Khóa luận Lên men lactic sản phẩm salad cà chua

ờng đơn giản và tạo nên acid lactic, đây là quá trình lên men lactic đồng hình. Trong trường hợp này acid pyruvic được tạo thành theo sơ đồ Embden-Meyerhorf-Parnas(EMP). Sau đó acid pyruvic sẽ tạo thành acid lactic enzyme lactatdehydrogenase. Lượng acid tạo thành chiếm hơn 90%. Lên men lactic dị hình: Xảy ra trong trường hợp vi khuẩn lactic không có các enzyme cơ bản của sơ đồ Emblen-Mayerhorf-parnas (aldolase và triozophotphattizomerrase) tạo ra quá trình lên men phức tạp. Ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như: acid acetic, rượu etylic. Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm. Số lượng các sản phẩm phụ này hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Nói chung acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã phân huỷ, acid succinic gần 20% và các khí vào khoảng 20%. Đôi khi lượng khí ít hơn và thay vào đó là lượng acid formic. Lên men lactic thì cần có sự lên men đồng thời của vi khuẩn lactic đồng hình và dị hình. Vì quá trình lên men dị hình ngoài việc tạo thành acid lactic còn tạo các sản phẩm phụ như rượu sinh ra ester có mùi thơm làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng. Acid lactic tích tụ lại có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật có hại, nhất là vi sinh vật gây thối rữa. Do đó rau quả muối chua có thể giữ được một vài tuần đến một tháng. Mặt khác, acid lactic tạo môi trường acid cho sản phẩm, nên lượng vitamin C ít bị hao hụt hơn so với các dạng sản phẩm khác của rau quả. Các vi khuẩn lactic trong khi thực hiện sự lên men lactic còn có khả năng tổng hợp vitamin B1, do đó làm tăng thêm giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm rau quả muối chua. 3.1.2 Các giai đoạn trong quá trình lên men lactic Quá trình lên men lactic trong sản phẩm rau quả muối chua có thể chia thành ba giai đoạn: Giai đoạn đầu: Sự khuếch tán của chất dinh dưỡng vào nước, vi khuẩn lactic bắt đầu phát triển. Do muối ăn tạo nên áp suất thẩm thấu lớn nên đường và các chất dinh dưỡng khuyếch tán vào muối và bắt đầu có sự hoạt động của vi khuẩn lactic và một số vi khuẩn khác. Trên bề mặt nước muối xuất hiện bọt khí, do hoạt động của các vi sinh vật có khả năng sinh khí. Cần kết thúc quá trình này càng nhanh càng tốt, vì nếu không quá trình lên men sẽ là lên men tạp. Trong giai đoạn này, lượng acid lactic sản sinh ra với lượng rất nhỏ (<1%). Giai đọan hai: Bắt đầu hình thành hương vị đặc trưng. Các vi khuẩn lactic phát triển rất mạnh mẽ và acid sinh ra tích tụ nhiều. Phần lớn vi khuẩn gây thối bị ức chế vì độ pH của môi trường giảm xuống còn 3 - 3,5. Giai đoạn này là giai đoạn rất quan trọng của quá trình lên men lactic vì sản phẩm tích tụ được lượng acid cao và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Giai đoạn ba: Vi khuẩn lactic bị ức chế khi acid lactic bị tích tụ với lượng khá cao thì các vi khuẩn cũng bị ức chế. Khi ấy nấm men và nấm mốc có thể phát triển mạnh và làm giảm chất lượng của sản phẩm. Vì thế, trong giai đoạn này cần ngăn ngừa các hiện tượng trên bằng cách bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp (khoảng 2 - 4 oC) hoặc bảo quản trong điều kiện yếm khí hay bảo quản bằng các hóa chất diệt khuẩn như sorbic, natri benzoate...Sự lên men lactic phải trải qua nhiều giai đoạn tạo thành các sản phẩm trung gian, trong điều kiện yếm khí acid pyruvic chuyển thành acid lactic. 3.1.3 Vi sinh vật trong lên men lactic Tùy theo cách lên men và chủng vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men mà tạo ra những mùi vị khác nhau. Quá trình muối chua tạo nên sự lên men lactic, có sự lên men rượu tạo ra mùi thơm, vị chua. Quá trình lên men giải phóng CO2 tạo nên các loại nước giải khát có ga hoặc dưới tác dụng của vi sinh vật phân hủy glucid tạo ra đường đơn làm thực phẩm trở lên ngọt, phân hủy chất đạm tạo ra mùi đặc trưng của sản phẩm. Sản phẩm muối chua rau quả là một trong những quá trình mà vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn giữ vai trò hỗ trợ rất quan trọng. 3.1.4 Vi khuẩn Vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình Chúng lên men đường cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (khoảng 90 -98%). Giống Streptococcus: là loại giống không nha bào dạng liên cầu khuẩn. Đại diện đồng hình của chúng là Streptococcus lactic, có khả năng lên men nhiều loại đường như: glucose, lactose, maltose và hình thành được khoảng 5% acid lactic, nhiệt độ thích hợp cho việc phát triển của nó là 30 oC. Hình 3.1: Streptococcus Giống Lactobacillus: là giống được sử dụng rộng rãi. Chúng có dạng hình que thẳng hay hơi cong. Hình 3.2: Lactobacillus Nhóm vi khuẩn lên men dị hình: Giống Leuconostoc: có dạng hình cầu, nhưng trong môi trường acid tế bào dài ra và nhọn hai đầu. Trong đó loài Leuconostoc mesenteroides cùng một số vi khuẩn đồng hình khác như Lactobacillus plantarum tham gia vào việc chế biến rau muối chua. Hình 3.3 Leuconostoc Lactobacillus pentoacetum: là loài trực khuẩn không sinh bào tử. Có dạng hình que, không hình thành bào tử, nhiệt độ thích hợp phát triển là 35 - 38 oC. Sản phẩm của sự lên men của vi khuẩn này là acid lactic, rượu etylic, acid acetic, CO2, H2 và indol. Vi khuẩn butyric: là loại vi khuẩn yếm khí, nó xâm nhập vào sản phẩm chế biến đường, acid lactic thành các acid bay hơi, acid butyric, H2, CO2. Acid butyric làm cho sản phẩm có mùi ôi thối khó chịu. Vi khuẩn này tạo bào tử có khả năng chịu nhiệt cao. Vi khuẩn gây thối: đa số thuộc nhóm vi khuẩn sinh bào tử. Các vi khuẩn gây thối hoạt động sinh ra H2S, indol, NH3 làm rau dưa bị thối. Các vi khuẩn này đều có khả năng sinh bào tử, chịu nhiệt cao, có hại cho sản phẩm trong quá trình bảo quản. 3.1.5 Nấm men Có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản bằng cách nảy chồi. Nấm men phân bố rộng rãi trong khắp tự nhiên. Giống thường gặp là Saccharomyces, có tế bào hình cầu, elip, hình ống. Giống được sử dụng rộng rãi là Saccharomyces cerevisiae có ý nghĩa quan trọng trong lên men rượu và lên men lactic. Hình 3.4: Saccharomyces cerevisiae Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men. Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông. Nguồn dinh dưỡng cacbon của loại này là đường, cồn và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotinic, biotin, mezoinozit, thiamin và piridoxin. 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men của rau muối chua 3.2.1 Muối Muối là chất cần thiết cho cơ thể, Kali và Natri giúp cân bằng lượng nước trong cơ thể, nếu không có đủ lượng muối trong cơ thể, bạn sẽ gặp khó khăn trong quá trình trao đổi chất. Muối cũng được dùng như gia vị làm tăng mùi vị cho các thức ăn lạt. Thức ăn không có muối sẽ có vị nhạt. Muối làm hạn chế sự hoạt động của các vi khuẩn gây thối, tăng cường hoạt động của vi khuẩn lactic làm cho nước cùng với đường trong tế bào rau thoát ra ngoài đi vào môi trường cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic phát triển. Sử dụng dung dịch muối có hàm lượng cao sẽ làm ngưng sự phát triển của các loại vi sinh vật kể cả vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic có khả năng chịu được tác dụng của muối cao hơn các vi sinh vật khác. Khi lên men rau củ phải tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn lactic và ức chế hoạt động của các vi sinh vật không có lợi cho quá trình muối chua. Nồng độ muối thích hợp khoảng 3 - 5%. Hình 3.5: Muối 3.2.2 Đường Đường là nguồn năng lượng của cơ thể, là nguyên liệu không thể thiếu của các tổ chức tế bào, là nguồn cung cấp năng lượng duy nhất của hệ thần kinh. Trong quá trình lên men đường thúc đẩy quá trình lên men và làm cho sản phẩm lên men có vị ngọt. Khi sử dụng các loại rau củ có lượng đường thấp thì acid sinh ra thấp. Vì thế sản phẩm sau khi lên men sẽ có chất lượng không tốt. Nếu chế biến từ những nguyên liệu có lượng đường thấp thì phải bổ sung thêm những nguyên liệu phụ có chứa nhiều đường như củ hành, cà rốt... Để đảm bảo cho quá trình lên men tốt nên chọn nguyên liệu có hàm lượng đường lớn hơn 2%. 3.2.3 Nhiệt độ Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng lớn đến thời gian lên men và lượng acid tạo thành. Mỗi loại vi sinh vật có một khoảng nhiệt độ thích hợp để hoạt động, ở nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá nó sẽ bị ức chế. Nhiệt độ khoảng 0 – 10 oC sẽ ức chế hoạt động của Bacterium coli, vi khuẩn butyric và một số nấm mốc. Ở nhiệt độ này sự lên men lactic không bị đình chỉ nhưng tiến hành rất chậm. Nhiệt độ 10 - 20 oC, sự lên men lactic xảy ra rất chậm, nhiệt độ này cũng ức chế được sự hoạt động của các vi sinh vật lạ nhưng một số nấm mốc có thể phát triển được. Nhiệt độ 20 - 30 oC, tốc độ lên men tuy chậm nhưng dưa có hương vị thơm ngon và để được lâu hơn. Nhiệt độ 30 – 37 oC, tuy tốc độ lên men nhanh, nhưng ở nhiệt độ này những vi khuẩn có hại cũng phát triển song song nên dưa mau hư. Ở nhiệt độ lớn hơn 400C các vi khuẩn gây chua sẽ bị ức chế. Nhiệt độ để muối dưa thích hợp là 20 - 30 oC cũng là nhiệt độ bình thường của thời tiết nước ta đạt được thích hợp cho sản xuất. CHƯƠNG 4: QUI TRÌNH SẢN XUẤT SALAD CÀ CHUA 4.1 Sơ đồ qui trình sản xuất Chần Rửa sạch Cắt lát, tạo hình Nguyên liệu Rửa, để ráo Phối trộn Xử lý nước lên men Lên men Sản phẩm Bảo quản Hình 4.1: Sơ đồ qui trình sản xuất salad cà chua 4.2 Thuyết minh qui trình 4.2.1 Nguyên liệu Nguyên liệu chính: Cà chua Nguyên liệu phụ: Cà rốt, Su hào, Đu đủ, Tỏi, Ớt, Gừng. Bảng 4.1 Thành phần nguyên liệu tính trên 100g Nguyên liệu % khối lượng Cà chua 50 Cà rốt 12,50 Đu đủ 12,50 Su hào 12,50 Ớt 5 Tỏi 5 Gừng 2,50 Hình 4.2: Nguyên liệu chuẩn bị 4.2.2 Rửa sạch Nguyên liệu được rửa sạch hết bụi và loại bỏ những phần bị hư hỏng. 4.2.3 Cắt lát, tạo hình Tiến hành cắt lát tạo hình cho nguyên liệu. Hình 4.3: Nguyên liệu được tạo hình 4.2.4 Chần Nhiệt độ chần khoảng 60- 70 oC, chần trong nước bổ sung thêm hàm lượng CaCl2 0,05% - 0,1%. Sản phẩm có độ cứng tốt nhất khi chần ở thời gian 60 giây do cấu trúc tế bào chưa bị phá vỡ và CaCl2 đủ thời gian để phản ứng với pectin trong nguyên liệu. Đồng thời ở thời gian này sản phẩm có mùi vị tốt nhất. Thời gian chần dài hay ngắn đều ảnh hưởng đến màu sắc sản phẩm. 4.2.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng CaCl2 bổ sung trong nước chần Rau củ sau khi lên men thì cấu trúc sẽ trở nên mềm hơn và giảm độ giòn. Sản phẩm salad cà chua sau khi lên men cũng không tránh khỏi hiện tượng trên. Sử dụng CaCl2 có tác dụng làm cải thiện độ giòn của nguyên liệu. Ở hàm lượng 0,1% thì có độ cứng tốt hơn ở hàm lượng 0,075% và 0,05%, do ở hàm lượng CaCl2 càng cao thì Ca2+ tan trong nước chần càng nhiều làm tăng độ cứng của nước chần. Tuy nhiên ở hàm lượng CaCl2 là 0,075% thì sản phẩm có mùi vị dễ chấp nhận và khi tăng hàm lượng CaCl2 lên thì sản phẩm có vị chát. Tuy nhiên, hàm lượng CaCl2 càng cao làm cho màu sắc sản phẩm sáng hơn do Ca2+ được phân ly nhiều hơn. Khi lên men trong cùng hàm lượng muối, đường, tỷ lệ vi khuẩn lactic thì hàm lượng acid lactic sinh ra tỷ lệ nghịch với hàm lượng CaCl2 bổ sung trong quá trình chần. 4.2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chần Dưới tác dụng của nhiệt độ cao làm cho cấu trúc sản phẩm bị mềm. Chần ở nhiệt độ càng cao thì cấu trúc nguyên liệu mềm hơn khi chần ở nhiệt độ thấp. Khi chần ở nhiệt độ 65 - 70 oC sau khi lên men có màu sắc dễ chấp nhận hơn, đồng thời chần ở nhiệt độ này sản phẩm có mùi vị tốt hơn chần ở nhiệt độ thấp và cao hơn. Khi chần ở nhiệt độ 60 - 65 oC thì hàm lượng acid lactic sinh ra nhiều hơn. Nguyên nhân là do khi tiếp xúc lâu với nhiệt độ thì một số vi sinh vật trên bề mặt nguyên liệu bị tiêu diệt, trong đó có cả vi khuẩn lactic. Vì vậy, khi ta bổ sung cùng một hàm lượng muối, đường, chủng vi khuẩn lactic thì khả năng thích ứng với môi trường để lên men ở nhiệt độ chần thấp là tốt nhất. 4.2.4.3 Ảnh hưởng của thời gian chần Nguyên liệu được chần ở thời gian 90 giây thì cấu trúc sản phẩm kém do nhiệt độ phá vỡ tế bào và protopectin trong nguyên liệu chuyển thành pectin hòa tan làm sản phẩm mềm. Nguyên liệu chần ở thời gian 30 giây thì có độ cứng kém hơn 60 giây do CaCl2 chưa đủ thời gian thấm vào nguyên liệu tác dụng với pectin tạo pectate calcium. Sản phẩm có độ cứng tốt nhất khi chần ở thời gian 60 giây do cấu trúc tế bào chưa bị phá vỡ và CaCl2 đủ thời gian để phản ứng với pectin trong nguyên liệu. Đồng thời ở thời gian này sản phẩm có mùi vị tốt nhất. Thời gian chần dài hay ngắn đều ảnh hưởng đến màu sắc sản phẩm. Thời gian chần càng ngắn (30 giây) thì khi lên men lượng acid tổng sinh ra càng nhiều, thời gian chần càng dài (90 giây) thì lượng acid sinh ra thấp. 4.2.4.4 Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt đến màu sắc của sản phẩm Thời gian chần càng lâu thì màu sắc có chiều hướng giảm. Khi nhiệt độ chần 65 - 70 oC cùng với thời gian 60 giây, sản phẩm có màu sắc dễ chấp nhận hơn so với nhiệt độ cao hơn hay thấp hơn. 4.2.5 Rửa sạch để ráo Nguyên liệu được rửa sạch sau khi chần và để cho ráo chuẩn bị lên men sản phẩm. 4.2.6 Phối trộn Nguyên liệu được trộn đều cho thấm đều dịch lên men và cho vào hộp kín để len men. 4.2.7 Xử lý nước lên men Giống vi sinh vật được sử dụng để lên men là chủng giống vi khuẩn Lactobacillus sp. Dịch lên men có hàm lượng muối 3%, đường 2%, bột vi khuẩn lactic bổ sung 0,75%. Dung dịch muối, đường được nấu sôi để nguội, để loại trừ các vi sinh vật tạp. 4.2.7.1 Ảnh hưởng hàm lượng muối đến hàm lượng acid trong sản phẩm qua các ngày lên men Khi sử dụng hàm lượng muối càng cao thì hàm lượng acid tạo thành càng giảm, do hàm lượng muối cao ức chế sự hoạt động của vi khuẩn lactic. Trong quá trình lên men thì quá trình thẩm thấu dịch bào trong nguyên liệu diễn ra. Do đó, ở hàm lượng muối cao ức chế hoạt động của vi sinh vật làm giảm quá trình sản sinh acid lactic. Ở hàm lượng muối cao 4% không xảy ra hiện tượng có mùi xấu trong sản phẩm nhờ sự ức chế hoạt động của các vi sinh vật gây hại, tuy nhiên lại làm giảm giá trị cảm quan sản phẩm. Còn ở hàm lượng muối 2%, sản phẩm không tạo được vị thích hợp do ở hàm lượng muối thấp, khả năng ức chế hoạt động lên men của vi sinh vật kém làm sản phẩm có mùi vị không tốt. Lên men ở hàm lượng muối 3% thì sản phẩm tạo thành có mùi vị đặc biệt, có vị chua mặn rất hài hòa thích hợp với sản phẩm muối chua. 4.2.7.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến hàm lượng acid trong sản phẩm qua các ngày lên men Khi hàm lượng đường cao thì lượng acid tạo ra sẽ nhiều hơn do đường cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic phát triển và cơ chất cho quá trình lên men. Ở hàm lượng đường cao bổ sung vào 3% thì lượng acid sinh ra nhiều làm giảm mùi vị đặc trưng của sản phẩm, tuy nhiên ở hàm lượng đường thấp 1% thì sản phẩm có mùi vị chưa hài hòa. Hàm lượng đường 2% thì mùi vị sản phẩm đạt giá trị cảm quan cao hơn. Sự tạo thành mùi vị thích hợp trong sản phẩm nhờ các vi sinh vật thực hiện quá trình lên men dị hình tạo ra được acid lactic, rượu eytlic và acid acetic phù hợp với khẩu vị. 4.2.8 Lên men Quá trình lên men của sản phẩm trong thời gian 4 - 5 ngày. Sự lên men lactic cần được tiến hành trong điều kiện yếm khí và các vi khuẩn lactic hoạt động tốt trong điều kiện môi trường không có oxi không khí. Có 3 giai đoạn: Giai đoạn đầu: do muối ăn tạo nên áp suất thẩm thấu lớn nên đường và các chất dinh dưỡng khuyếch tán vào muối và bắt đầu có sự hoạt động của vi khuẩn lactic và một số vi khuẩn khác. Trong giai đoạn này, lượng acid lactic sản sinh ra với lượng rất nhỏ (<1%). Muối có nồng độ 2.5 – 3% khi lên men sẽ làm cho môi trường ưu trương, vì thế đường và các chất từ tế bào rau quả một phần sẽ khuếch tán ra môi trường. Do đó vi khuẩn lactic cùng các vi sinh vật khác cùng phát triển. Giai đoạn hai: các vi khuẩn lactic phát triển rất mạnh mẽ và acid sinh ra tích tụ nhiều. Do vi khuẩn lactic phát triển mạnh, nên pH môi trường giảm xuống 3 – 3,5 làm ức chế các vi khuẩn khác, chỉ còn vi khuẩn lactic phát triển, chúng chiếm ưu thế tuyệt đối, rau quả trở nên chua, ngon. Giai đoạn này là giai đoạn rất quan trọng của quá trình lên men lactic. Giai đoạn ba: khi acid lactic bị tích tụ với lượng khá cao thì các vi khuẩn cũng bị ức chế. Khi ấy nấm men và nấm mốc có thể phát triển mạnh và làm giảm chất lượng của sản phẩm. Hình 4.4: Sản phẩm được lên men 4.2.9 Sản phẩm Sản phẩm salad cà chua được cho vào hộp đậy kín lại. Hình 4.5: Các sản phẩm được bảo quản 4.2.10 Bảo quản Các vi sinh vật có khả năng hoạt động ở các khoảng nhiệt độ khác nhau. Nấm mốc: Penicillin, Mucor... phát triển khá mạnh ngay cả ở những sản phẩm lạnh đông. Nấm men ưa lạnh: phát triển ở nhiệt độ 2 – 30 oC, môi trường thích hợp nhất là ở sản phẩm chua. Vì vậy tiêu diệt vi sinh vật bằng nhiệt độ thấp nói chung rất khó, đòi hỏi phải hạ nhiệt độ thật nhanh, đột ngột và đến thật thấp. Khi bảo quản rau muối chua chỉ sử dụng nhiệt độ lạnh nên phải kết hợp với sử dụng phụ gia thực phẩm như acid lactic, acid sorbic. CHƯƠNG 5: PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU 5.1 Chỉ tiêu vi sinh 5.1.1 Các chỉ tiêu vi sinh vật Bảng 5.1 Chỉ tiêu vi sinh Tên chỉ tiêu TCVN Tổng vi khuẩn hiếu khí 104/1ml Coliforms 10/1ml Escherichia Coli 0 (Theo tiêu chuẩn Việt Nam về chỉ tiêu vi sinh cho sản phẩm lên men rau củ, TCVN 5155:90) 5.1.2 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí 5.1.2.1 Định nghĩa và nguyên tắc Sinh vật hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. chỉ số này có tên gọi khác nhau như sau: số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count, APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count, TPC), tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC). Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời gian bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm. 5.1.2.2 Sơ đồ quy trình xác định tổng vi sinh vật hiếu khí 25g mẫu + 225ml SPW à đồng nhất trong 30 giâyà độ pha loãng 10-1 Pha loãng trong nước muối à độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 Từ mỗi độ pha loãng cấy 1ml trên 2 đĩa Petri vô trùng. Sau đó đổ môi trường PCA đã được làm nguội đến 45oC Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội à úp ngược à đem ủ ở nhiệt độ 30 oC trong 72 giờ Đọc kết quả các kết quả từ 25 – 250 khuẩn lạc Hình 5.1: Sơ đồ quy trình xác định tổng vi sinh vật hiếu khí 5.1.2.3 Thuyết minh quy trình Bước 1 Trước khi tiến hành phân tích, thực hiện việc đồng nhất mẫu như sau: Đối với mẫu rắn, dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đã được khử trùng cân chính xác 10g (hay 25g) mẫu vào trong bao PE. Tất cả thao tác tiếp theo cần phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. Thêm vào lượng mẫu này 90ml (hay 225ml) dung dịch pha loãng SPW. Thực hiện đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (Stomacher). Thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất cơ lý của mẫu, nhưng không quá 2,5 phút. Trong trường hợp không có máy dập mẫu thực hiện thao tác như sau: xay nhuyễn mẫu trong điều kiện vô trùng. Cân chính xác trong điều kiện vô trùng 10g (hay 25g) mẫu, bổ sung vào trong bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được hấp khử trùng. Lắc đều mẫu dạng lỏng, hút 10ml (hay 25ml) cho vào bình tam giác chứa 90ml (hay 225ml) nước SPW đã được hấp khử trùng, lắc đều. Sau khi được làm đồng nhất bằng một trong các phương pháp như trên, dung dịch mẫu thu được có độ pha loãng là 10-1 so với ban đầu. Bước 2 Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dung pipet vô trùng (hoặc pipetman với đầu tip vô trùng) chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng. Trộn mẫu trong ống nghiệm cho đồng nhất bằng máy rung (vortex) hoặc dung pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 – 10 lần. Dung dịch mẫu này có độ pha loãng là 10-2. Sau đó, sử dụng cùng pipet hoặc pipetman có cùng đầu tip chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml dung dịch pha loãng và thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có các độ pha loãng thập phân tiếp theo cho đến độ pha loãng cần thiết. Lưu ý nếu pipet hoặc đầu tip pipetman nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác (chạm tay, chạm mặt ngoài ống nghiệm, mặt ngoài bình chứa…), cần phải thay pipet hoặc đầu tip vô trùng khác. Bước 3 Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến 25 – 250 tế bào vi sinh vật trong 1ml để cấy lên đĩa pertri. Dùng pipet vô trùng hoặc pipetman với đầu tip vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu pha loãng cấy ít nhất 2 – 3 đĩa (tức là thực hiện 2 – 3 lần lập lại). Sau khi cấy, đổ vào đĩa 10 – 15ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở 45oC. Bước 4 Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa Petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần ngay sau khi đổ môi trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc. Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30±1oC trong 72 giờ. Nhiệt độ và thời gian ủ có thể thay đổi theo quy định của tiêu chuẩn. Đọc kết quả Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết quả. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính như sau: N n1 Vf1+….+ niVfi A(CFU/g hay CFU/ml) = Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n1: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng 5.1.3 Định lượng coliforms bằng phương pháp MPN 5.1.3.1 Định nghĩa coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms phân và E. coli Coliform là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid la sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi ủ ở 37oC trong môi trường canh lauryl Sulphate và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dung để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Tuy nhiên, mối lien hệ giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường canh EC. Coliform phân (Faecal Coliform hay E. coli giả định) là coliform chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm. E. coli là Coliform phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++-- (Indol +, Mythyl Red +, Voges-Proskauer -,Citrate -). 5.1.3.2 Nguyên tắc Số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân và E. coli trong mẫu nước, thực phẩm mât độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lập lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. 5.1.3.3 Sơ đồ qui trình định lượng coliform Chuẩn bị mẫu đồng nhất hoặc pha loãng để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 9ml canh LSB, mỗi nồng độ 3 ống lặp lại ủ ở 37oC, 48 giờ Ghi nhận các ống LSB (+) ở mỗi nồng độ pha loãng Cấy vào ống canh BGBL, ủ ở 37±1oC, 48 giờ Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng Coliforms Hình 5.2: Sơ đồ qui trình định lượng Coliform Thuyết minh quy trình Bước 1 Cân chính xác 10g (hay 25) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm 90ml (hay 225ml) dung dịch pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (Stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 2,5 phút. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ có dung dịch pha loãng là 10-1. Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cánh dùng micropipette vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng à đồng nhất, ta sẽ có dịch pha loãng là 10-2.