Khóa luận Nghiên cứu biểu hiện gen Trehalase tái tổ hợp ở E.coli và xác định các tính chất của enzyme

hể đóng vai trò trong cơ cấu kháng khuẩn hoặc enzyme có thể đóng vai trò trong việc giảm lượng Trehalose có nguồn gốc từ vi sinh thực vật I.4.4 Trehalase trong nấm men Trong S.cerevisiae có ít nhất 2 enzyme Trehalase khác biệt được tìm thấy. Một loại được điều hòa bởi cAMP-phụ thuộc phosphorylation. Hoạt động của loại enzyme này được tìm thấy trong dịch bào tương. Loại enzyme hoạt động thứ hai được tìm thấy trong các không bào của 12 vi sinh vật tương ứng. Nồng độ pH của Trehalase dịch bào tương vào khoảng 7.0 do đó nó được cho vào cùng loại với Trehalase trung tính. Trong khi đó, enzyme Trehalase không bào được cho rằng có khả năng hoạt động tốt nhất tại độ pH khoảng 4.5 và được coi là Trehalase axit. Hai loại enzyme này mã hóa bởi hai loại gen khác nhau là NTH1 và ATH1 I.4.5 Thủy phân Trehalose Một phân tử Trehalose được thủy phân thành 2 phân tử glucose bằng enzyme Trehalase. Thủy phân enzyme của Trehalose lần đầu tiên được tiến hành vào năm 1893 tại Aspergillus niger bởi Bourquelot. Fischer đã thấy được phản ứng này trong S. cerevisiae vào năm 1895. Trehalase (α, α-trehalose-1-C-glucohydrolase, EC 3.2.1.28) đã được tìm thấy trong rất nhiều sinh vật bao gồm động vật và thực vật. Mặc dù Trehalose không được tìm thấy trong lớp động vật có vú nhưng enzyme Trehalase có trong màng biên tế bào thận và lông nhung của màng ruột. Trong ruột, chức năng của enzyme này là giúp ruột hấp thụ được Trehalose. Thủy phân Trehalose bằng enzyme Trehalase là một quá trình sinh lý học quan trọng của nhiều loại sinh vật như nảy mầm bào tử nấm, côn trùng bay và tăng trưởng lại trong tế bào không hoạt động tích cực. I.5. Tổng quan về đường chức năng Trehalose I.5.1 Trehalose Trehalose là đường đôi không khử (α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-glucopyranoside) Trehalose là một đường tự nhiên với chức năng tương tự như đường sucrose nhưng ổn định hơn và có vị ngọt nhẹ hơn. Trehalose là đường đa chức năng, vị ngọt nhẹ của nó (45% sucrose). Hình 1: Biểu đồ hàm lượng đường trehalose, maltose, glucose, sucrose Thành phần các chất dinh dưỡng trong đường Trehalose: Thành phần Giá trị thành phần trong 100g Năng lượng 628kj/150kcal Protein 0g Carbonhydrate trong đường 100g Hàm lượng chất béo 0g Hàm lượng xenluloza 0g Hàm lượng natri 0g Bảng 1: Thành phần các chất trong đường Trehalose Sau đây là bảng hàm lượng Trehalose có trong một số thực phẩm và lượng mà chúng ta phải hấp thụ mỗi ngày mà chúng tôi đã thống kê được: Loại thực phẩm Hàm lượng đường Trehalose (%) Lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày (g/ngày) Nước ép hoa quả và rau 10 16 Kem 10-20 4.8 Mứt kẹo 7-20 10 Lớp phủ kem trên bánh ngọt 5 0.1 Thóc, gạo 2 19 Các sản phẩm từ bột mỳ 2 14 Bánh quy, bánh ngọt 5-10 40 Sản phẩm từ cá 10 0.3 Hỗn hợp khác 10-20 1.8 Bảng 2: Hàm lượng Trehalose và lượng thực phẩm tiêu thụ mỗi ngày Cấu tạo Trehalose: Hình 2: Công thức cấu tạo của trehalose Hình 3: Sơ đồ phản ứng enzyme I.5.2 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể sống I.5.2.1 Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon Trehalose không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột nên khi ăn lượng đường hòa tan trong máu không bị biến động. Trong gan, hoạt lực của enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn sacaroza nhưng sẽ được bình thường hóa bởi sự cung ứng Trehalose. Như vậy, Trehalose có vai trò khá tích cực trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét về góc độ bệnh lý liên quan đến sự gia tăng của lipoprotein trong máu. Vì thế Trehalose hiện nay được dùng nhiều như một chất thấp năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng bị bệnh tiểu đường. Từ kết quả của một nghiên cứu khác cho thấy, đối với những người mắc bệnh tiểu đường, nếu mỗi ngày mỗi người ăn 8g trehalose, lượng đường trong máu sẽ giảm nhanh trong 14 ngày. I.5.2.2 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng Trehalose có thể tăng cường sự hấp thụ canxi của tế bào. Nhờ đặc tính này, Trehalose có thể giúp cho con người phòng chống các bệnh về chuyển hóa và bệnh loãng xương. Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già. Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều có một kết luận chung là do ba yếu tố sau: + Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lên men, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi + Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trường có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tán vào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi. + Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tế bào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu. Ngoài canxi, Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie. Điều này thúc đẩy quá trình phát triển xương, tăng cường hàm lượng canxi trong xương. I.5.2.3 Ảnh hưởng của Trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liên cầu khuẩn gây nên. Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng của người và động vật. Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinh dưỡng thích hợp dễ lên men, phát triển và gây bệnh. Vì thế nếu trong thành phần thức ăn của ta không chứa hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinh dưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh. Để xét ảnh hưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người ta đã tiến hành thí nghiệm trên cơ thể chuột. Kết quả cho thấy nhóm chuột thí nghiệm (ăn đường Trehalose) bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn Saccaroza) Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi trường Trehalose đã chứng tỏ cơ chế và khả năng phòng bệnh sâu răng của nó. Đó là do Trehalose không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vật trên phát triển. Ngoài ra Trehalose còn có khả năng chữa bệnh sâu răng. Vì thế ngày nay trên thế giới người ta còn dùng Trehalose thay thế cho đường kính trong thành phần ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng bệnh sâu răng. I.5.2.4 Tính kháng khuẩn của Trehalose Như chúng ta đã biết probiotic là những chế phẩm chứa nhiều vi sinh vật có lợi như lactobacillus và bifidobacteria. Các vi sinh vật này có khả năng kháng khuẩn gây bệnh đi ngoài. Hiện nay các chế phẩm probiotic bán trên thị trường thường chứa nhiều đường Trehalose, bởi đường Trehalose có tác dụng là cơ chất tốt cho sự phát triển của các vi sinh vật có lợi. Chính sự có mặt và đóng góp vai trò tích cực trên người ta đã nói rằng đường Trehalose có khả năng kháng khuẩn (antibiotic) I.5.2.5 Tính an toàn của Trehalose Để khẳng định tính an toàn của Trehalose đối với cơ thể sống đã có nhiều nghiên cứu về tế bào và gen của động thực vật ăn Trehalose. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung để trả lời các câu hỏi là khi động vật sử dụng Trehalose có ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của tế bào hay không? Có gây ra đột biến về gen dẫn đến sự tổng hợp AND bất quy tắc hay không? Tất cả các nghiên cứu đã cho kết luận là Trehalose không gây độc hai đến tế bào chủ thể. I.6. Ứng dụng của Trehalose Một số sản phẩm đường Trehalose : Hình 4: Một số loại thực phẩm chứa trehalose Phụ thuộc vào độ tinh khiết Trehalose thương phẩm chủ yếu có hai loại là Trehalose có độ tinh khiết 45% và Trehalose có độ tinh khiết cao hơn 70%. Với độ tinh khiết 45% thường được dùng trực tiếp như một loại thực phẩm hoặc như một loại chất ngọt bổ sung trong chế biến các loại thực phẩm khác. Còn đường có độ tinh khiết cao hơn 70% thường dùng cho các đối tượng mắc bệnh, các đối tượng ăn kiêng. Ngoài ra đường tinh khiết 100% dùng trong việc phân tích hóa học. Đường Trehalose có nhiều đặc tính sinh học đáng quý, có hương vị và tính chất hóa lý tương tự đường kính nên được sử dụng thay thế đường kính trong sản xuất các loại thực phẩm chứa đường như kẹo, bánh và bột dinh dưỡng trẻ em.v.v… Sản phẩm sau khi cải tiến này sẽ có giá trị cao về mặt dinh dưỡng cũng như chức năng phòng ngừa bệnh tật đồng thời hương vị cũng được cải tiến rất nhiều. Trên thế giới việc sử dụng đường Trehalose trong sản xuất các mặt hàng chức năng như sữa, bánh kẹo, thức ăn cho người bệnh.v.v… Các sản phẩm được bổ sung đầu tiên là bánh quy, sữa chua. Ngày nay đã được dùng cho các sản phẩm đồ uống. Ngoài ra, Trehalose còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Đường có độ tinh khiết thấp có thể làm chất bổ sung trong môi trường nuôi cấy một số vi khuẩn, loại có hàm lượng trung bình dùng cho người ăn trực tiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn loại tinh khiết dùng trong kỹ thuật phân tích. Trehalose cũng được sử dụng như một loại dược phẩm dùng nhiều cho các đối tượng người già, trẻ em và người bệnh trong thời kỳ phục hồi sức khỏe để tăng cường hoạt động tiêu hóa, giúp cho các đối tượng trên nhuận tràng ăn tốt. Trehalose có tính hòa tan cao Hình 5: Tính hòa tan của Trehalose và Sucrose I.7 Tình hình nghiên cứu và sản xuất Trehalose trên thế giới Trehalose có thể thu nhận được bằng cách chiết suất chúng từ các loại cây quả, hoặc bằng các phương pháp hóa học, hóa lý, hóa sinh. Nhưng cho tới nay phương pháp được coi là có hiệu quả và có khả năng công nghiệp hóa nhất là phương pháp công nghệ sinh học. Thông thường Trehalose được sản xuất theo phương pháp liên tục và không liên tục. Trong phương pháp sản xuất liên tục công nghệ cố định enzyme hoặc cố định tế bào được sử dụng, còn đối với phương thức sản xuất không liên tục thì sử dụng enzyme đã chiết tách. Giải pháp cố định enzyme và cố định tế bào trong sản xuất Trehalose cho hiệu quả cao hơn vì sản xuất liên tục tiêu hao năng lượng ít, nhà xưởng nhỏ… nhưng tính ổn định kém và cần máy móc thiết bị hiện đại, nhà xưởng tiêu chuẩn. Tuy vậy, đây lại là phương pháp có khả năng công nghiệp hóa cao và được tập trung nghiên cứu nhiều ở các nước có nền công nghiệp phát triển như Nhật Bản, Hàn Quốc. Trung Quốc, Pháp, Mỹ,… I.8. Tình hình nghiên cứu và sản xuất Trehalose ở Việt Nam Công nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng nói chung và công nghiệp sản xuất đường Trehalose nói riêng đang được phát triển mạnh trên thế giới. Cùng với xu hướng phát triển chung của toàn cầu. Ở Việt Nam lĩnh vực này cũng đang được chú ý rất nhiều do nhu cầu thị trường ngày càng cấp bách. Ngoài viện Công nghiệp thực phẩm ra một số trường và các viện khác như trường đại học Bách Khoa Hà Nội, trường đại học Nông Nghiệp, Viện đại học Mở Hà Nội, viện nghiên cứu thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh cũng bắt đầu có những nghiên cứu thăm dò trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất loại đường chức năng này. Tuy nhiên các nghiên cứu mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Nguyên vật liệu và hóa chất II.1.1 Giống vi sinh vật Chủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 alpha. E.coli được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria – Bertani) [1% tryptone, 0.5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 100µg/ml ampicillin để làm nhân tố chọn lọc. II.1.2 Plasmid: DNA mang gen Trehalase được cung cấp bởi Viện Công Nghệ Sinh Học Hàn Quốc, Seoul II.1.3 Hóa chất Tinh bột tan (Trung Quốc), bactotryton (Hàn Huốc), bacto yeast extract (Hàn Quốc), NaCl (Trung Quốc), canxiclorua (Trung Quốc), agar (Việt Nam), glycerol (Việt Nam), acrylamide (Trung Quốc), N,N-methylene-bis Acrylamide (Trung Quốc), glycine (Trung Quốc), sodiummetabisulfate (Trung Quốc), methanol (Trung Quốc), acetic acid (Trung Quốc), Amononium persulfate (ASP, USA), Ampicillin (USA), comassie-blue R-250 (USA), axit photphoric (Trung Quốc), ethanol (Trung Quốc), Tris-base (Sigma, USA), phenol (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc), potassium Sodium Tartrate (Trung Quốc), EDTA (USA), SDS (USA), DNS 3,5 Dinitro salicylic (Trung Quốc), Imidazole (Hàn Quốc), Glucose (Trung Quốc), Maltose (Trung Quốc), NaH2PO4(Trung Quốc), Na2HPO4(Trung Quốc), 2-mercaptoethanol (Đức), Bromophenol blue (Đức), NaHCO3 (Trung Quốc), Na2CO3(Trung Quốc), potassium acetate (Hàn Quốc), Boric axit (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), TEMED (Trung Quốc), APS (Trung Quốc), Dithiotheritol (Hàn Quốc), Ethidumbromide (Hàn Quốc) II.1.4 Máy móc và thiết bị Máy li tâm (Trung Quốc), máy so màu quang điện, máy đo pH, máy lắc (Trung Quốc), bình ổn nhiệt (Trung Quốc), nồi hấp (Trung Quốc), máy khuấy từ (Trung Quốc), máy siêu âm (Trung Quốc), cân điện tử (Đức), máy điện di (Trung Quốc), tủ sấy, box cấy (Trung Quốc), cân kỹ thuật (Mỹ), buồng điện di DNA (Nhật), máy li tâm lạnh siêu tốc liên tục (Đức). Và các dụng cụ cần thiết khác như bình tam giác, ống nghiệm, ống eppendof, đầu côn xanh, đầu côn vàng, đĩa peptri, pipet thủy tinh và pipet ... II.2 Phương pháp nghiên cứu II.2.1 Biến nạp E.coli DH5 alpha bằng phương pháp sốc nhiệt Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp tách ra từ tế bào thể cho sang thể nhận. Có nhiều phương pháp biến nạp được sử dụng như biến nạp bằng xung điện, sốc nhiệt…Trong đó biến nạp bằng sốc nhiệt là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao. Cơ chế biến nạp chủ yếu bao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thể tiếp nhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếp nhận DNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường. Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khả biến Nguyên tắc: Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế bào được xử lý CaCl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA. Tạo hỗn hợp vi khuẩn với DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao (4oC). Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vi khuẩn. Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và cố định trong tế bào vi khuẩn. Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứa môi trường có bổ sung kháng sinh. Quy trình biến nạp gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp. Phương pháp tiến hành như sau: + Tạo tế bào khả biến DH5 alpha Hoạt hóa tế bào E.coli trên môi trường thạch LB (1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl; 2% Agar) ở 37oC, 24 giờ. Lấy một khuẩn lạc cấy vào môi trường 5ml LB lỏng Hình 6: Vi khuẩn E.coli trong LB rắn (khuẩn lạc) Môi trường LB lỏng: 1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl Nuôi trên máy lắc (37oC, 12 – 14 giờ). Sau đó lấy 1% dịch nuôi cấy trên (50µl cho 50ml môi trường nuôi cấy LB) tiến hành lắc trên máy lắc 200 – 250 rpm ở 37oC để đạt được Abs 600 (khoảng 2 – 3 giờ). Tiếp đó chuyển dịch nuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50ml và ly tâm ở 4oC tốc độ 5000 – 7000 rpm trong 5 phút. Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12.5 ml) dung dịch 50mM CaCl2. Lắc nhẹ để làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phút trên đá. Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên và cho vào 1/10 thể tích (2.5 ml) dung dịch 100mM CaCl2 và làm tan hoàn toàn cặn. Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerol bảo quản trong nitơ lỏng. + Biến nạp Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µl DNA. Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt 2 phút ở 42oC. Sau sốc nhiệt bổ sung thêm 1ml LB và ủ ở 37oC trong 1h. Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biến nạp trên cấy trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (100ml LB, 100µl Amp) và để phát triển qua đêm ở 37oC. Hình 7: Vi khuẩn E.coli sau khi biến nạp trong LB rắn có kháng sinh Tất cả các thao tác đều làm trong box cấy vô trùng, các dụng cụ đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút. II.2.2 Tách DNA plasmid DNA tái tổ hợp sau khi được biến nạp vào chủng DH5 alpha sẽ nhân lên thành nhiều bản sao cùng với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Sau đó vector tái tổ hợp được tách chiết ra khỏi DNA genom vi khuẩn bằng cách xử lý với NaOH, SDS. Trong điều kiện này, DNA genom của vi khuẩn ở dạng mạch thẳng có phân tử lượng lớn sẽ bị đứt gãy còn plasmid ở dạng mạch vòng có kích thước phân tử nhỏ và bền vững nên sẽ không bị đứt gãy. Protein và tạp chất được loại bỏ bằng hỗn hợp Chloroform: iso – amyl alcohol. DNA plasmid thu được nhờ quá trình kết tủa với cồn và muối CH3COONa. Có rất nhiều phương pháp tách plasmid như: tách plasmid bằng phương pháp kiềm, tách plasmid bằng phương pháp boiling. Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng, nhặt một khuẩn lạc E.coli chứa plasmid từ đĩa petri nuôi cấy tế bào qua đêm vào ống nghiệm hoặc bình tam giác có chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung chất kháng sinh Ampicillin (nồng độ 100µg/ml) nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ 37oC, tốc độ 200 vòng/phút. Thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong các eppendoff 1.5ml. Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối loại dịch nổi. Đồng nhất tế bào, cho 100µl Sol I vào trong ống eppendoff chứa tế bào, hòa tan tế bào bằng máy vortex. Dung dịch Sol I: 25mM Tris – HCl pH 8.0; 10mM EDTA pH 8.0; 50mM glucose. Dung dịch được khử trùng ở 126oC và được cất giữ ở 4oC. Phá màng tế bào, cho 200µl Sol II vào tiếp, dùng tay đảo ngược ống eppendoff nhanh, nhẹ nhàng từ 3 – 5 lần. Dung dịch Sol II: 0.2N NaOH; 1% SDS Cho 150µl Sol III vào tủa protein, dùng tay đảo nhẹ ống từ 3 – 5 lần. Dung dịch Sol III: 3M Potasium Acetate pH 5.5; acetic acid 11.5M dung dịch được khử trùng và cất giữ ở 4oC Sau đó ly tâm ở 4oC với tốc độ 10000 rpm/phút trong 20 phút. Dùng pipet lấy dịch trong ở trên cho vào eppendoff mới (eppendoff được khử trùng) bỏ cặn. Lấy 600 - 800µl Isopropanol cho vào và lắc lên lắc xuống nhiều lần. Đem ly tâm ở 4oC với tốc độ 12000rpm/phút trong 10phút. Ta bỏ dịch phía trên đi, lấy cặn (DNA). Ta cho 500µl cồn 70% (cồn để lạnh) để rửa DNA, dùng pipet bơm lên, bơm xuống cho DNA tung ra. Ly tâm lạnh ở 12000 rpm/phút trong 15 phút sau đó lấy hết cồn ra rồi thực hiện rửa cồn 1 lần nữa. Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA plasmid tách được trong 40µl dung dịch TE hoặc nước cất vô trùng. Điện di mẫu kiểm tra mấu DNA plasmid trên gel agarose 0.8%. Bảo quản mẫu ở -20oC. II.2.3 Xác định DNA biểu hiện ở E.coli trên gel Agarose Nguyên tắc: Phương pháp điện di DNA trên gel agarose dựa vào đặc tính tích điện âm của phân tử axit Nucleic ở pH trung tính nhờ các nhóm photphat nằm trên các cầu nối phosphodiester của axit Nucleic. Khi được đặt trong điện trường, các phân tử axit Nucleic sẽ dịch chuyển về cực dương với tốc độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Các phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử có kích thước bé. Khả năng di động của các phân tử axit Nucleic này còn phụ thuộc vào nồng độ gel. Ở đây chúng tôi sử dụng gel agarose 0.8%. Các axit Nucleic trong gel sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ hóa chất ethidium bromide. Phương pháp tiến hành: 0.8% agarose gel trong dung dịch đệm TBE được đổ trên một giá thể nằm ngang (chuẩn bị gel agarose vào dung dịch đệm đun cho agarose tan hoàn toàn). Để nguội khoảng 50oC,cho 1µl ethidium bromide vào rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 30 phút, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Đổ dung dịch chạy điện di là đệm TBE (40mM Tris HCl và 2 mM EDTA, pH 8.) vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel khoảng 2mm và tiến hành tra mẫu. Trộn mẫu với 1.5µl đệm màu xanh 1X – xanh Bromophenol. Quá trình chạy điện di được tiến hành dưới hiệu điện thế 100V, thời gian là 25 – 30 phút. Sau khi chạy xong lấy bản gel ra và đem soi bằng tia tử ngoại UV 280 nm, plasmid DNA là những vạch màu da cam được so sánh với marker DNA ta xác định được kích thước và độ tinh sạch của DNA. II.2.4 Phương pháp phá vỡ tế bào Protein chiết xuất từ các tế bào vi khuẩn là một bước quan trọng đặc biệt đối với nghiên cứu trong các lĩnh vực hóa sinh học, vi sinh học và sinh học phân tử cũng như cho sự phát triển của quá trình sản xuất protein trong công nghệ sinh học và kỹ thuật sinh hóa. Hiện nay, protein chiết xuất từ các tế bào vi khuẩn thường được sử dụng phương pháp cơ học, đòi hỏi dụng cụ tương đối đắt tiền và đòi hỏi kỹ năng kỹ thuật. Đệm lysis i4 đã được phát triển bằng công nghệ Enzyme phòng thí nghiệm của các quốc gia Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học (BIOTEC-Thailand) để cung cấp một giải pháp rẻ tiền để chiết xuất protein, DNA. Có rất nhiều phương pháp để phá vỡ tế bào: phương pháp phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học và phi cơ học. Trong đó, phương pháp cơ học gồm có rất nhiều phương pháp như phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm, phá vỡ tế bào bằng máy đồng hóa cao áp, phá vỡ tế bào bằng phương pháp lạnh đông,… Phương pháp không bằng cơ học như phương pháp sốc thẩm thấu, phương pháp xử lý kiềm,… Do enzyme của chúng tôi là enzyme nội bào nên ở đây chúng tôi sử dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế bào. Các bộ đệm lysis đã được xây dựng để thu protein vi khuẩn bằng cách sử dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế bào. Điều quan trọng ở đây là chúng tôi sử dụng dung dịch phá vỡ tế bào rất có hiệu quả với nhiều loại tế bào vi khuẩn, nấm trong khi vẫn bảo toàn hàm lượng và hoạt tính của protein. Dung dịch đệm cũng được sử dụng cho tách chiết DNA từ vi sinh vật. Các đặc điểm của đệm lysis i4: - Dung dịch đệm có thể được sử dụng tách protein một cách hiệu quả từ rất nhiều loại vi sinh vật: vi khuẩn, nấm men, nấm. - Quá trình đơn giản và dễ làm - Đồ dùng và dụng cụ, máy móc không đòi hỏi cao - Dung dịch đệm không làm phản ứng biến tính và cung cấp protein để sử dụng cho thí nghiệm hóa học hay sản xuất protein trong công nghệ sinh học - Ngoài ra dung dịch đệm này còn được sử dụng ở bước bổ sung cho việc tách DNA một cách hiệu quả Phương pháp tiến hành: Lấy 2 ống eppendoff sạch đem cân ống eppendoff trên cân phân tích và ghi lại trọng lượng. Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng. Nhặt một khuẩn lạc từ đĩa petri (đã biến nạp, đĩa petri LB thạch có kháng sinh). Nuôi cấy tế bào qua đêm vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi lắc qua đêm ở 37oC tốc độ 200v/p Sau đó thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong 2 eppendoff mà ta vừa cân được đem ly tâm ở 6000rpm/phút trong 20 phút ở 4oC để thu sinh khối. Bỏ dịch trong và cân trọng lượng tế bào thu được. Bổ sung 200-300 µl/100mg tế bào. Sau đó, hòa tan cặn bằng vortex và đem ngâm đá 15 – 20 phút. Ly tâm 10 000 v/phút trong 30 phút rồi bỏ cặn thu dịch nổi. II.2.5 Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford Cơ sở của phương pháp: hàm lượng protein – enzyme đã được xác định vào năm 1976 bằng phương pháp của bradford. Cơ sở của phương pháp là dựa vào độ hấp thụ màu của phản ứng giữa enzyme và dung dịch Bradford, dựa vào đồ thị chuẩn BSA-Bradford để tính hàm lượng protein – enzyme. Phương pháp tiến hành: cho 100µl dung dịch protein pha loãng vào 900µl dung dịch Bradford (100mg Coomassie Brillitant Blue G250 hòa tan 500 ethanol, bổ sung 100ml phosphorich acid 85%, sau đó định mức đến 1lít bằng nước cất). Chuẩn bị blank (mẫu đối chứng) bằng cách bổ xung nước cất thay cho protein. Hỗn hợp phản ứng giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, cứ 1 phút vortex một lần. Sau đó, hỗn hợp được đo quang phổ ở bước sóng 595nm bằng máy spectrophotometer (máy so màu). Độ hấp thụ quang của dung dịch phản ứng dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford tính được nồng độ enzyme – protein có trong mẫu. Dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford có: Y = 1.0361x + 0.0524 R2 = 0.9944 Phương pháp tính toán hàm lượng protein – enzyme được viết như sau: X (mg/ml) = (∆abs - 0.0524): 1.0361 *D*RF Trong đó: X: Hàm lượng protein có trong mẫu phản ứng ∆abs:Giá trị hấp thụ quang phổ của mẫu ở bước sóng 595nm D: Hệ số pha loãng của enzyme RF: Hệ số phản ứng OD/595nm Hình 8: Đồ thị đường chuẩn Bradford với protein chuẩn ABS II.2.6 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp DNS (3.5 Dinitro – Salicylic) Cơ sở của phương pháp: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc acid dinitro-salicylic. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dung dịch đường khử nghiên cứu với thuốc thử DNS, dựa theo đồ thị chuẩn của glucose tinh khiết (hoặc đồ thị đường chuẩn maltose) với thuốc thử này ta tính được lượng đường khử của mẫu vật nghiên cứu. Để có được đường chuẩn cho phương pháp này chúng tôi tiến hành theo các bước sau: Chuẩn bị dịch đường 1% glucose tinh khiết. Chuẩn bị 6 ống nghiệm với các thành phần sau: STT Glucose 0.5% (mg/ml) Glucose 0.5% (µl) H2O (µl) DNS (µl) OD/575nm 1 0 0 2000 2000 0 2 0.25 100 1975 2000 0,357 3 0.5 200 1950 2000 0,525 4 0.75 300 1925 2000 0,824 5 1 400 1900 2000 1,125 6 1.25 500 1875 2000 1,425 7 1.5 600 1850 2000 1,625 Để các ống nghiệm vào nước đun sôi trong 10 phút. Rồi làm lạnh ngay bằng nước máy đến nhiệt độ phòng. Đo OD ở bước sóng 575nm sau đó vẽ đồ thị đường chuẩn Hình 9: Đồ thị đường chuẩn Glucose Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme được thực hiện như sau: Phản ứng enzyme đư