Khóa luận Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Một số loại nấm men như: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces liquefacien. Nấm men sinh sản bằng cách nẩy chồi, nguồn chất có đường. Hình dạng của chúng rất đa dạng như hình cầu, hình trứng, hình oval. (hình 2.4) Hình 2.4: Khuẩn lạc và tế bào nấm men [11] Nấm mốc sinh sản bằng bào tử hay đoạn sợi, có hệ sợi là sợi khí sinh ( sợi sinh sản), nhiệt độ thích hợp từ 28-320C, ẩm độ cơ chất là 60%, có nguồn chất là bội đường ( hình 2.5) Hình 2.5: Khuẩn lạc và hệ sợi nấm mốc [11] Cách phân biệt nấm men, nấm mốc Nấm men là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty Nấm mốc là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nẩy chồi. Thỉnh thoảng có thể nhìn thấy các tế bào kết nối thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm. CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN SẴN. Thời gian thực hiện khóa luận Ngày 09 tháng 05 năm 2011 đến ngày 26 tháng 06 năm 2011 Vật liệu Mẫu thực phẩm chế biến sẵn. Hóa chất – môi trường Buffer Pepton Water (BPW) Plate Count Agar (PCA) Tryptone Soya Agar (TSA) Violet Red Bile Agar ( VRB) Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) Eosine Methylene Blue Agar(EMB) Canh trypton Canh MR-VP Thạch Simmon citrate Agar Thuốc khử Kovac’s Thuốc khử Methyl Red Thuốc khử α- naphtol 5% KOH 40% Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC) Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ( DRBC) Môi trường canh LSB Dụng cụ Ống nghiệm không nắp Ống nghiệm có nắp Đĩa Petri vô trùng Cân điện tử Bình tam giác Bình định mức Cốc thủy tinh Kéo Đũa thủy tinh Túi nilon vô khuẩn Đèn cồn Que cấy thẳng Que cấy vòng Bình chứa môi trường Khăn giấy Bông y tế Bông không thấm nước Pipetman Thiết bị Autoclave Tủ lạnh Bếp từ Tủ ấm 44oC Tủ ấm 30oC Tủ ấm 37oC Tủ sấy 180oC Tủ cấy Bếp đun Bể ổn nhiệt Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm Thu và chứa mẫu Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và được mang về phòng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng mẫu cần phân tích Dụng cụ thu mẫu thay đổi tùy loại sản phẩm. Trường hợp thực phẩm đông lạnh, có thể sử dụng các ống khoan tay vô trùng, dao đã được sát trùng để tách thành lượng mẫu cần thiết, sau đó dùng thìa, kéo… để cho mẫu vào trong dụng cụ chứa. Lưu ý tránh thu các mảng băng. Trường hợp thực phẩm đã đóng gói thành nhiều mức, thực hiện thu mẫu bằng cách chọn lấy các gói lớn từ đó lấy ra các bao nhỏ hơn. Khối lượng tổng cần thu của mỗi mẫu thay đổi tùy thuộc số lượng các chỉ tiêu cần phân tích nhưng ít nhất là khoảng 100 – 250g. Mẫu cần đảm bảo tính đại diện để có được khối lượng mẫu cần thiết, cần thu gộp mẫu tại nhiều vị trí trên nguyên liệu hay thành phẩm. Trường hợp mẫu phân tích là bán thành phẩm đang được chế biến, cần thực hiện thu mẫu tại nhiều vị trí trong cùng một công đoạn. Đối với các loại mẫu như thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu là bề mặt. Do vậy, có thể sử dụng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hay cắt lát với bề dày 2 - 3mm để thu mẫu. Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, bao nylon chứa mẫu. Tránh sử dụng các bình bằng thủy tinh để chứa mẫu vì dễ vỡ. Vận chuyển và bảo quản mẫu Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các thùng bảo quản mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngay khi có thể. Nếu không phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -20oC cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông thì có thể được bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 4oC nhưng không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. Chuẩn bị mẫu Rã đông mẫu trước khi phân tích Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phân tích. Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bên trong các dụng chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm, không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 – 5oC trong khoảng 18 giờ. Khi cần thiết, có thể giải đông nhanh ở 45oC trong 15 phút. Trường hợp này, cần liên tục lắc bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu. Cân mẫu Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ±0,1g. Lượng mẫu này được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng. Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thích hợp. kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau: Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tế bào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không được dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể phát triển được Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào ống nghiệm có nắp. Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân 25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha loãng như mong muốn ( hình 3.1). Hình 3.1 : Pha loãng mẫu [8] Đồng nhất mẫu Do sự phân bố không đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làm đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), trong điều kiện vô trùng. Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chi tiêu phân tích, thực hiện thu một lượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích. Ví dụ, đối với các chỉ tiêu định lượng, lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính, lượng mẫu trích ra để phân tích là 25g. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 3.4.1 Phương pháp đổ đĩa 3.4.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. Nguyên tắc Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ. 3.4.1.3 Môi trường sử dụng - Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water ( SPW) hoặc Buffer Pepton Water (BPW). - Môi trường nuôi cấy : Plate Count Agar (PCA) 3.4.1.4 Quy trình phân tích Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất được độ pha loãng 10-1 Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4. Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã vô trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm 2 đĩa. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm Tính toán kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu 3.4.1.5 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Cấy mẫu Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ 30oC sau 72 giờ hoặc37oC trong 48 giờ (hình 3.2). Chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10] Hình 3.3 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí [10] - Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/ml - Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/ml - Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc Công thức tính kết quả Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính theo cong thức sau Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường fi: Độ pha loãng tương ứng Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau: Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5 Đĩa 1 235 26 16 Đĩa 2 246 21 10 Định lượng tổng số Coliforms 3.5.1 Phương pháp đổ đĩa 3.5.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy 1 lượng nhất định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 10C trong 24 – 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như Neutral red, crystal. Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL. Mật độ Coliforms được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ khẳng định và độ pha loãng trước khi cấy vào đĩa. Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước khi mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc. Quy trình phân tích Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã vô trùng Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu. Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms [8] Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa. Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để nguôị 45oC, lắc đều để đặc môi trường. Giai đoạn này nhằm chọn lọc vi khuẩn Coliforms. Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ ( hình 3.5) Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của Coliforms có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm ( hình 3.4) Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliforms [11] Thử nghiệm khẳng định. Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R ( hình 3.6) Hình 2.6 Khẳng định Coliforms Ghi kết quả Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi. Công thức tính Tổng số Coliforms (cfu/g). Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ. V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: độ pha loãng tương ứng. R = (Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) / (Số khuẩn lạc đã cấy). Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu 3.5.2 Phương pháp MPN 3.5.2.1 Nguyên tắc Số lượng Coliforms trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. Quy trình thưc hiện Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 3 ống chứa 10ml canh LSB Ủ 38oC trong 48 giờ, ghi nhận số ống có hơi Ủ ở 370C ± 10C trong 48 giờ, ghi nhận các ống sinh hơi (+) Cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang các ống chứa canh BGBL 3.5.2.3 Thuyết minh quy trình Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng đồng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C trong 24-48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết qủa (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng ( hình 3.7) Hình 3.7 : Khẳng định Coliform[11] Hình 3.8: Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL[11] Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu ( hình 3.8) Xác định Escherichia coli trong thực phẩm Định tính E.coli trong thực phẩm 3.6.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm trong chế biến, bảo quản, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm. 3.6.1.2 Nguyên tắc Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.coli trong một lượng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá (nghiệm pháp IMViC). Quy trình phân tích Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu. Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-) Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa:Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC Cân 25g mẫu + 225 môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên vào 10ml môi trường BGBL Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy sang EMB. Mẫu không sinh hơi được xem là âm tính với E.coli Thuyết mình quy trình Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu Hình 3.9 : Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB[12] Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh BGBL. Ủ trong 24 giờ ở 44oC Phân lập: Chọn ống nghiệm có phản ứng dương tính làm đục môi trường và có sinh hơi trong ống durham. Cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng E.coli: Khuẩn lạc tròn, dẹp,ánh kim tím, đường kính khoảng 0.5mm ( hình 3.9). Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc. Thử nghiệm khẳng định Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm IMViC. Thực hiện như sau. Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy vi sinh vật qua môi trường canh Trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s. Phản ứng dương (+) tính khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện. Thử nghiệm methyl red: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC . Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng. Thử nghiệm Voges-Proskauer: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 2-5 ngày. thêm vào vài giọt dung dịch KOH 40 % sau đó thêm dung dịch 1-αnapthol 5% tỷ lệ 1:3. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges-Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng âm tính khi không có sự chuyển màu. Thử nghiệm citrate : Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiên Simmon Citrate có màu xanh lục, ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Phản ứng dương (+) tính khi môi trường đổ sang màu xanh dương, âm tính (-) khi môi trường không đổi màu. Kết quả thử nghiệm phát hiện E.coli (bảng 3.1) Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá TT Thử nghiệm sinh hoá Kết quả 1 Indol + 2 Methyl red + 3 Voges Prokauer - 4 Khả năng sử dung citrate - Hình 3.10: Nghiệm pháp IMViC [12] A: Indol (+) , B: Methyl red(+) C: Voges Prokauer (-), D: khả năng sinh citrate (-) Ghi kết quả Phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC có kết quả (+ + - - ) ( hình 3.10) Không phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC không có kết quả (+ + - - ) Phát hiện hay không phát hiện E.coli trong 25g mẫu Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp dếm khuẩn lạc Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 440C trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình đặc trưng của Coliforms. Khẳng định các khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC. Môi trường hóa chất Môi trường canh Trypton Soya Agar (VRB) Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC Broth) Môi trường canh Lactose Trypton Laurl Sulphate Broth (LST Broth) Môi trường canh Trypton Broth. Môi trường canh MR-VR Broth Môi trường thạch Simmon Citrate Thuốc khử Kovac’s. Quy trình phân tích Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đĩa Petri, bổ sung 5ml môi trường TSA, lắc đều, để yên 1-2 giờ Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB, để đông, ủ ở 370C trong 24 - 48 giờ Chọn 3-5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào ống canh EC, ủ ở 440C, 24-48 giờ Cấy vào các môi trường Trypton, Methyl Red, Voges- Prokauer, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC , ủ ở 440C, 24 giờ Chọn ống canh (+) ( sinh hơi) IMViC ++--, tính tỷ lệ khẳng định E.coli Tính toán mật độ E.coli Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5mm Thử nghiệm IMViC Thuyết minh quy trình Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng đồng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa Petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 450C. Lắc tròn đĩa Petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều khoảng 3-5 lần để trộn đều dịch mẫu với môi trường. bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 370C ±10C trong 24-48 giờ. Thực hiện trên 2 mẫu nồng độ pha loãng lien tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10-100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với nồng độ pha loãng. Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường EC, ủ ở 44 ±0,50C trong 24 giờ. Chọn các ống cho kết quả (+) ( sinh hơi) và dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các môi trường sau: canh trypton, canh MR-VR, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường trên ở 44 ±0,50C trong 24 giờ. Thực hiện thử nghiệm Indol, Merthy Red, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận số khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( nghiệm pháp IMViC là ++--). Cách tính kết quả Tính tỷ lệ khẳng định và tính mật độ E.coli ( CFU/ml hay CFU/mg) theo công thức: Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại mỗi độ pha loãng V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng R: Tỷ lệ khẳng định Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp MPN Nguyên tắc Số lượng E.coli trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương