Khóa luận Nghiên cứu các điều kiện lên men một số loại cà phê phổ biến ở Việt Nam bằng chế phẩm Biocoffee-1 nhằm thu được chất hòa tan cao

steroid. Nhờ tác dụng này mà càng ngày người ta càng có thêm nhiều dược phẩm quý giá. Gần đây, nhiều loại nấm mốc đã được nghiên cứu sử dụng để sản xuất một số acid amin hoặc một số nucleotide và nucleozide (dùng trong công nghiệp thực phẩm 41 hoặc trong y dược). Có loại nấm mốc đang được nghiên cứu để tổng hợp cả cao su nhân tạo. Một số nấm mốc được sử dụng như những vi sinh vật chỉ thị trong việc định lượng vitamin, định lượng acid amin, định lượng nguyên tố vi lượng, kiểm tra hàm lượng N và P dễ tiêu trong đất, và nhất là kiểm tra hiệu quả tác dụng của các chất chống ung thư. Nấm mốc còn là nguồn của hàng loạt chất kháng sinh có giá trị như Penicillin, Cephalosporin, Fuzidin, Eniatin, Fungisporin, Verucarin,… Có thể nói khả năng ứng dụng nấm mốc đang tăng lên hàng ngày, hàng giờ trên thế giới. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích nhiều mặt, nấm mốc cũng là nguyên nhân gây ra nhiều tổn thất hết sức to lớn cho việc bảo vệ mùa màng, bảo quản lương thực, thực phẩm, hàng hóa, vải vóc, phim ảnh, sách vở,… Nhiều loại nấm mốc còn gây nên những bệnh khá phổ biến và khó điều trị ở người, gia súc và cây trồng. Các bệnh nấm ở người (như hắc lào, nấm vẩy rồng, nấm kẽ chân, nấm tóc, nấm toàn thân,…) rất hay gặp ở nước ta và đã gây ra những ảnh hưởng không nhỏ đối với sức khỏe và năng suất lao động.  Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những sợi này sinh trưởng ở đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành một đám chằng chịt các sợi. Từng sợi được gọi là khuẩn ti hay sợi nấm. Còn cả đám sợi thì được gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm. Nấm mốc là loại thực vật không có diệp lục, do đó không có khả năng tiến hành quang hợp như các loại cây xanh. Chúng sống nhờ các loại thức ăn hữu cơ có sẵn bằng khả năng hấp thụ của khuẩn ti. Đó là các cơ thể kí sinh hay hoại sinh. Một số khuẩn ti phát triển sâu vào cơ chất, giúp nấm mốc bám chặt vào cơ chất và hấp thụ các loại thức ăn chứa trong đó (khuẩn ti cơ chất hoặc khuẩn ti dinh dưỡng). Một số khuẩn ti khác phát triển trên bề mặt cơ chất (khuẩn ti khí sinh). Mỗi đoạn khuẩn ti khi rơi vào môi trường thích hợp sẽ phát triển nhanh chóng thành một đám nấm mốc mới. Ở một số loài, khuẩn ti được phân hóa thành những sợi bám trông giống như rễ cây, chúng được gọi là rễ giả. 42  Hai loại cơ quan dinh dưỡng thường gặp là thể đệm và hạch nấm. Thể đệm trông giống như cái đệm ghế, cấu tạo bởi nhiều khuẩn ti kết chặt lại với nhau. Cơ quan sinh sản thường được sinh ra bên trên hoặc bên trong thể đệm. Hạch nấm thường có hình hơi tròn hoặc hình không đều, bên ngoài thường có màu tối, bên trong là tổ chức sợi xốp hơn và thường có màu trắng. Kích thước của hạch nấm thay đổi tùy theo từng loài nấm (từ vài phần của mm đến vài cm, thậm chí ở một số nấm nhiệt đới, hạch nấm có đường kính lớn đến vài dm). Hạch nấm có thể giúp cho cơ thể nấm sống qua những điều kiện ngoại cảnh bất lợi trong một thời gian khá dài. Khi điều kiện sống trở lại thuận lợi, hạch nấm sẽ nẩy mầm và phát triển thành những khuẩn ti hoặc những thể sinh sản mới.  Nấm mốc có thể sinh sản theo nhiều hình thức khác nhau: Phát triển bằng khuẩn ti: một đoạn khuẩn ti riêng rẽ  phát triển thành một khuẩn ti thể  khuẩn ti và đất bụi theo gió bay khắp nơi  gặp điều kiện thuận lợi  phát triển thành cơ thể mới. Một số loài nấm mốc có khả năng hình thành những bào tử màng dày gọi là bào tử áo. Một số có thể phát triển bằng các hạch nấm. Những cách trên được gọi là sinh sản sinh dƣỡng. Về sinh sản vô tính của nấm mốc, người ta thấy có 2 hình thức: Bào tử kín được sinh ra ở trong các nang  nang vỡ  các bào tử kín được phóng thích ra ngoài, mỗi bào tử lại phát triển thành một khuẩn ti thể mới. Sinh sản vô tính bằng các bào tử trần, các bào tử trần do các tế bào sinh bào tử là các thể bình tạo thành. Ngoài ra, nhiều loài nấm mốc còn có thể sinh sản theo hình thức hữu tính. Cũng giống như các sinh vật bậc cao, sinh sản hữu tính ở nấm cũng xảy ra quá trình chất giao, nhân giao và quá trình phân bào giảm nhiễm. 43 2.10. ASPERGILLUS NIGER [33], [34], [42] Vị trí phân loại của Aspergillus niger được xếp như sau: Lớp: Deuteromyces Bộ: Moniliales Họ: Moniliaceace Giống: Aspergillus Nhóm: Aspergillus niger Hình 2.12: Aspergillus niger dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x400) Khuẩn lạc Aspergillus niger trên môi trường cao nấm men Czapek (CYA) có dạng lông nhung, khi còn non có màu trắng, khi già có màu nâu đen, mặt trái của petri thường có màu vàng nhạt đến vàng sáng. Cuống sinh bào tử được sinh ra từ khuẩn ti khí sinh, có chiều dài 1 – 3 mm, có vách tế bào trơn bóng và trong suốt. Đỉnh cuống phình ra có dạng hình cầu được gọi là bọng, có đường kính từ 50 – 75 m, sinh ra 2 lớp thể bình: lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược; lớp thứ hai hình chai, sinh ra bào tử đính hình cầu, bào tử đính có đường kính 4 – 5 m, có màu nâu đen, vách bào tử đính có dạng xù xì. Đặc tính sinh lý: Aspergillus niger sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 6 – 8oC, tối đa 45 – 47oC, tối ưu 35 – 37oC (Panasenko, 1967). Độc tố: Aspergillus niger được xem là nấm sợi không sinh độc tố và được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm. Các enzyme thủy phân thu nhận được từ chủng này không gây đột biến vi khuẩn và các mô của chuột. 44 Sinh thái: Aspergillus niger chiếm ưu thế ở vùng khí hậu nhiệt đới. Bào tử đính màu đen nên không bị ảnh hưởng bởi tia mặt trời và tia cực tím. Aspergillus niger thường được phân lập từ các sản phẩm phơi nắng: cá, cây gia vị,… Aspergillus niger làm thối rữa trái cây (táo, cam, quýt dâu,…) và hoa màu (hành, tỏi, cà chua,…) 2.11. TRICHODERMA REESEI [4], [26], [33], [41] Trichoderma reesei được phân loại như sau: Lớp: Deuteromycetes Bộ: Moniliales Họ: Moniliaceae Giống: Trichoderma Nhóm: Trichoderma reesei Hình 2.13: Trichoderma reesei dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x400) Khuẩn lạc ban đầu trong suốt, sau đó có màu xanh lục do hình thành bào tử. Cuống sinh bào tử có dạng chùm, phân nhánh liên tục, sinh ra các thể bình có dạng hình tam giác, mỗi nhánh kết thúc bởi một thể bình. Đính bào tử hình cầu, đường kính 3,6 – 4,5 m, có màu xanh lục, có vách xù xì. Đặc tính sinh lý: Sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 0oC, tối đa 30 – 37oC, tối ưu 20 – 28oC. Độc tố: Trichoderma reesei không sinh ra các chất kháng sinh và không gây bệnh cho động – thực vật, chế phẩm enzyme thô từ Trichoderma reesei không gây đột biến vi khuẩn và các mô, cũng như không gây quái thai cho chuột. 45 Sinh thái: Trichoderma reesei phân bố ở vùng cực Bắc, vùng núi, vùng nhiệt đới. Trichoderma reesei là nấm sợi sinh sản vô tính, phân lập được trên các đảo Solomon trong chiến tranh Thế giới thứ II từ các mảnh vải cotton. Chủng này có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase và là tổ tiên của nhiều biến chủng được sử dụng hiện nay. Trichoderma reesei có khả năng phân giải hoàn toàn cellulose tự nhiên với hiệu suất cao vì hệ enzyme cellulase của Trichoderma reesei đầy đủ 3 thành phần (endocellulase, exocellulase và -glucosidase) và được tiết ra môi trường nuôi cấy với một lượng lớn (có thể đạt 40 g/l). Vì vậy, đây là loại nấm có nhiều tiềm năng trong công nghiệp sản xuất enzyme cellulase. Cellulase của Trichoderma reesei có pH tối thích là 5,0 và nhiệt độ tối thích là 50 o C. Sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma reesei cũng như từ các chủng vi sinh vật khác đòi hỏi phải bổ sung chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy như cám, rơm, bã mía, mùn cưa,… 46 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 3.1: Cà phê Bi Hình 3.2: Cà phê Sẻ mua từ thị trƣờng mua từ thị trƣờng Hình 3.3: Cà phê Mokka mua từ thị trƣờng 47 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian Từ 1 – 3 – 2005 đến 1 – 8 – 2005. 3.1.2. Địa điểm o Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: 268 Lý Thường Kiệt – Quận 10 – Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. VẬT LIỆU 3.2.1. Cà phê nhân 3.2.1.1. Giống Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 3 loại cà phê với tên gọi trên thị trường là: o Cà phê Bi o Cà phê Sẻ o Cà phê Mokka 3.2.1.2. Nguồn gốc Nguồn mua từ cửa hàng mua bán cà phê tươi Thuận Hiệp Địa chỉ: 36A Nguyễn Thị Nhỏ – Phường 14 – Quận 5 – Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2. Nấm sợi Các chủng được sử dụng là Aspergillus niger và Trichoderma reesei nhận từ Bộ môn Công nghệ sinh học – thuộc khoa Công nghệ Hóa học và Dầu khí – trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.3. Cơ chất o Malt o Cám gạo o Bột cà rốt o Trấu o Khoai tây o Bột mì o Bột sắn o CMC (Sodium carboxymethyl cellulose) 48 3.2.4. Môi trƣờng sử dụng 3.2.4.1. Môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc Sử dụng môi trường thạch malt. 3.2.4.2. Môi trƣờng nhân giống Sử dụng môi trường cám gạo. 3.2.4.3. Môi trƣờng giữ giống Sử dụng môi trường PGA. 3.2.5. Hóa chất 3.2.5.1. Hóa chất sử dụng cho môi trƣờng o (NH4)2SO4 o Glucose o Agar o Nước cất 3.2.5.2. Hóa chất sử dụng cho phƣơng pháp xác định hoạt tính o Thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) C7H4N2O7  DNS  NaOH  Muối potassium sodium tartrate tetrahydrate C4H4O6KNa o Thuốc thử antron 0.2% (gồm antron và H2SO4 đậm đặc) o Dung dịch CMC 1%  CMC  Dung dịch CH3COOH 1M  Dung dịch NaOH 1N o Dung dịch pectin 1% o Dung dịch NH3 10% o Dung dịch ZnSO4 15% o Glucose, lactose o Nước cất 3.2.5.3. Hóa chất sử dụng cho các phƣơng pháp xác định thành phần o Dung dịch HNO3 đậm đặc o Dung dịch H2SO4 đậm đặc o Dung dịch CH3COOH đậm đặc 49 o Dung dịch H2O2 30% o Dung dịch H2SO4 0,1N o Dung dịch NaOH 0,1N o Dung dịch NaOH 5% o Dung dịch CH3COOH 1N o Dung dịch HCl 5% o Dung dịch chì acetate 10% o Dung dịch Na2HPO4 bão hòa o Dung dịch CaCl2 2N o Dung dịch AgNO3 1% o Acid perchloric (HClO4) o Cồn 90o, cồn 80o o Rượu etylic 96% o Ete etylic o Thuốc thử DNS, antron o Phenolphtalein o Glucose o Nước cất 3.2.6. Thiết bị - Dụng cụ  Thiết bị o Máy đo quang phổ SPECTRO 2000RS (LaboMed,inc.) o Máy đo pH o Máy ly tâm o Máy xay o Máy cất đạm bán tự động GERHARDT (Đức) o Dụng cụ đo độ Brix Hand-held Refractometer (ATAGO) o Nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh o Tủ hút o Ống làm lạnh hồi lưu o Cân điện tử, cân phân tích o Nhiệt kế 50  Dụng cụ o Đĩa petri o Ống nghiệm o Erlen 250ml, 500ml o Becher 100ml, 500ml, 1000ml o Ống đong các loại o Bình định mức các loại o Pipette các loại o Đèn cồn, que cấy, đũa thủy tinh o Phễu lọc, giấy lọc o Bếp điện, chảo rang o Rổ nhựa, vải mùng 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phƣơng pháp vi sinh vật [22] 3.3.1.1. Phƣơng pháp cấy chuyền và giữ giống (trong điều kiện vô trùng) a. Phƣơng pháp cấy chuyền Pha chế môi trường nuôi cấy (môi trường thạch malt) Cho vào 1/3 ống nghiệm Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút Để nghiêng 45o đến khi thạch đông cứng lại Ống giống Dùng que cấy vòng đã thanh trùng cấy ria theo đường zic zắc Cho vào tủ ấm b. Phƣơng pháp giữ giống Cấy chuyền giữ giống nấm sợi từ môi trường thạch malt sang môi trường giữ giống (môi trường PGA). 51 3.3.1.2. Phƣơng pháp nhân giống (trong điều kiện vô trùng) Ống nghiệm giống Cho vào 10 ml nước cất hấp vô trùng Khuấy Cho vào môi trường cám gạo Đảo đều Cho vào tủ ấm 3.3.1.3. Phƣơng pháp cấy giống từ môi trƣờng nhân giống sang môi trƣờng chế phẩm Dùng đũa thủy tinh vô trùng trộn đều môi trường nhân giống Cho tất cả vào môi trường chế phẩm Trộn đều Cho vào tủ ấm 3.3.1.4. Phƣơng pháp lên men Cà phê sau khi ngâm nước để đạt độ ẩm cần thiết, trộn đều với chế phẩm, cho vào rổ nhựa, phủ vải mùng lên và ủ (tỉ lệ chế phẩm, thời gian ủ tùy chỉ tiêu khảo sát). 3.3.2. Phƣơng pháp hóa lý 3.3.2.1. Phƣơng pháp xác định độ ẩm Nguyên tắc Dựa trên nguyên lý làm khô mẫu ở nhiệt độ 100 – 105oC đến trọng lượng không đổi. Lượng mẫu mất khi sấy mẫu đến trọng lượng không đổi là lượng nước có trong mẫu. Phương pháp này loại trừ được các sai số do các phản ứng xảy ra khi sấy mẫu ở nhiệt độ cao. 52 Cách thực hiện Mẫu cần xác định độ ẩm Nghiền nhỏ Cân chính xác một lượng nhất định (5 – 10 g) Cho vào chén đựng mẫu (được sấy khô đến trọng lượng không đổi) Cho vào tủ sấy (100 – 105oC trong 6 – 8 giờ đến khi trọng lượng không đổi) Làm nguội trong bình hút ẩm (20 – 30 phút) Đem cân Tính kết quả 100 m mm (%)W 21 Trong đó: W: Độ ẩm của mẫu (%) m1: Trọng lượng chén và trọng lượng mẫu trước khi sấy (g) m2: Trọng lượng chén và trọng lượng mẫu sau khi sấy (g) m: Trọng lượng mẫu phân tích (g) 53 3.3.2.2. Phƣơng pháp trích chất hòa tan Phương pháp trích chất hòa tan trong cà phê sau khi lên men: 3.3.2.3. Phƣơng pháp đo kích thƣớc Dùng thước đo kỹ thuật để đo chiều ngang, chiều dài và bề dày của hạt cà phê. Cân 10 g cà phê bột Bổ sung 30 ml nước sôi Thu lấy dịch lọc Thêm 20 ml nước sôi Thu lấy dịch lọc Sấy khô Thu chất khô là chất hòa tan Đem sấy ở nhiệt độ 100 – 105oC Thu chất khô Cân trọng lượng Đo pH Đo độ hòa tan đun trên bếp cho vào tủ sấy Cho vào becher đã xác định trọng lượng 54 3.3.2.4. Phƣơng pháp nghiền Dùng máy xay để nghiền cà phê (cà phê tươi và cà phê lên men) khi cần lượng cà phê bột để nghiên cứu. 3.3.2.5. Phƣơng pháp ray Dùng lưới ray để ray những nguyên vật liệu còn tạp chất hoặc khi cần thu lượng bột mịn. 3.3.2.6. Phƣơng pháp đếm Dùng mắt thường để đếm số hạt cà phê, thu nhặt những hạt hư, hỏng và tạp chất. 3.3.2.7. Phƣơng pháp ngâm Dùng nước để ngâm cà phê, mục đích là để hạt cà phê đạt được độ ẩm cần thiết. 3.3.3. Phƣơng pháp hóa sinh 3.3.3.1. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme a. Xác định hoạt tính cellulase [14], [25] Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy phân CMC (Sodium carboxymethyl cellulose) bằng enzyme ở nhiệt độ 40oC và pH 5,0. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, lượng đường khử này sẽ phản ứng với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid). Sau đó tiến hành đo độ hấp thu OD của dung dịch đường bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. 55 Cách thực hiện Phản ứng enzyme Phản ứng thử không Thêm 1 ml dung dịch CMC vào dung dịch mẫu Lắc đều Ổn nhiệt 40 0.1oC trong 10 phút Thêm 4 ml dung dịch lactose – DNS Lắc thật kỹ Dùng nylon bịt kín miệng ống nghiệm Đặt trong nước sôi 15 phút Làm nguội bằng nước lạnh Tiến hành đo OD ( = 540 nm) (dùng nước cất làm đối chứng)  AT Thêm 4 ml dung dịch lactose – DNS vào dung dịch mẫu Lắc đều Thêm 1 ml dung dịch CMC Lắc đều Dùng nylon bịt kín miệng ống nghiệm Đặt trong nước sôi 15 phút Làm nguội bằng nước lạnh Tiến hành đo OD ( = 540 nm) (dùng nước cất làm đối chứng)  AB 1 ml dung dịch mẫu  ổn nhiệt 40 0.1 o C trong 5 phút Cơ chất CMC  ổn nhiệt tương tự 1 ml dung dịch mẫu  ổn nhiệt 40 0.1 o C trong 5 phút Cơ chất CMC  ổn nhiệt tương tự 56 Dựng đƣờng chuẩn glucose Pha dung dịch glucose 1 mg/ml bằng cách hòa tan 100 mg glucose monohydrate với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng dưới đây: Bảng 3.1: Dựng đƣờng chuẩn glucose Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dung dịch glucose 1 mg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - ml dung dịch CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - ml dung dịch lactose-DNS 4 4 4 4 4 4 4 - ml nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều các ống nghiệm này Dán nylon lên miệng ống nghiệm Đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh về nhiệt độ phòng (bằng một chậu nước lạnh) Đo độ hấp thụ OD ở bước sóng 540 nm  AG Ống số 0 là ống đối chứng  AW Tính kết quả Định nghĩa đơn vị hoạt tính Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC với vận tốc 1 mol/phút dưới các điều kiện phản ứng. 57 Tính toán  Tính hệ số glucose o Hiệu chuẩn độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn bằng hiệu số AG - AW o Dựng đồ thị đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD), trục hoành là nồng dộ glucose (mg/ml). Hệ số glucose được tính bằng công thức: WG G AA C F Trong đó: F: Hệ số glucose CG: Nồng độ dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) AG: Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn AW: Độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất o Chia nồng độ (mg/ml) cho độ hấp thu OD của mỗi dung dịch glucose chuẩn để thu được giá trị hệ số glucose, sau đó tính giá trị hệ số trung bình.  Xác định hoạt tính enzyme Hoạt tính CMCase được tính theo công thức sau: C 1 ml 1 1 phut 10 1 180 1000 F)A(A(UI/g) CMCase BT Trong đó: AT: Độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme AB: Độ hấp thu OD của phản ứng thử không F: Hệ số glucose (mg/ml) 1000: Chuyển từ mg sang g 180: Trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ g sang mol 10 phút: Thời gian phản ứng 1 ml: Thể tích dung dịch enzyme C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml) 58 b. Xác định hoạt tính pectinase [14] Sử dụng phương pháp so màu, là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định. Phương pháp so màu cho phép sai số 5%. Nguyên tắc Định lượng acid galacturonic, là sản phẩm của quá trình thủy phân pectin dưới tác dụng của pectinase không kết tủa bởi ZnSO4. Cách thực hiện 20 ml dung dịch pectin Cho vào becher 100 ml Thêm 10 ml dung dịch enzyme 1% Lắc đều Để ở nhiệt độ 30oC (nhiệt độ phòng) trong 60 phút Thêm 2 ml dung dịch ZnSO4 15% Lọc qua giấy lọc Thu dịch lọc Pha loãng 5 lần Ta có dung dịch pha loãng gọi là dung dịch (*) 59 5 ml dung dịch antron cho vào ống nghiệm Thêm 2,5 ml dung dịch (*) Lắc mạnh 10 phút Đun cách thủy 70oC trong 12 phút Làm nguội Tiến hành đo OD ở bước sóng 584 nm Tính kết quả Một đơn vị hoạt tính pectinase là lượng enzyme trong điều kiện tiêu chuẩn có khả năng xúc tác 1 g pectin thành acid galacturonic trong 60 phút. Điều kiện tiêu chuẩn: Nhiệt độ: 30oC, thời gian: 60 phút pH 3,9 – 4,1 Nồng độ pectin: 0,66% Mức độ thủy phân pectin: 30% Hoạt tính pectinase V 0,0104OD0,34 (UI) Trong đó: OD: Mật độ quang của dung dịch sau khi phản ứng với antron V: Lượng enzyme lấy tiến hành phản ứng (g hoặc ml) 3.3.3.2. Các phƣơng pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê a. Xác định hàm lƣợng cellulose [16] Nguyên tắc Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền vững của cellulose trước tác dụng của acid mạnh, kiềm mạnh, không bị thủy phân dưới tác dụng của acid yếu. Trong khi đó, các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin,… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxi hóa, phân giải và tan 60 vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitric với acid acetic. Cách thực hiện Cân 2 g mẫu cà phê đã nghiền nhỏ Sấy khô đến trọng lượng không đổi (100 – 105oC) Cho vào bình tam giác 250 ml Thêm vào bình 16,5 ml hỗn hợp 1,5 ml HNO3 đậm đặc 15 ml CH3COOH đậm đặc Đun sôi 30 phút (có làm lạnh hồi lưu) Giấy lọc Để nguội, pha loãng bằng nước nóng Sấy khô đến trọng lượng không đổi Lọc Rửa kết tủa cellulose 3 lần (10 – 15 ml nước cất nóng/lần) Rửa bằng rượu etylic 96% 2 lần (10 – 15 ml/lần) Rửa bằng ete etylic 1 lần (15 – 20 ml) Sấy giấy lọc có chứa cellulose đến trọng lượng không đổi (100 – 105oC trong 2 – 3 giờ) 61 Tính kết quả w 100a X Trong đó: X: Hàm lượng cellulose tính bằng % a: Trọng lượng cellulose (g) w: Trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) 100: Hệ số chuyển đổi thành % b. Xác định hàm lƣợng pectin (Sử dụng phương pháp Canxi pectat) [9], [16] Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa. Cách thực hiện Cân 0,15 g mẫu cà phê Thêm vào 100 ml dung dịch NaOH 0,1N Để hỗn hợp qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành acid pectic Thêm 50 ml dung dịch CH3COOH 1N 5 phút Thêm vào 50 ml dung dịch CaCl2 2N Giấy lọc không tro 1 giờ Đun sôi 5 phút Sấy khô đến trọng lượng không đổi Lọc Rửa kết tủa canxi pectate bằng nước cất nóng đến khi không còn ion Clo nữa (thử nước rửa không có kết tủa trắng bằng dung dịch AgNO3 1%) Sấy giấy lọc đến trọng lượng không đổi (100 – 105oC) Tính kết quả Hàm lượng canxi pectate được tính bằng hiệu số của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không. 62 Hàm lượng pectin được tính theo công thức sau: B 1000,92w P Trong đó: P: Hàm lượng pectin (%) W: Trọng lượng kết tủa canxi pectat (g) B: Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (g) (khoảng 0,15 g) 0,92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (pectin chiếm 92% trọng lượng canxi pectat) 100: Hệ số chuyển đổi thành % c. Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng số hòa tan [1], [9] Nguyên tắc Sự định phân này căn bản dựa trên sự phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của acid sulfuric (H2SO4). Sự chính xác của kết quả phụ thuộc vào: o Độ sạch các dụng cụ o Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H2SO4 o Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun 63 Cách thực hiện Trích đƣờng Cân 1 g mẫu cà phê đã nghiền nhỏ Cho vào becher 100 ml và thêm vào 10 ml cồn 90o Đun cách thủy cho sôi 3 lần Khuấy đều, để nguội Lọc qua giấy lọc không tro (giữ cặn, không đổ cặn lên giấy lọc) Thêm 10 ml cồn 80o vào cốc chứa cặn, khuấy đều Đun cách thủy cho sôi 2 lần Khuấy, để nguội, lọc Lặp lại 2 lần Đưa cặn lên giấy lọc và rửa sạch 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng Đun nhẹ dịch lọc trên nồi cách thủy để cồn bay hơi hết Pha loãng cặn thu được với nước cất, định mức 50 ml Để lắng 64 Thực hiện phản ứng màu Ta có thể tạo phản ứng màu của dung dịch đường với một trong những thuốc thử sau đây: phenol, orcinol hay antron. Trong đề tài này, chúng tôi chọn thuốc thử là antron. Thực hiện theo bảng dưới đây: Bảng 3.2: Bảng thực hiện phản ứng màu với antron Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Glucose mẫu 0,01% (ml) 0 0 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 5 5 4 3 2 1 0 Dung dịch đường nghiên cứu (ml) 5 5 Nồng độ đường mỗi ống (mg/ml) 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 x x Để tất cả các ống vào một nồi nước đá Thêm thật chậm 10 ml thuốc thử antronvào mỗi ống (chảy theo thành ống nghiệm) Dùng đũa thủy tinh khuấy chậm Đun sôi cách thủy đúng 7,5 phút Làm lạnh trong nước đá Khi nguội, đo OD ở bước sóng 630 nm Tính kết quả Trị số mật độ quang của những ống mẫu sau khi đã trừ đi trị số của ống thử không sẽ xác định được đường chuẩn. Với dung dịch đường cần định nồng độ, ta cũng lấy trị số mật độ quang trừ đi trị số mật độ quang của ống thử không rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra nồng độ x, từ đó tính ra % lượng đường trong mẫu. 65 d. Xác định hàm lƣợng đƣờng khử [16] Sử dụng phương pháp Acid dinitrosalicylic (DNS). Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Cách thực hiện Dựng đƣờng chuẩn glucose Pha dãy glucose chuẩn từ 0,1 – 0,8 mg/ml Cho 1 ml dung dịch glucose chuẩn vào 8 ống nghiệm Thêm 4 ml thuốc thử DNS Đun sôi 15 phút Làm lạnh về nhiệt độ phòng Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm (đối chứng là nước cất) Dựng đường chuẩn glucose (với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose) Xác định lƣợng đƣờng khử Dung dịch đường cần phân tích cũng được chuẩn bị như phần trích đường của phương pháp xác định đường tổng số. Hỗn hợp phản ứng giữa glucose với thuốc thử DNS được tiến hành như phần dựng đường chuẩn glucose (thay 1 ml dung dịch glucose chuẩn bằng 1 ml dung dịch đường cần phân tích). 66 Sau khi đo được mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm, dựa vào đường chuẩn glucose để suy ra lượng đường khử trong mẫu. e. Xác định hàm lƣợng tinh bột [16] (Sử dụng phương pháp thủy phân bằng acid) Nguyên tắc Dưới tác dụng của acid, tinh bột bị thủy phân tạo thành glucose. Xác định lượng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0,9 ta được hàm lượng tinh bột. (C6H10O5)n + nH2O  nC6H12O6 162,1 18,02 180,12 Hệ số 9,0 12,180 1,162 F Cách tiến hành Cân 200 – 250 mg mẫu (đã nghiền nhỏ và biết rõ độ ẩm) cho vào bình cầu 100 ml Thêm 50 ml nước cất, lắc đều, giữ yên 30 – 45 phút Lọc bỏ nước lọc để loại bỏ đường tan Rửa tinh bột bằng nước cất 2 – 3 lần, chọc thủng giấy lọc và dùng 25 ml dung dịch HCl 5% chuyển tinh bột vào bình cầu Lắp ống làm lạnh hồi lưu, đun cách thủy hỗn hợp 3 – 5 giờ Kiểm tra sự thủy phân hoàn toàn của tinh bột bằng dung dịch Iod Làm nguội, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 5% đến pH = 5,6 – 6,0 Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml, kết tủa protein bằng dung dịch chì acetate 10%, d