạc đặc trưng để thử nghiệm xác định khả năng sinh khí và sinh indol. Tính toán số vi khuẩn Coliform, Coliform fecal và E. coli giả định có trong 250 ml mẫu.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Thạch lactoza TTC với Tegitol 7 Môi trường khẳng định: Môi trường để kiểm tra sự sinh khí: Nước pepton lactoza Môi trường để kiểm tra sự sinh indol: Nước trypton Môi trường ống đơn để kiểm tra sự sinh khí và indol: Canh thang manitol lauryl trypto với tryptophan Thuốc thử: Thuốc thử Kovac’s để thử indol Thuốc thử oxidase dùng cho phép thử oxidase 26  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và E. coli giả định Lactose TTC + Tergitol 7 - Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-) Lactose TTC + Tergitol 7 Ủ (37 ± 0,5)0C/18-24 giờ - Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Nước trypton (sinh indol) Ủ 370C/ 48 giờ Ủ 440C/ 24 giờ - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-) Coliforms tổng số - Thử indol (+) E.coli giả định Đếm các khuẩn lạc đặc trưng (vàng, da cam hoặc đỏ gạch) Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang một môi trường xác định Coliforms Đếm các khuẩn lạc đặc trưng (vàng, da cam hoặc đỏ gạch) Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang một môi trường xác định Coliform fecal và E.coli Ủ(44 ± 0,25)0C/18-24 giờ Coliform fecal 27 3.4.4.2. Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân (Streptococcus fecalis) Áp dụng theo TCVN 6189-2:1996; ISO 7899-2:1984(E) [13].  Nguyên tắc Đếm liên cầu phân dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri nitrua (để ngăn sự sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm) và 2,3,5- triphenyltetrazoli chlorua liên cầu phân sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành focmazan màu đỏ. Sau khi nuôi cấy, tất cả khuẩn lạc đã mọc sẽ cho màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng toàn bộ khuẩn lạc hoặc từ trung tâm, toàn bộ các khuẩn lạc được đếm là liên cầu phân giả định. Môi trường khẳng định, thạch mật asculin-nitrua, được nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ 440C. Liên cầu phân phát triển trong môi trường này và thủy phân asculin, sản phẩm cuối cùng, 6,7-dihydroxycourmarin sẽ kết hợp với ion Fe3+ cho hợp chất màu nâu vàng tới đen và khuếch tán vào môi trường. Ngoài ra, tiến hành một phép thử catalase đối với các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường khẳng định. Những khuẩn lạc cho phản ứng asculin dương tính và catalase âm tính thì có thể xem là liên cầu phân.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Môi trường khẳng định: Thạch mật asculin-nitrua Thuốc thử catalase: Hydropeoxit dung dịch 30g/l 28  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.2: Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân Streptococcus fecalis Ủ 370C/ 24h SLANTZ & BARTLEY Ủ (37 ± 1)0C/ (44 ± 4)h Đếm các khuẩn lạc màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc và cấy chuyển các khuẩn lạc điển hình sang môi trường Thạch dinh dưỡng Thạch mật asculin – nitrua (BEA) Ủ(44 ± 0,5) 0 C / 48h Thử catalaza (-) Xuất hiện khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen và/hoặc môi trường bao quanh có màu nâu hoặc đen Liên cầu phân 29 3.4.4.3. Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clostridium) Áp dụng theo TCVN 6191-2:1996; ISO 6461-2:1986(E) [14].  Nguyên tắc Lựa chọn các bào tử Chọn lọc các bào tử có trong mẫu bằng cách đun nóng trong một khoảng thời gian (80 0C trong 10 phút) đủ để tiêu diệt các vi khuẩn dinh dưỡng. Lọc qua màng và nuôi cấy Lọc mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ sao cho các bào tử vi khuẩn (0,2 m) được giữ lại trên màng lọc. Đặt màng lọc vào môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định (thạch sắt sunphit), tiếp theo ủ ở 370C ± 10C trong 20 ± 4 giờ và 44 ± 4 giờ và đếm các khuẩn lạc có màu đen.  Môi trường nuôi cấy Thạch sunphit triptoza  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (50 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,2 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.3: Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clotridium) Thạch - sunphit - tryptoza Ủ (37 ± 1)0C/(20 ± 4)h và (44 ± 4)h (Ủ trong điều kiện kỵ khí) Đếm các khuẩn lạc màu đen Bào tử vi khuẩn kỵ khí sunphit (Clostridium) 30 3.4.4.4. Phát hiện và đếm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Áp dụng theo ISO 16266:2006(E) [15].  Nguyên tắc Lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt trên môi trường chọn lọc và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp. Sau khi ủ đếm các khuẩn lạc P. aeruginosa giả định trên màng lọc. Các khuẩn lạc tạo sắc tố pyocyanin có màu xanh da trời hoặc màu xanh lá cây được khẳng định là P. aeruginosa, nhưng các khuẩn lạc khác không tạo màu xanh mà lại phát huỳnh quang dưới đèn UV hoặc có màu nâu đỏ cũng yêu cầu khẳng định. Cấy chuyển các khuẩn lạc cần khẳng định trên màng lọc sang môi trường thạch dinh dưỡng. Sau khi ủ, các khuẩn lạc ban đầu không phát huỳnh quang được thử phản ứng oxidase và các khuẩn lạc có oxidase dương tính được thử khả năng tạo sắc tố và tạo amoniac từ acetamide, các khuẩn lạc ban đầu phát huỳnh quang được thử khả năng tạo amoniac từ acetamide.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường khẳng định: Môi trường King’s B Canh thang acetamide Thạch dinh dưỡng Thuốc thử: Thuốc thử oxidase Thuốc thử Nessler 31  Cách tiến hành Lọc một lượng xác định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.4: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Nessler (mt chuyển màu vàng  đỏ gạch) Khuẩn lạc tạo màu xanh da trời/ xanh lá cây (pyocyanin) Đếm tất cả Thạch CN Khuẩn lạc không tạo màu xanh Kiểm tra dưới đèn UV Khuẩn lạc màu nâu đỏ, không phát huỳnh quang Khuẩn lạc không tạo sắc tố pyocianin, phát huỳnh quang - Thạch dinh dưỡng - Canh thang acetamide - King’ B Canh thang acetamide Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h - Oxidase (+) - Sinh amoniac - Phát huỳnh quang dưới UV Sinh amoniac P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa 32 3.4.5. Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ Trong nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng, phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch được sử dụng để kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn. Kết quả kháng sinh đồ giúp cho việc điều trị được chính xác và hạn chế việc sử dụng kháng sinh bừa bãi [17][33] [28]. 3.4.5.1. Các kháng sinh thử nghiệm Chọn lựa các kháng sinh thích hợp nhất để thử nghiệm và phúc trình kết quả là một quyết định hay nhất của phòng thí nghiệm lâm sàng để có thể tham vấn được việc trị liệu kháng sinh. Tuy nhiên phòng thí nghiệm có thể tuỳ điều kiện thực tế có thể thêm hay bớt một hay một số kháng sinh. Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn P. aeruginosa với 16 loại kháng sinh theo tiêu chuẩn NCCLS-2007 (Ủy ban quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng) và CA-SFM-2004 (Hội đồng kháng sinh – Hiệp hội vi sinh của Pháp). Bảo quản kháng sinh: Các đĩa kháng sinh được đóng gói đảm bảo điều kiện không hút ẩm và được giữ ở nhiệt độ 80C hoặc thấp hơn. Nên lấy các lọ chứa đĩa kháng sinh còn đóng kín ra khỏi tủ lạnh 1 đến 2 giờ để nhiệt độ trong lọ bằng với nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi mở nắp. Chỉ sử dụng các đĩa còn hạn dùng, loại bỏ các đĩa kháng sinh quá hạn. Hình 3.4: Các kháng sinh thử nghiệm 33 Bảng 3-1: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ (*) National Committee for Clinical Laboratory Standards (2007), Perf