Khóa luận Kỹ thuật trồng nấm bào ngư nhật trên mạt cưa

y ghi nhận loài nào độc cả, trái lại hầu hết các loài Pleurotus là có thể ăn được, hoặc ăn ngon, thực tế quá nữa số loài trên đã được nuôi trồng thành công khá phổ biến ở nước ta. Đáng lưu ý trong số đó, P. abalonus được nuôi trồng xuất khẩu, và nói chung các loài thuộc phân chi Coremiopleurotus có hương vị rất được ưa chuộng, được thị trường khu vực và thế giới coi trọng. Các nấm bào ngư có khả năng chuyển hóa các chất xơ sợi giàu cellulose và giàu lignin. Đây chính là ưu điểm cơ bản của công nghệ nuôi trồng bào ngư, đúng như đánh giá của Uỷ ban Cộng đồng chung Châu Âu tại hội nghị Braunschweig (Cộng hòa liên bang Đức) năm 1986. Chính nhờ các hệ enzyme ngoại bào phong phú, nấm bào ngư còn nhiều khả năng chuyển hóa đặc biệt. Chỉ riêng rơm rạ, trấu, than lõi ngô, thân cành đậu đỗ, bã mía, mùn cưa, lá, cành, cỏ, vỏ cà phê,…. Hàng năm ở nước ta lên đến hàng trăm triệu tấn. Trong đó một phần không nhỏ chỉ là đốt bỏ lấy nhiệt lượng và tro khoáng, gây nên ô nhiễm môi trường và góp phần vào biến đổi khí hậu. Nếu được xử lý phối trộn dinh dưỡng phù hợp, các nguồn phế liệu này sẽ trở thành cơ chất rất thích hợp cho nuôi trồng nấm bào ngư Nhật. Công nghệ nuôi trồng có thể ở nhiều mức độ đầu tư: các hộ, trang trại nhỏ và vừa, cụm dân cư (nông, lâm trường, tổ hợp,…) theo lao động thủ công, bán thủ công, công nghiệp và tự động hóa. Giá thành sản xuất nấm ở nước ta vào loại rất thấp trong khu vực và trên thế giới. Vì vậy, nếu tổ chức nuôi trồng và chế biến tốt, công nghệ nấm nói chung và nấm bào ngư nói riêng có đầy đủ khả năng trở thành ngành sản xuất quan trọng, góp phần xóa đói giảm nghèo, triệt hạ các loại cây sản xuất ra ma túy, công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn, miền núi. Đây có lẽ là một trong những hướng tiếp cận của công nghệ sinh học hiện đại, góp phần thích đáng trong thiên niên kỷ tới – thiên niên kỷ của cơ chế phát triển sạch (CDM: Clean Development Mechanism) Ngoài ra, nấm bào ngư Nhật đã được thử nghiệm có hiệu quả để xử lý một số phế liệu công nghiệp và công nghiệp lên men ở Việt Nam. Cần lưu ý rằng công nghệ lên men ở Việt Nam đã có những đầu tư khổng lồ cho hệ thống lên men lớn nhất thế giới (tổng dung tích các fermentor của công ty Vedan Taiwan, Vũng tàu lên tới 700.000 lít), hàng tuần xả ra một lượng khổng lồ dịch thải đòi hỏi phải có công nghệ giải quyết triệt để (chứ không phải chỉ là những giải pháp tình thế như hiện nay). Các thành tựu tái lên men nấm mở ra một thời kỳ mới nghiên cứu những khả năng đặc biệt của tài nguyên nấm bào ngư Nhật. 2.3 LỢI ÍCH CỦA NGHỀ TRỒNG NẤM BÀO NGƯ NHẬT Tăng nhanh thu nhập cho nông dân, trở thành một ngành kinh tế lớn trong nông thôn. Việt Nam có nhiều đồi núi, ruộng đất, nhưng tài nguyên nấm lại lớn, nên phát triển nghề trồng nấm bào ngư Nhật nói riêng và nghề nấm nói chung trở thành ngành quan trọng điểm ở nông thôn, mở ra con đường thoát nghèo, vươn lên làm giàu cho nông dân. [Nguyễn Hữu Đống, 2005]. Nghề nấm đã thúc đẩy nhiều ngành nghề khác phát triển, nhất là các ngành dịch vụ xoay quanh trước, trong và sau sản xuất nấm, nghiên cứu khoa học và sản xuất gắn thành một sợi chỉ đỏ và đa nguyên hóa, thể chế phục vụ xã hội hóa, từ đó thúc đẩy các ngành thương mại, vận tải, bưu điện, tiền tệ, chế biến thức phẩm, ăn uống cùng phát triển. Và một lượng lớn tiền ngoại tệ từ việc xuất khẩu nấm, tạo công ăn việc làm cho nông thôn. Xúc tiến quá trình tuần hoàn hữu ích trong nông nghiệp. Nguyên liệu làm nấm bào ngư Nhật là các phụ phế phẩm nông nghiệp như mùn cưa, rơm rạ, bã mía, vỏ hạt bông,… được tái sử dụng. Đồng thời bã nấm lại có thể chế biến thành phân hữu cơ rất tốt cho cây trồng. 2.4 TIỀM NĂNG PHÁT TRIỂN NGHỀ TRỒNG NẤM BÀO NGƯ NHẬT CỦA VIỆT NAM Việt Nam là một trong nước có đủ điều kiện để phát triển mạnh nghề trồng nấm, do: Nguồn nguyên liệu để trồng nấm bào ngư Nhật là mùn cưa, rơm rạ, thân gỗ, vỏ cà phê, bã mía,… Các loại phế liệu sau thu hoạch rất giàu chất xenlulo. Nhất là nguồn mạt cưa rất dồi dào và có liên tục. Hàng năm số lượng phát thải mạt cưa, rơm rạ, bã mía,….Trong cả nước đạt con số vài chục triệu tấn/năm, chỉ cần sử dụng 10% số nguyên liệu kể trên để trồng nấm thì sản lượng nấm đã đạt vài trăm ngàn tấn/năm. Các phế liệu, phế phẩm nông lâm nghiệp trên dùng làm nguyên liệu trồng nấm tạo nên sản phẩm có giá trị, vừa giải quyết về mặt môi trường. Phế phẩm sau khi trồng nấm bào ngư Nhật còn có thể sử dụng trồng nấm rơm, làm phân bón, nuôi trùn đất phục vụ cho chăn nuôi và trồng trọt. [Nguyễn Hữu Đống, 2005]. Lực lượng lao động dồi dào còn nhàn dỗi và giá công lao động rẻ. Tính trung bình 1 lao lao động nông nghiệp mới chỉ dùng đến 30-40% quỹ thời gian. Chưa kể đến việc mọi lao động phụ đều có thể tham gia trồng nấm được. Trồng nấm thu hút một lượng lớn lao động bao gồm: gia công chế biến meo giống, chất mô, xếp mô, chăm sóc, thu mua và chế biến sản phẩm nấm… Tạo công ăn việc làm cho nhiều người, đồng thời mang lại thu nhập đáng kể. Điều kiện tự nhiên (về nhiệt độ, độ ẩm….) rất thích hợp cho nấm bào ngư Nhật phát triển, cũng như các loài nấm khác. Chênh lệch nhiệt độ tháng nóng và lạnh không lớn lắm nên có thể sản xuất nấm quanh năm. Không khí chứa nhiều hơi nước rất thích hợp cho nấm. Độ ẩm trung bình cũng không dưới 800C. Vốn đầu tư ban đầu để trồng nấm bào ngư rất ít so với việc đầu tư cho các ngành sản xuất khác. Ngành chế biến và xuất khẩu nấm đang ở bước đầu với lợi nhuận tương đối, ngoài sản phẩm đạt tiêu chuẩn xuất khẩu sẽ thừa lại một tỉ lệ đáng kể nấm tươi cho bữa ăn hằng ngày của mọi gia đình. Kỹ thuật trồng nấm bào ngư Nhật không phức tạp. Một người dân bình thường có thể tiếp thu được công nghệ trồng nấm trong thời gian ngắn. Bên cạnh đó một đội ngũ kỹ thuật được rèn luyện trong thực tế ngày càng nhiều, sẽ là hạt nhân đẩy phong trào trồng nấm lan rộng. Thị trường tiêu thụ nấm bào ngư Nhật trong nước và trên thế giới tăng nhanh do sự phát triển chung của xã hội và dân số. Hiệp hội nấm ăn thế giới đã đưa ra chỉ số bình quân lượng tiêu thụ nấm ăn cho một người trong năm để đánh giá sự phát triển kinh tế xã hội của một quốc gia. Chính vì vậy nghề trồng nấm phát triển là một điều tất yếu. Nó không chỉ giải quyết vấn đề lao động mà còn đem lại của cải cho xã hội. Tuy nhiên để nghề trồng nấm bào ngư phát triển nhanh chóng ở nước ta, bên cạnh sự vận động theo nhu cầu xã hội, cần có nhiều đầu tư về mặt khoa học như giống nấm, kỹ thuật trồng, vấn đề phòng bệnh, bảo quản và chế biến sản phẩm,… cung cấp thông tin cũng như huấn luyện kỹ thuật trồng nấm và nhất là có chính sách ưu đãi cho những người trồng nấm, như cho vay vốn sản xuất, miễn thuế, … 2.5 THỰC TRẠNG NGÀNH SẢN XUẤT NẤM BÀO NGƯ NHẬT HIỆN NAY CỦA VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI 2.5.1 Tình hình trong nước Việc tổ chức sản xuất nấm bào ngư Nhật của các đơn vị chuyên kinh doanh về nấm còn nhiều thiếu sót. Chất lượng giống nấm chưa đảm bảo từ khâu sản xuất đến quá trình nuôi trồng, bảo quản, cách sử dụng. Các loại nấm đã và đang được trồng ở Việt Nam từ nhiều nguồn giống khác nhau. Một số được nhập từ một số nước và vùng lãnh thổ: Hà Lan, Đài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản,…. Một số khác được sưu tầm trong nước, song việc chọn lọc, kiểm tra để đánh giá tiềm năng về năng suất, chất lượng của từng loại, từ đó để nhân giống đại trà phục vụ sản xuất hầu như chưa có đơn vị nào đảm trách. Khâu hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng, chế biến nấm đạt chất lượng xuất khẩu đến từng hộ gia đình không đầy đủ, do thiếu cán bộ và trình độ kỹ thuật viên non kém. Đội ngũ cán bộ nghiên cứu và làm công tác kỹ thuật về nấm ăn được đào tạo cơ bản tại các trường đại học, có kinh nghiệm lâu năm và chuyên tâm với nghề nghiệp còn quá ít. Hợp đồng xuất khẩu nấm thường không đủ về số lượng, chất lượng còn thấp dẫn đến mất lòng tin với khách hàng nước ngoài. Các thiết bị, công nghệ trồng nấm nhập khẩu của nước ngoài không phù hợp với Việt Nam về điều kiện tự nhiên, kinh tế, xã hội: giá thành 1kg nấm sản xuất theo công nghệ Đài Loan và Italia cao hơn nhiều so với giá thành 1kg nấm sản xuất theo công nghệ Việt Nam. Thiết bị trồng nấm chủ yếu là máy băm rơm rạ, hệ thống quạt gió, hệ thống tưới nước, máy đảo ủ nguyên liệu không đồng bộ. Công nghệ nuôi trồng và hệ thống thiết bị không phù hợp với điều kiện cụ thể của Việt Nam. Công tác nghiên cứu về công nghệ chọn, tạo giống, công nghệ nuôi trồng nấm bào ngư Nhật đạt năng suất cao, giá thành hạ, công nghệ bảo quản, chế biến nấm đạt chất lượng ở các trung tâm nghiên cứu và cơ sở sản xuất chưa được chú trọng đúng mức. Công nghệ sản xuất giống, nuôi trồng và chế biến nấm chủ yếu được du nhập từ Nhật Bản, vùng lãnh thổ Đài Loan và các nước châu Âu. Trong quá trình nghiên cứu và triển khai sản xuất đã có sự thay đổi để phù hợp với điều kiện tự nhiên, xã hội của Việt Nam song năng suất thu hoạch còn rất thấp (mới đạt 50 – 70% so với thế giới). Việc tuyên truyền, phổ biến, hướng dẫn về giá trị dinh dưỡng và cách ăn nấm trên các phương tiện thông tin đại chúng còn quá ít. Để thị trường tiêu thụ nội địa được tốt, mọi người đều biết ăn nấm, xem nấm như là một loại thực phẩm quý thì công tác tuyên truyền là rất cần thiết. 2.5.2 Tình hình sản xuất nấm trên thế giới Các nước trên thế giới hiện nay tập trung nghiên cứu và sản xuất nấm mỡ, nấm hương, nấm sò, nấm rơm là chủ yếu. Khu vực Bắc Mỹ và châu Âu trồng nấm theo phương pháp công nghiệp. Những “nhà máy” sản xuất nấm có công suất từ 200 – 1000 tấn/năm được cơ giới hóa cao. Từ khâu xử lý nguyên liệu đến khâu thu hái chế biến đều do máy móc thực hiện. Khu vực châu Á (Nhật Bản, vùng lãnh thổ Đài Loan, Hàn Quốc, Trung Quốc,…) triển khai sản xuất theo mô hình trang trại vừa và nhỏ, đặc biệt là ở Trung Quốc nghề trồng nấm đã thực sự đi vào từng hộ nông dân. Sản lượng nấm mỡ, nấm hương của Trung Quốc lớn nhất thế giới. Sản lượng của Trung Quốc là 3.000.000 tấn, chiếm 60% tổng sản lượng thế giới. 2.6 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ NẤM BÀO NGƯ NHẬT HIỆN NAY TRÊN ĐỊA BÀN TP.HCM Thị trường tiêu thụ nấm lớn nhất trên thế giới hiện nay là Mỹ, Nhật Bản, vùng lãnh thổ Đài Loan, các nước châu Âu,…Hàng năm các nước này phải nhập khẩu từ Trung Quốc (nấm muối và nấm đóng hộp). Tại các nước này, do khó khăn về nguồn nguyên liệu và giá công lao động rất đắt nên những người nuôi trồng và kinh doanh mặt hàng này đang chuyển dịch sang các nước chậm phát triển để mua nguyên liệu (nấm muối) và đầu tư sản xuất, chế biến tại chổ. Nhiều hãng sản xuất của Mỹ, Nhật, Italia, Đức, vùng lãnh thổ Đài Loan đã đến Việt Nam để tìm hiểu về tình hình sản xuất nấm, đặt vấn đề mua hàng và hợp tác đầu tư vào ngành này. Hiện nay thị trường tiêu thụ nấm bào ngư Nhật trong nước đang tăng rất mạnh. Các tỉnh miền Trung và Nam Bộ tiêu thụ trung bình 50 tấn nấm/năm. Thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội có những lúc cao điểm đã tiêu thụ trên 30 tấn nấm/năm. Hình 1.8: Các sản phẩm từ nấm bào ngư. 2.7 GIỚI THIỆU VỀ NGUỒN CƠ CHẤT LÀ MẠT CƯA 2.7.1 Mạt cưa là phế liệu nông nghiệp và những vấn đề phát sinh về môi trường Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm, ít bị biến động lớn về thời tiết và khí hậu, nên có nhiều điều kiện cho nông nghiệp phát triển. Và điều này cũng đã được chứng minh bằng thực tế, với những thành tựu vượt bậc của ngành nông nghiệp nước ta trong những năm gần đây. Sự phát triển của nông nghiệp đặt ra nhiều vấn đề, đặc biệt là các phế phẩm, phế liệu. Nguồn chất thải sau thu hoạch thường bao giờ cũng khá lớn, nó chiếm từ 60- 80% so với sản phẩm thu được, nhất là ở cây trồng. Mà nhất là cây cao su lấy nhựa và thân cây làm gỗ, đồ mỹ nghệ lượng mạt cưa thải ra là rất lớn. Nguồn phế liệu này có thành phần chủ yếu là chất xơ (cellulose), là thức ăn chính cho nấm. Do đó, việc đốt bỏ hoặc tệ hại hơn là thải bỏ dưới dạng rác đều là lãng phí. Một số trường hợp lên men hiếu khí hoặc kỵ khí để tạo ra sản phẩm cuối là chất mùn bón lại cho đất, nhưng quá trình này thường cần thời gian dài và làm mất đi một lượng lớn năng lượng dưới dạng nhiệt năng. Nghiêm trọng hơn là các khí thải, nước thải, mầm bệnh… còn làm ô nhiễm môi trường xung quanh. Từ những hạn chế trên, thì việc tận dụng các phế liệu này làm cơ chất trồng nấm, nuôi trùn quế và phân bón, là nhằm hợp lý hoá trong việc sử dụng tối đa năng lượng mặt trời tích lũy ở các xác bã thực vật. Vừa đảm bảo được chu trình tuần hoàn tự nhiên của vật chất, vừa tạo ra nhiều sản phẩm trung gian giá trị cao (như: sinh khối nấm, sinh khối trùn và phân bón hữu cơ cao cấp). Và giải pháp này còn được gọi là giải pháp nông sinh học nhằm biến đổi phế liệu nông lâm nghiệp thành sản phẩm chất lượng cao. Như vậy, trong sản xuất nông nghiệp, việc tận thu một cách tối đa các kết quả của trồng trọt, tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau là vấn đề thời sự và cũng là xu hướng chung của thế giới. Vì thế, việc kết hợp trồng nấm với nuôi trùn và làm phân bón để tận dụng các phế liệu nông nghiệp, là một trong những giải pháp không thể thiếu được. 2.7.2 Thành phần về mạt cưa: 2.7.2.1 Cellulose Thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật và chiếm 50% tổng lượng hydrocacbon trên trái đất. Ngoài thực vật là nguồn chủ yếu còn ở trong giới động vật, nhưng số lượng rất ít. Cellulose là polysaccarit liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucozit, mức độ polymer hóa của cellulose rất cao tới 10.000 – 14.000 đơn vị glucoza/phân tử. Số lượng lớn liên kết hydro nội và ngoại phân tử làm cho phân tử cellulose có độ cứng và vững chắc. Hình 1.9: cấu trúc phân tử cellulose Liên kết glucozit không bền với acid. Cellulose dễ bị phân hủy bởi acid và tạo thành sản phẩm phân hủy không hoàn toàn là hydro-cellulose có độ bền cơ học kém hơn cellulose nguyên thủy, còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo thành là D-glucoza. Về bản chất hóa học cellulose là một rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo thành cellulose-ancolat. Nguyên tử hydro ở các nhóm –OH bậc một và hai trong phân tử cellulose cũng có thể bị thay thế bởi các gốc –metyl, -etyl,... tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác nhau. Cellulose cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy – cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4), và muối của nó. Cellulose không tan trong nước, dung dịch kiềm làm trương phồng mạch cellulose và hòa tan một phần cellulose phân tử nhỏ. Đặc biệt cellulose dễ hòa tan trong dung dịch cupri amin hydrat [Cu(NH3)4(OH)2], và hàng loạt các dung dịch là các phức chất của đồng, niken, cadmi, kẽm,...[J.F.Kennedy, 1989]. 2.7.2.2 Lignin Lignin là một polymer gốc rượu, có cấu trúc 3 chiều rất phức tạp và có nhiệm vụ nâng đỡ cấu trúc tế bào gỗ. Sau cellulose, lignin là một polymer phong phú trong tự nhiên được thực vật tổng hợp và là phần lớn nguồn chất thơm đa dạng trên trái đất. Sự có mặt của lignin giúp cho tế bào thực vật cứng rắn hơn và đồng thời giúp cho thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Lignin được tìm thấy trong vách tế bào ở dạng phức hợp với những polysaccharide như cellulose và hemicelluloses, nó cũng giúp bảo vệ những polysaccharide này khỏi sự phân hủy sinh học. Lignin được sinh tổng hợp bởi sự polymer hóa các tiền chất phenylpropanoid. Có 3 loại tiền chất được phân loại tùy thuộc theo số lượng nhóm methoxyl trên vòng thơm. Lignin gỗ mềm chức hầu hết những đơn vị guaiacyl (1 nhóm methoxy), lignin gỗ cứng chứa số lượng cân bằng guaiacyl và suringyl (2 nhóm methoxy), các lignin khác chứa cả p-hidroxyphenyl (không có nhóm methoxy), và cả 2 loại kia [Nguyễn Thị Thanh Kiều,2004;J.F.Kennedy, 1989]. Hình 1.10: cấu trúc phân tử lignin 2.7.2.3 Hemicellulose Cũng là một phần polysacchrit thường gặp trong vách tế bào thực vật với hàm lượng lớn sau cellulose. Tuy nhiên cellulose, hemicelluloses được không chỉ một đường mà nhiều đường khác nhau, thậm chí cả từ acid urnoic của chúng. Người ta gọi tên cụ thể 1 loại hemicelluloses là dựa theo tên loại đường chủ yếu tạo nên nó. Ví dụ: xylan là một hemicelluloses mà thành phần chủ yếu của nó là xyloza, manan – manoza,...Trong gỗ cây lá kim, chủ yếu lá henicellulose được tạo nên từ loại đường 6 cacbon: galactam, manan... Khác với cellulose, phân tử hemicelluloses nhỏ hơn nhiều. Thông thường không quá 150 gốc đường, được nối với nhau không chỉ bằng liên kết -1,4 mà còn bằng liên kết -1,3 và -1,6 glucozit tạo ra mạch ngắn và phân nhánh. Vì độ polymer thấp, phân nhánh và hổn hợp nhiều đường nên hemicelluloses không có cấu trúc chặt chẽ như ở cellulose và độ bền hóa lí cũng thấp hơn. Hemicellulose dể tan trong dung dịch kiềm, trong nước nóng và dể bị phân hủy bởi acid lỏng. Xylan là một hemicelluloses phổ biến nhất trong tự nhiên chiếm 30% khối lượng rơm, 20 - 25% cây gổ lá rộng, 7 – 17% cây gỗ lá kim [Nguyễn Thị Thanh Kiều,2004;J.F.Kennedy, 1989]. 2.7.2.4. Thành phần khác: Mỗi thành phần cấu tạo nên lignin – cellulose riêng, do bản chất các liên kết hóa học, do mức độ polymer hóa và tính không tan trong nước là đối tượng khó phân hủy. Tính khó phân hủy là gia tăng lên nhiều lần khi chúng liên kết với nhau và tới các thành phần khác nữa thành một thể cấu trúc chặt chẽ và phức tạp. Các mặt phân tử cellulose không bao giờ tồn tại riêng lẻ mà nhờ liên kết hydro giữa phân tử tạo thành các cấu trúc lớn hơn gọi là vi sợi, dọc theo sợ có những vùng tại đó các phân tử xếp song song và chặt khít gọi là vùng kết tinh, xen kẻ những vùng mà có sự sắp xếp kém trật tự và chặt chẽ là vùng vô định hình. Các vi sợi liên kết với nhau bằng cách đan xen ở những vùng vô định hình này. Các vi sợi cellulose, lignin, đang xen theo những quy tắc những quy tắc nhất định để định thành nên cấu trúc. Với cấu trúc nhiều lớp gồm nhiều thành phần có bản chất hóa học khác nhau như vậy, lignin – cellulose có độ bền vật lí cao rất khó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa để phân hủy bất cứ thành phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến thành phần khác [ Nguyễn Thị Thanh Kiều, 2004; J.F. Kennedy,1989]. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.1.1 Dụng cụ và trang thiết bị Tủ cấy đơn giản hoặc hiện đại (hình 2.1) Lò hấp khử trùng (hình 2.2; 2.3; 2.4) Ống nghiệm, pipet các loại Bông không thắm Chai thủy tinh Đĩa petri Bình tam giác Cân điện tử Nồi hấp Lò hấp, tủ sấy Kính hiển vi Đèn cồn Hình các loại que cấy, nhíp, thìa, dao dung để phân lập và cấy nấm Hình 2.1: Cấu tạo tủ cấy đơn giản đến hiện đại Hình 2.2: Tủ cấy đơn giản Hình 2.3: Tủ cấy hiện đại Hình 2.4: Cấu tạo lò hấp khử trùng Hình 2.5: Lò hấp meo giống Hình 2.6: Lò hấp bịch phôi Hình 2.7: Nồi hấp khử trùng Hình 2.8: Các loại que cấy, nhíp, thìa, dao dùng để phân lập và cấy nấm. 3.1.2. Nguyên vật liệu và hóa chất Môi trường PGA cải tiến (môi trường phân lập và nhân giống cấp 1): nước chiết, glucose, cao nấm men, agar. Nước chiết gồm có: giá đỗ, khoai tây, chuối,….. Môi trường hạt lúa (môi trường nhân giống cấp 2): thóc, cám gạo, CaCO3. Môi trường nuôi trồng ra quả thể: mạt cưa, cám gạo, vôi bột, vi lượng (KH2PO4, MgSO4,…) 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm của tơ nấm và hình thái của nấm bào ngư Nhật trên môi trường thạch (giống cấp 1) Môi trường thạch là môi trường dùng để nhân giống cấp 1 trong sản xuất và cũng là môi trường dùng để giữ giống, ở đây là môi trường PGA cải tiến. Công thức môi trường PGA cải tiến: Nước chiết 1 lít. Glucose 20g. Cao nấm men 1g, agar 20g. Nước chiết gồm có: 75g giá đỗ, 300g khoai tây, 100g chuối. Môi trường PGA cải tiến được thực hiện như sau: Khoai tây, chuối, giá đỗ được gọt vỏ rửa rồi cắt lát, cho vào nồi đun chung với giá đỗ, nước, đun sôi khoảng 20 phút, lọc lấy nước chiết và bổ sung nước cất cho đủ 1 lít. Sau đó bổ sung agar và cao nấm men, đun cho chất này hòa tan đều vào nhau sau đó đợi nguội đến khoảng 700C (áp vào má có thể chịu được) đem rót vào trong các ống nghiệm, đĩa petri và bình tam giác, dùng để phân lập, cấy truyền giống nấm và khảo sát tốc độ lan tơ của nấm. Với ống nghiệm rót 1/3 chiều dài ống nghiệm, còn với bình tam giác và đĩa petri thì đổ dày khoảng 1cm. Không đổ môi trường vào các dụng cụ trên khi đang quá nóng vì hơi nước sẽ đọng lại trên thành, nắp sau đó rơi xuống làm ướt bề mặt thạch. Cũng không đỗ môi trường khi đã nguội vì đang đổ có thể môi trường đã bị đông vón lại. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 1210C, 1atm trong 25 phút hấp xong để nguội. Việc khảo sát tốc độ lan tơ nấm và mô tả hình thái đối tượng nghiên cứu trên môi trường thạch được tiến hành như sau: Dùng dao vô trùng chọn cắt một đoạn còn non, rửa sạch bằng HgCl2 0,1%. Tiếp tục rửa lại bằng nước cất nhiều lần. Thấm khô bằng giấy đã khử trùng. Dùng dao lam đã khử trùng gọt một lát mỏng ( lưỡi dao chỉ gọt một đường không quay lại để tránh nhiễm trùng). Dùng tiếp các lưỡi dao gọt cho đến khi được một miếng mô nấm đã sạch lớp bẩn phía ngoài. Cắt một lớp mỏng khoảng 100µm, dùng panh cấy đưa vào ống nghiệm dựng thạch nghiêng. Đặt miếng mô thật êm trên mặt thạch nghiêng. Toàn bộ công việc trên được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để ống nghiệm đã cấy nấm trong điều kiện nhiệt độ 250C. Theo dõi sự phát triển của mẫu cấy trong ba ngày đầu. Nếu mẫu cấy bị nhiễm bệnh thì xung quanh mẫu sẽ thấy có khuẩn lạc nấm mốc lạ và khuẩn ty sẽ phát triển rất chậm. Còn mẫu cấy đạt chất lượng sẽ có khuẩn ty màu trắng phát triển nhanh và không có biểu hiện nhiễm bệnh. Sau ba ngày, các mẫu cấy đạt sẽ được cấy truyền sang ống mới. Sau ba lần cấy truyền, thu được giống nấm thuần khiết làm giống cấy 1. Các ống giống cấp một sẽ được ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 26 – 300C, quá trình ủ tiến hành trong môi trường ánh sáng khuếch tán nhẹ 500 -1000 lux. Tiến hành quan sát và ghi nhận kết quả kể từ khi sợi nấm bắt đầu bám vào bề mặt môi trường. Xử lý số liệu vẽ biểu đồ mô tả Nhận xét kết quả Hình 2.9: Phân lập giống từ tổ chức mô của nấm bào ngư 3.2.2 Khảo sát tốc độ lan và đặc điểm tơ nấm của nấm bào ngư Nhật trên môi trường hạt (giống cấp 2) Môi trường hạt lúa có bổ sung cám gạo cũng là môi trường được chọn để nhân giống cấp hai đối với nấm bào ngư Nhật. Công thức môi trường hạt: Thóc hạt : 89% Cám gạo : 10% CaCO3 : 1% Nước đủ ẩm : 60 – 65% Quá trình chuẩn bị môi trường hạt được tiến hành như sau: lúa ngâm trong nước lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch sau đó cho vào nồi nấu đến khi hạt thóc nở bung ra thì ngừng lại. Tiếp theo cho hạt thóc đã nở bung vào chai thủy tinh rồi bổ sung thêm 10% cám gạo, 1% CaCO3. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 1210C (2500F) trong 90 phút hấp xong để nguội. Để khảo sát tốc độ lan tơ chúng tôi tiến hành như sau: Cấy các giống cấp một (trong môi trường thạch) vào trong chai có môi trường hạt. Tiến hành theo dõi sự phát triển của mẫu trong ba ngày đầu. Loại bỏ các cấy xuất hiện khuẩn lạc của nấm mốc. Thu nhận các mẫu cấy có tơ nấm màu trắng phát triển bình thường để làm giống cấy hai. Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng. Thu nhận kết quả kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào môi trường đến khi ăn trắng toàn bộ chai, đo ngẫu nhiên với thời gian từ 2 ngày trở lên. Nhận xét đặc điểm phát triển. Xử lý số liện vẽ biểu đồ mô tả. Hình 2.10: Nhân giống cấp hai 3.2.3 Khảo sát tốc độ lan và đặc diểm tơ nấm của nấm bào ngư Nhật trên môi trường cọng mì (giống cấp ba) Môi trường cọng mì bổ sung cám gạo là môi trường nhân giống cấp ba đối với nấm bào ngư Nhật. Công thức môi trường cọng mì: Cọng mì: 89% Cám gạo : 10% CaCO3 :1% Nước đủ ẩm : 60 – 65% Quá trình chuẩn bị môi trường cọng mì được tiến hành như sau: cọng mì được ngâm trong nước lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch sau đó cho vào nồi nấu đến khi cọng mì chin thì ngưng lại. Cho cọng mì vào chai thủy tinh rồi bỏ sung thêm 10% cám gạo, 1% CaCO3. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 90 phút hấp xong để nguội. Để khảo sát tốc độ lan tơ chúng tôi tiến hành như sau: Cấy các giống cấp hai (trong môi trường hạt) vào chai thủy tinh có môi trường cọng mì. Quan sát sự phát triển của mẫu cấy trong ba ngày đầu. Loại bỏ các mẫu cấy nhiễm bệnh. Thu nhận các mẫu cấy có khuẩn ty màu trắng, phát triển bình thường làm giống cấp ba. Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng. Thu nhận kết quả kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào môi trường đến khi ăn trắng toàn bộ chai, đo ngẫu nhiên với thời gian từ 2 ngày trở lên. Nhận xét đặc điểm phát triển. Xử lý số liện vẽ biểu đồ mô tả. Hình 2.11: Cấy giống từ chai giống cấp hai sang chai giống cấp ba 3.2.4 Qúa trình nuôi trồng khảo nghiệm Sau khi đã nhân giống cấp một, cấp hai, cấp ba thành công đối tượng trên với số lượng khá nhiều. Tiếp theo sẽ cấp giống cấp ba vào môi trường cơ chất mạt cưa để tiến hành nuôi trồng khảo nghiệm. Qúa trình nuôi trồng được tiến hành ở trang trại nấm Trại nấm anh Lê Minh Khoa ở địa chỉ 132A, đường Sông Lưu, ấp 5, xã hòa phú, huyện CỦ CHI. Công thức giá thể tổng hợp: Mạt cưa được loại tạp bẩn Vôi bột 1% Phân DAP 0,3%, Cám gạo 10%, KH2SO4 O.1%, MgSO4 0,1% Nước bổ sung cho đến khi cơ chất đạt độ ẩm 40 – 50% Quá trình chuẩn bị giá thể như sau: Dùng mạt cưa sau khi đốn cây khoảng 10 – 15 ngày là tốt nhất, đảo trộn mạt cưa với các chất dinh dưỡng để cơ chất mềm ra, nấm dể sử dụng. Mạt cưa sẽ được sàn để loại vỏ văm, mảnh vụn. Bổ sung dinh dưỡng với tỷ lệ như trên, tiến