Khóa luận Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu vang từ quả dứa

h phần để được các loại vang khác nhau. Sơđồ1. Quy trình sản xuất vang 1983 – 1984 [10] Chọn lọc quả Rửa sạch quả Ngâm quả với đường (tỷ lệ 1:1) Lọc lấy dịch quả BÃ SIRO 1 BÃ + NƯỚC ÉP SIRO 2 Siro hỗn hợp Xác định đường và axit Pha chế dịch lên men Lên men chính Phối hương Bổ sung cồn và các nguyên liệu khác Lên men phụ, ngấu chín và lắng trong Gạn lọc và đóng chai Thành phẩm Ống giống Giống cấp 1 Giống cấp 2 Giống cấp 3 Sơđồ2. Quy trình sản xuất vang 1996 [10] Nguyên liệu Rửa Ngâm đường Dịch Siro Chuẩn bị dịch lên men Men giống Nhân giống Lên men chính 25-300C Lên men phụ 16-200C Lọc Tàng trữ dưới 100C Đóng chai Hoàn thiện sản phẩm Bổ sung cồn Chiết dịch thơm Dược thảo Sát khuẩn Chai rửa sạch Sơđồ3. Quy trình sản xuất vang 1997 [21] Quả tươi chín Dịch quả có 120gđường/l; pH=4,5 hấp khử trùng paster Ống men giống Chọn lọc loại bỏ quả thối Rửa sạch Men giống cấp IV Men giống cấp II Men giống cấp I Ép dịch bằng máy ép Inox Thêm nước sôi để nguội vào bã và ép lần 2 Dịch quả Dịch quả hỗn hợp Pha chế và chỉnh lý dịch lên men để có 220gđường/l; pH=4,5 Men giống cấp III Tiếp men giống (10%) Lên men chính ở 280C Làm lạnh Lọc trong Lên men phụ, tàng trữ, đóng chai Vang khô nguyên liệu Bão hoà CO2 Vang khô thành phẩm Đóng chai Lên men kiệt đường Bổ xung dịch quả hay đường và cồn thực phẩm có chất lượng cao Làm lạnh sâu Vang ga nhân tạo Lên men phụ và tàng trữ Lọc trong bão hoà thêm CO2 đóng chai Vang ga tự nhiên champagne Vang dịu thành phẩm Vang ngọt thành phẩm 1.2.9.2. Quy trình sản xuất rượu vang nước ngoài Sơ đồ4. Qui trình sản xuất vang trắng ở Mỹ [27]. Nho Làm dập Khuấy inpectic enzym Ép tách nước quả Lên men chính Lên men phụ Tàng trữ Vang thành phẩm Bổ sung axit tartaric đủ 7% Bổ sung đường đủ 200Bx Sunfit hoá bằng SO2 50¸120mg/ll Bổ sung enzym ở tỉ lệ 0,315g enzym/100g nho Giữ trong 2¸18h Bổ sung nấm men ở tỉ lệ 0,63g nấm men trên 1g nho Giữ trong 1 tháng Tách cặn, bổ sung SO2 20mg/ml Sau 2¸3 tháng tách cặn và sunfit lại vang Đảm bảo chất lượng Tách cặn Ở trong quy trình này ta thấy rằng ngay từ khi làm dập người ta bổ sung thêm axít tartatric còn trong quy trình côn g nghệ sản xuất trong nước lại không có là do khẩu vị của người dân nước ta không thích loại vang có độ chua cao . Mặt khác trong quy trình này người ta bổ sung SO2 nhiều lần là do họ sử dụng SO2 để làm trong . 1.3. KHÁI QUÁT TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VANG TẠI VIỆT NAM Rượu vang đã du nhập vào Việt Nam từ nhiều thế kỷ, thông qua nhiều con đường. Nhưng có lẽ phổ biến nhất là khi thực dân Pháp đô hộ thì rượu vang đã phát triển và phổ biến rộng rãi. Mãi tới sau này, vào những năm cuối thế kỷ 20 việc sản xuất rượu vang từ dịch quả mới thực sự bắt đầu với sự ra đời của rượu vang Thăng Long trên thị trường vào những năm 1984 mà nguyên liệu chính là quả mơ và quả dâu. Ngay sau khi có mặt trên thị trường sản phẩm đã được người tiêu dùng ưa chuộng, qua đó sản lượng của Công ty không ngừng ngày một gia tăng. Theo kết quả điều tra sơ bộ thì sản lượng của công ty vang Thăng Long và một số công ty khác trên thị trường như sau: Năm 1984: trên thị trường công ty vangThăng Long với ưu thế độc quyền và sản lượng khoảng 10.000 lít/năm. Năm1985: cũng như vậy chỉ có công ty vang Thăng Long trên thị trường với sản lượng tăng gấp 3 lần 30.000 lít/năm. Năm 1986: đã bắt đầu xuất hiện thêm một số cơ sở Hồng Hà, Gia Lâm… với tổng sản lượng ước tính 100.000 lít/năm. Trong các năm 1992-1996 dã có thêm vang của các hãng Đông Đô, Ha Ba, Hà Nội, Hoàn Kiếm, Tây Đô với sán lượng 7.000.000 lít/năm. Từ năm 1997 đến nay, đã có nhiều cơ sở tham gia vào sán xuất với chất lượng cao như Vina Wine, vang Tháp Chàm, Ninh Thuận,Vang nho (Viện nghiên cứu rượu bia nước giải khát) với sản lượng tính đến năm 1999 là 8.500.000 lít/năm [10]. Hình1.3. Sản lượng rượu vang trong nước Qua bảng số liệu trên ta thấy rằng từ năm 1986 đến năm 1996 ngành sản xuất rượu của nước ta đã tăng vọt nhưng năm 1997-1999 mức tăng đã chững lại do chất lượng rượu vang trong nước chưa đáp ứng được nhu cầu chất lượng. Nguyên liệu chủ yếu tập trung ở một số loại quả: nho, mơ, mận nhưng chủ yếu theo phương pháp lên men từ dịch đường nên về mặt chất lượng chưa đáp ứng đượcnhu cầu tiêu dùng của người dân. Bảng1.7. Thành phần một số loại quả thường được dùng để sản xuất [10 ;18 ;22] Tên quả Thành phần hóa học (g/100 g) Muối khoáng (mg/100 g) Vitamin (mg/100 g) H2O Pro tein Axít h.cơ Glu Xít Tro Ca P Fe B1 B2 PP C Nho ngọt 75.1 0.4 0.8 14.8 0.4 15.3 19.8 0.5 0.05 0.04 0.2 3 Nho ta 79.7 0.4 1.7 12.7 0.4 34.8 18.3 1.2 Dâu tằm 84.71 0.3 1.8 9.19 Dứa ta 87 0.7 1.4 13.6 0.2 9.0 10.2 0.3 0.05 0.01 0.1 1.4 Mận 85.1 0.5 1.1 3.3 0.4 23.8 17.0 0.05 0.03 0.4 3 Mơ 73.8 0.8 1.1 9.0 0.6 24.1 22.4 1.8 0.03 0.05 0.6 6 Vải 82.1 0.8 0.9 16.5 0.4 6 34 0.5 0.02 0.04 0.7 38.5 Điều đỏ 83.5 1.05 0.19 10.6 0.35 239 Điềuvàng 84.1 1.03 0.19 10.3 0.32 249 Soài 82.6 0.6 1.2 15.9 0.6 Táo mèo 76.9 1.6 0.8 11.5 Đào 87.9 0.6 0.8 9.6 Qua những số liệu so sánh với những loại quả như trên, ta thấy rằng quả dứa rất thuận lợi cho việc sản xuất rượu vang trên quy mô công nghiệp. Hàm lượng một số thành phần trong dịch quả rất cao như: hàm lượng đường, axít hữu cơ, các vitamin như C, PP, B1, B2… Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu được tiến hành như sau Chọn dứa ta chín, quả không dập nát, còn nguyên vẹn, được rửa sạch, để khô, tiến hành gọt vỏ, loại bỏ mắt dứa, ép lấy nước, loại bỏ bã bằng phương pháp lọc thô. Quá trình ép quả lấy nước được tiến hành bằng máy xay Philip (Hà lan). Dịch thu sau ép được bổ sung SO2 để tránh sự phát triển của các vi sinh vật có hại và bảo quản trong điều kiện lạnh. Dịch dứa được sử dụng làm môi trường phân lập và tuyển chọn giống nấm men, nghiên cứu một số đặc tính sinh học, điều kiện thuận lợi và ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm men. Ngoài ra, dịch dứa còn được dùng để lên men rượu vang dứa. 2.1.2. Hoá chất và thiết bị Hoá chất Na2S2O5 (Trung Quốc) HCl (Trung Quốc) NaOH (Trung Quốc) Axít acetic (Trung Quốc) Na-Alginat (Việt Nam) Canxiclorua (Việt Nam) Natriclorua (Việt Nam) KH2PO4 (Trung Quốc) Axít Tataric (Trung Quốc) Pepton (Trung Quốc) Cao nấm men (Đức) Agar (Trung Quốc) Polyme I (Anh) Polyme II (Anh) Bentonit (Mỹ) Đường saccaroza (Việt Nam) Đường Gluco (Việt Nam) Malt (Trung Quốc) MgSO4.7H2O (Trung Quốc) K3FeCN6 (Trung Quốc) KOH (Trung Quốc) Xanh metylen (Trung Quốc) Cồn tuyệt đối (Trung Quốc) Cồn 960 (Việt Nam) Thiết bị Máy ly tâm lạnh BECKMAN CALLEGRATM64Rcentrifuge (Mỹ) Máy ly tâm thường Hettich EBA20 (Đức) Máy so màu quang phổ Pharmacia Biotech Ultrospec 2000 (UV/visible Spectrophotometer) (Thuỵ Điển) Kính hiển vi điện tử Nikon eclipse E800 (Nhật Bản) Máy nuôi lắc ổn nhiệt SHELLAB 1575R (Mỹ) Nuôi ổn nhiệt Heraus (Đức) Nồi hấp khử trùng HIRAYAMA (HICLAVE HV-110) (Nhật Bản) Tủ cấy vi sinh Sanyo BIOCLEAN BENCH (Nhật Bản). Máy xác định độ ẩm METTER TOLEDO LJ16 MOISTURE ANALYZER (Thuỵ Điển) Máy phá vỡ tế bào MICROSON ULTRASONIC CELL DISRUPUR (Mỹ) Máy lọc nước siêu sạch MILI-Q MILIPOR (Mỹ) Máy đo pH Meter TOLEDO MP220 (Thuỵ Điển) Cân 4 số Meter TOLEDO A B204-S (Thuỵ Điển) Cân 3 số Sartorius BL310 (Đức) Tủ sấy dụng cụ thiết bị BINDER (Đức) Máy trộn Minishaker (Đức) Máy bơm hút chân không Milipore (Mỹ) Tủ lạnh sâu Sanyo Ultra-Low (MDF-U281AT) (Nhật Bản) Máy khuấy ARE EC (Châu Âu) Micropipet Pipetman GLSON (Pháp) Bình tam giác (Trung Quốc) Ống nghiệm (Trung Quốc) Đĩa Petri (Trung Quốc) Que trang (Trung Quốc) Pipet thuỷ tinh (Trung Quốc) … 2.1.3. Các loại môi trường được sử dụng Môi trường phân lập (môi trường Hansen) [7]. Pepton: 2 g Maltoza: 10 g (hoặc Glucoza) KH2PO4: 0,6 g MgS04.7H2O: 0,4 g Agar: 4 g Cao nấm men: 1 g H2O: 200 ml Môi trường tạo nguồn nấm men Dịch ép dứa: 1000 ml Đường tổng: 160 g/l Độ pH: 3,75 (pH dịch) Môi trường xác định khả năng lên men Dịch ép dứa: 1000 ml Đường tổng: (180; 200; 220; 260 g/l) Độ pH: 3,75 (pH dịch); 3,2 (chỉnh bằng axít tartaric) Môi trường xác định khả năng phát triển của một số chủng nấm men trên môi trường nước dứa Dịch ép dứa: 1000 ml Đường tổng: 100 g/l Độ pH: 5,0 (chỉnh bằng NaHCO3) Môi trường nhân giống Dịch ép dứa: 150ml Đường tổng: 160g/l Độ pH: 4,0 Môi trường lên men Dịch ép dứa: 100% Đường tổng: (180; 200; 220; 260 g/l) Độ pH: (3,75; 3,2) Môi trường giữ giống Pepton: 3 g Glucoza: 15 g KH2PO4: 0,9 g MgS04.7H2O: 0,6 g Agar: 6 g Cao nấm men: 0,3 g Dịch dứa: 300 ml Độ pH: 5,0 (chỉnh bằng NaHCO3) 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Các phương pháp vi sinh 2.2.1.1. Phân lập và tuyển chọn a) Tạo nguồn giống nấm men Dịch quả dứa được bổ sung hàm lượng đường tới 160 g/l. Dịch dứa được đựng trong bình tam giác 250 ml, để 2 ngày ở 300C cho nấm men phát triển [10]. b) Phân lập nấm men trên môi trường Hansen đặc Thành phần môi trường (xem phần 2.1.3). Dùng Pipet đã vô trùng hút lấy một ít dịch trong bình tam giác, pha loãng từ 10-5 – 10-7, nhỏ vào hộp Petri. Dùng que trang tran đều sao cho khi hình thành khuẩn lạc không dính liền vào nhau, thuận tiện cho quá trình sau này. Sau đó, cho các hộp Petri nuôi ở điều kiện 300C trong 2 ngày. Tiếp đó, đem hộp ra quan sát thấy hình thành lên các khuẩn lạc. Khuẩn lạc nào là nấm men phát triển tốt thì cấy vào ống thạch nghiêng [7] [10]. 2.2.1.2. Đếm số lượng tế bào nấm men Dụng cụ dùng để đếm tế bào nấm men là buồng đếm hồng cầu (buồng đếm là một phiến kính dày 75 x 32 x 4 mm, mặt kính được chia làm 3 khoảng, thường trên mặt kính cho biết các thông số: chiều sâu 0,01 hay 0,1mm; diện tích ô 1/25 mm2 hay 1/400 mm2). Cách tiến hành: đặt la men lên buồng đếm, sau đó nhỏ từ từ dịch dứa có chứa tế bào nấm men và tiến hành đếm trên kính hiển vi điện tử [7]. 2.2.1.3. Xác định tốc độ lên men: phương pháp xác định CO2 Dùng bình lên men Einhorn – Sehmidt. Lấy 10 ml dịch dứa cho vào bình đã được thanh trùng, bổ sung vào bình 0,1-0,5g nấm men tuỳ thuộc vào độ ẩm của nấm men. Để bình ở nhiệt độ 300C, quan sát tới khi lượng CO2 tạo được đẩy lượng dịch xuống tới 5 ml (lượng CO2 tạo ra) thì ghi thời gian [7; 10]. 2.2.1.4. Xác định hoạt lực lên men Phương pháp được tiến hành như sau: lấy 225 ml dịch dứa được bổ sung các nồng độ đường khác nhau. Sau đó, bổ sung nấm men từ 106 – 108 tế bào. Đặt bình trong điều kiện nhiệt độ khác nhau và cho lên men trong thời gian khác nhau. Xác định hàm lượng cồn, so sánh hoạt lực của các chủng [2]. Dựa vào lượng CO2 thoát ra nhiều hay ít sẽ xác định được chủng nấm men có hoạt lực lên men mạnh hơn. 2.2.1.5. Xác định khả năng kết lắng Dịch nuôi cấy sinh khối nấm men được ly tâm lạnh với tốc độ 3000 vòng/phút trong 20 phút và rửa lại bằng nước cất siêu lọc, sau đó được lấy ra hoà tan trong dung dịch đệm axetat ở pH = 1,5 ; cho dịch sau hoà tan vào các ống nghiệm. Cho các ống nghiệm vào máy lắc ở tốc độ 220 vòng/ phút trong thời gian 3-5 phút sau đó để yên 15 phút. Quan sát và tiến hành đo chiều cao của lớp kết lắng trong ống nghiệm, ống nào có chiều cao kết lắng cao nhất thì chủng nấm men đó có khả năng kết lắng tốt nhất [10]. 2.2.2. Phương pháp hoá học 2.2.2.1. Xác định độ ẩm Lấy 1g quả dứa cho vào máy sấy hồng ngoại (máy xác định hàm ẩm) nhãn hiệu LJ16 của Mettler Toledo (Thuỵ Sĩ ), chọn các thông số nhiệt độ, thời gian, công thức tính. Chờ cho tới khi máy xác định xong, ghi số liệu hiện trên màn hình. 2.2.2.2. Xác định axit tổng số (tính theo axít Citric) Cách tiến hành: lấy 25 ml dịch dứa cho vào bình tam giác 250, sau đó bổ sung thêm 2 ml KBr 30%, 6 ml H2SO4 tỷ lệ 1:1, sau đó cho từng giọt KMnO4 5% vào bình tam giác lắc đều tới khi thấy kết tủa màu nâu ở đáy bình thì thêm 5ml Fe2(SO4)3 5%, để yên từ 6-8 giờ, sau đó đem lọc kết tủa, rửa lại bằng nước cất, đo thể tích nước lọc và nước rửa (V1). Chuyển cả giấy lọc và kết tủa vào bình tam giác sau đó cho vào 10 ml NaOH 10%; 15 ml C2H5OH 90%. Đậy bằng nút cao su có gắn ống sinh hàn, đun cách thuỷ trong 60 phút, sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh. Cho vào bình 10 ml HNO3 6N; 10 ml AgNO3 0,1N; thêm vào 2 ml Fe2(SO4)3 5% sau đó chuẩn độ bằng AgNO3 dư bằng NH4CNS 0,1 N đến khi xuất hiện màu đỏ. Kết quả được tính theo công thức [4; 23] X = 0,4238 [ (NAgNO3 x V AgNO3 _ N NH4CNS x V NH4CNS) x 0,0905 + 0,017 x V1 /1000] x 100/V Trong đó: 0,4238 là hệ số chuyển từ pentabromaxeton ra axít Citric NAgNO3 ; V AgNO3 là nồng độ đương lượng, thể tích AgNO3 dùng N NH4CNS ; V NH4CNS là nồng độ đương lượng, thể tích NH4CNS dùng 0,0905 là lượng pentabromaxeton ứng với 1ml AgNO3 0,1N (g) 0,017 là độ tan của pentabromaxeton trong nước (g/l) V1: thể tích nước lọc và nước rửa kết tủa pentabromaxeton (ml) V: thể tích dung dịch mẫu thử (ml) 100: hệ số chuyển thành phần trăm 2.2.2.3. Xác định hàm lượng đường tổng và đường khử a) Xác định đường tổng Xử lý mẫu dịch dứa: trung hoà axít trong dứa bằng NaOH 10%, kiểm tra bằng giấy quỳ đến pH = 7, sau đó thêm 8 ml dung dịch (CH3COO)2Pb 30%, để yên trong 5 phút, tiếp tục thêm 16 ml Na2HPO4 , sau đó kiểm tra xem còn chì dư không bằng cách cho Na2SO4 nếu không thấy vẩn đục thì đem lọc. Thuỷ phân dịch lọc bằng cách lấy 50 ml dịch lọc + 5 ml HCl 25% cho vào bình tam giác 250 ml. Gắn ống sinh hàn, đun sôi 10 phút sau đó làm nguội dưới vòi nước lạnh rồi trung hoà bằng NaOH 10%, sử dụng chất chỉ thị Phenolphtalein, chuyển vào bình định mức 100 ml. Có nhiều phương pháp để xác định dịch sau thuỷ phân nhưng tôi chọn phương pháp Ferixianua vì phương pháp này tiến hành nhanh và cho kết quả chính xác [4] [23]. Cơ sở của phương pháp: Dung dịch Ferixyanua trong môi trường kiềm, dưới tác dụng của nhiệt độ cao giải phóng ra oxy nguyên tử: 2 K3Fe (CN)6 + 2 KOH ® 2 K4Fe(CN)6 + H2O + O Ôxy nguyên tử ôxy hoá đường thành axít: CH2OH(CHOH)4CHO + O ® COOH(CHOH)4COOH Phương trình tổng quát: 2 K3Fe(CN)6 + 4 KOH + CH2OH(CHOH)4CHO = 2 K4Fe(CN)6 + COOH(CHOH)4COOH + H2O Phản ứng thực hiện khi đun nóng với chỉ thị xanhmetylen. Kết thúc định phân khi xanhmetylen chuyển từ xanh sang tím hồng rồi vàng da cam. Cách tiến hành :lấy 20 ml K3Fe(CN)6 1% và 5 ml KOH 2,5N + 2 – 3 giọt Xanhmetylen 1% sau đó cho lên bếp đun sôi thì chuẩn bằng dịch đã được thuỷ phân cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, ghi số ml dịch đã thuỷ phân tiêu tốn. Hàm lượng đường được tính theo công thức sau: Co = a/b ´ 1000 g/l ( hàm lượng đường dịch pha loãng ) a : lượng đường glucoza chứa trong b ml dịch pha loãng tương ứng với 20 ml ferixyanua, g. C = Co ´ n ( hàm lượng đường trong dịch ). n: hệ số pha loãng. b) Xác định đường khử Lượng đường khử có trong dịch được tiến hành bằng phương pháp Ferixianua như trên (nhưng khi xác định đường khử không phải xử lý dịch). 2.2.2.4. Xác định độ cồn trong rượu bằng phương pháp trưng cất Tách rượu khỏi các chất hoà tan bằng con đường chưng cất. Đo tỷ trọng của dung dịch rượu bằng tỷ trọng kế, hiệu chỉnh nhiệt độ và xác định độ cồn của rượu [24]. 2.2.2.5. Xác định pectin bằng canxi pectat Trong quả pectin tồn tại ở dạng protopectin, pectin hoà tan bị phân giải bởi kiềm loãng và enzym pectaza. Khi bị thuỷ phân pectin sẽ chuyển thành metylic và axít pectic. Axít pectic dễ dàng bị kết tủa ở dạng canxi pectat. Đây là cơ sở của phương pháp xác định hàm lượng pectin trong dịch quả [4]. Lấy 20 ml dịch dứa sau đó cho thêm vào 100 ml NaOH 0.1 N. Để yên hỗn hợp qua đêm rồi sau đó thêm 50 ml dung dịch axít axetíc 1 N và 5 phút sau thêm 50 ml CaCl2 tiếp tục để yên trong 1 giờ đem đi đun sôi 5 phút. Tiến hành lọc và đem đi sấy khô bằng máy sấy hồng ngoại. Kết quả tính theo công thức: X = Trong đó X: Hàm lượng pectin ( % ) a: Khối lượng pectatcanxi V: Dung tích bình định mức thứ nhất (ml ) V1: Thể tích dung dịch lấy để thuỷ phân bằng axít clohydric (ml). V2: Dung tích bình định mức thứ hai ( ml ) V3: Thể tích dung dịch lấy để xà phòng hoá và kết tủa pectat G: Khối kượng canxi trong kết tủa pectat 100: Chuyển thành phần trăm . 2.2.2.6. Xác định dextrin bằng phương pháp kết tủa với cồn Phương pháp dựa vào tính chất dextrin kết tủa hoàn toàn trong cồn cao độ [4]. Cách tiến hành: Lấy 10 ml dịch cho thêm 30 ml etylic tuyệt đối lắc đều để yên. Đem lọc lấy kết tủa, tiến hành xác định khối lượng bằn cân hồng ngoại. Kết quả tính theo công thức: Trong đó: X: %dextrin trong mẫu a: Trọng lượng của kết tủa tính bằng (g) b: Trọng lượng giấy lọc tính bằng (g) V: Thể tích định mức (ml) V1: Thể tích lấy xác định G: Trọng lượng mẫu cân 2.2.3. Phương pháp cố định tế bào nấm men Một trong các phương pháp được sử dụng để cố định tế bào nấm men có hiệu quả là dùng polyme có trong rong biển như Agarose, Na-Alginat… Cách tiến hành: Nhân giống thu sinh khối nấm men (cách tiến hành thu sinh khối được thực hiện như trong phần nhân giống ở trên sau đó nhân giống thu sinh khối nấm men bằng máy ly tâm lạnh ở 3000 vòng/phút trong thời gian 20 phút chú ý nấm men phải được rửa lại bằng nước muối sinh lý 2-3 lần). Sau đó, trộn đều dung dịch Na-Alginat với dung dịch tế bào men rượu (10-30 g trọng lượng khô của tế bào trong 100 ml). Dùng Pipet đường kính ra là 3 mm, từ độ cao 20 cm, nhỏ giọt hỗn hợp này vào dung dịch CaCl2 0,2M. Cứ 100 ml hỗn hợp cần 1lít dung dịch CaCl2. Sau đó để yên các hạt Canxi Alginat có tế bào nấm men trong dung dịch CaCl2 với thời gian 20 phút để tạo ra sự phân bố đều. Khi nhỏ giọt hỗn hợp dung dịch Na-Alginat chứa tế bào nấm men rượu ở độ cao 20 cm trên bề mặt dung dịch CaCl2, do trọng lượng của giọt dung dịch đã tạo ra sự tiếp xúc bề mặt giữa Na-Alginat và CaCl2, khi đó xảy ra phản ứng sau: 2nC5H704COONa + nCaCl2 ® n(C5H704COO)2Ca + 2nNaCl Do tác dụng tương tác này đã tạo nên màng Canxi Alginat không tan ở thể gel bao quanh các tế bào men rượu. Khi cho các hạt gel này vào môi trường có Glucoza, quá trình lên men rượu sẽ được tiến hành. Khả năng và tốc độ lên men rượu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ dung dịch đường, loại Na-Alginat sử dụng ban đầu để tạo gel, loại nấm men, các thành phần khác của môi trường, tốc độ khuyếch tán của đường Glucoza vào trong hạt gel và sản phẩm từ hạt gel đi ra môi trường, nhiệt độ lên men, pH môi trường và thời gian lên men…. Sau quá trình lên men hạt gel chứa tế bào nấm men sẽ được hoạt hoá và sử dụng lại [25]. 2.2.4. Xác định tanin Tính chất của tanin ( chủ yếu là polyphenol ) có thể tan được trong este sunfuric có trọng lượng phân tử 320 ¸ 360, nên xác định tanin thông qua phản ứng ôxy hoá tanin với pecmanganat và chỉ thị màu indigocacmin. Hàm kượng tanin có trong dung dịch được tính theo công thức [4]: X = Trong đó: X: Hàm lượng tanin có trong dung dịch ( % ). a: Thể tích dung dịch KMnO4 0.1 N chuẩn mẫu thử (ml) b: Thể tích dung dịch KMnO4 chuẩn mẫu trắng ( ml ) V2: Dung tích bình đựng nước chứa mẫu thử V1: Thể tích dung dịch quả (ml ) 2.2.5. Xác định Nitơ tổng số bằng phương pháp Kenđan (kjeldahl) Nitơ tổng số là tổng các chất nitơ ở dạng hữu cơ và vô cơ trong thực phẩm Các bước tiến hành [4]: Các prôtêin có trong thực phẩm được vô cơ hoá bằng H2SO4 đậm đặc với xúc tác là CuSO4, Hg, Se, KMnO4... dùng K2SO4 đẩy nhanh quá trình vô cơ hoá để tạo ra amôniắc, sau đó amôniắc sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4. Dùng NaOH đẩy NH3 ra khỏi (NH4)2SO4 và lượng NH3 sẽ được hấp thụ bởi H2SO4. Căn cứ vào lượng H2SO4 đã hấp thụ NH3 thoát ra để xác định lượng NH3 và tính được lượng nitơ tổng số. Từ lượng nitơ tổng số tính ra lượng prôtêin theo biểu thức: X = N ´ 6,25 (%) Trong đó: X: Hàm lượng prôtêin (%) N: Lượng nitơ tổng số (%) 6,25: Hệ số qui đổi 2.2.6. Phương pháp làm trong Xử lý nhiệt độ thấp bằng tủ lạnh National (8 - 100C) Tạo phức chất không hòa tan để lắng (chất trợ lắng bentonid) [10]. Dùng các hạt polyme tích điện trái dấu với các prôtêin để hấp phụ làm trong. 2.2.7. Đo mật độ tế bào bằng máy so quang phổ ở bước sóng OD660 Lấy dịch thí nghiệm cần phân tích pha loãng ở khoảng đo được < 2 sau đó tiến hành ghi chỉ số [6]. 2.2.8. Phương pháp toán học [10] Tính trung bình tổng thể. M = Trong đó: M: Trung bình tổng thể Xi: Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ thứ 1 ¸ n n: Số lần thí nghiệm Tính hiệu xuất lên men [18]: Cồn tạo thành (g/l) Hiệu xuất lên men (%) = Đường tổng (g/l) - Đường sót (g/l) Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ DỊCH QUẢ DỨA 3.1.1. Nghiên cứu dịch quả Quả dứa được chọn ngẫu nhiên sau đó đem đi rửa sạch, loại bỏ vỏ, mắt dứa sau đó được tiến hành lọc qua cho bớt cặn và đem đi phân tích. Chúng tôi đã tiến hành một số thí nghiệm để phân tích như xác định đờng tổng bằng phương pháp Ferixyanua, axít tổng số tính theo axít citric, xác định pectin bằng canxi pectat,dextrin bằng phương pháp kết tủa với cồn và một số phương pháp khác. Quá trình tiến hành cụ thể được tôi trình bày ở phần 2.2(phương pháp nghiê cứu). Bảng3.1. Thành phần hóa học của dịch lên men (được lấy từ quả dứa ta) STT Thành phần hóa học Đơn vị Mẫu quả dứa ta Chín hoàn toàn Chín 1/3 -2/3 1 Chất khô tổng số Bx 17 16 2 Đường tổng g/l 145.2 ± 0.2 136.8 ± 0.3 3 Đường khử g/l 72.6 ± 0.2 56.8 ± 0.3 4 Axít tổng(citric) g/l 5.1 ± 0.01 5.4 ± 0.01 5 Tanin g/l 0.92 ± 0.02 0.96 ± 0.02 6 Pectin g/l 0.41 ± 0.01 0.54 ± 0.01 7 Dextrin g/l 0.26 ± 0.02 0.29 ± 0.02 8 Nước % 79 ± 5 76 ± 4 9 pH 3.71 ± 0.05 3.70 ± 0.05 Nhận xét: Qua bảng trên ta nhận thấy hàm lượng đường trong quả dứa khá cao, hàm lượng đường tổng là 145 g/l. Trong đó, đường khử chiếm tới 72.6 g/l nên rất thuận tiện cho quá trình lên men rượu. Ngoài ra, lượng nước và pH của dịch dứa khá ổn định nên quá trình lên men cũng thuận lợi. Tuy nhiên, trong quả dứa còn chứa nhiều axít, tanin, pectin làm cho rượu thành phẩm có vị chua, độ cảm quan chưa được như ý. Do vậy, phải tìm cách loại bớt độ chua cũng như làm tăng mức cảm quan của rượu thành phẩm. Ngoài những lý do trên thì dứa là loại quả thích hợp cho sản xuất rượu vang tươi có chất lượng cao. Kết quả nghiên cứu được chúng tôi thực hiện vào tháng 01 và 02 là thời điểm không đúng vào vụ thu hoạch dứa, vì vậy kết quả có sự khác biệt về một số thành phần so với nghiên cứu được trình bày như trong bảng 1.7. Ví dụ: hàm lượng nước có thể thấp hơn khoảng 8%, lượng axít cao hơn, lượng đường thấp hơn và một số thành phần khác. 3.1.2. Xử lý dịch lên men Trong dịch dứa trước lên men hàm lượng pectin và lượng vi sinh vật là khá lớn, để có thể thu được rượu vang thành phẩm có chất lượng cao chúng ta phải nghiên cứu loại bỏ bớt những thành phần này. Tuy nhiên, do điều kiện thí nghiệm cũng như thời gian không cho phép nên chúng tôi chỉ nghiên cứu xử lý dịch lên men để loại bỏ những loại vi sinh vật có mặt trong dịch quả. Việc xử lý dịch lên men có nhiều phương pháp: xử lý dịch bằng phương pháp thanh trùng, sục khí SO2 hay dùng hóa chất như Na2S2O5 hoặc K2S2O5 để tạo ra SO2 dưới dạng tự do. Nhưng trong công nghiệp, người ta có khuynh hướng sử dụng SO2 bằng hóa chất vì dễ kiểm soát được liều lượng và các yếu tố khác [33; 36]. Từ kết quả nghiên cứu của một số công trình cho thấy: Dùng SO2 ở dạng Na2S2O5 hoặc K2S2O5 với hàm lượng từ 0.15ữ0.3 g/l đủ để ức chế hoạt động của nhiều loại vi khuẩn mà không ảnh hưởng đến sự sinh sản và phát triển của nhiều loại nấm men [10]. Qua quá trình tiến hành làm thử nghiệm kết hợp với các tài liệu về lượng SO2 bổ sung trong dịch quả chúng tôi đã tiến hành xử lý dịch dứa trước khi lên men bằng cách bổ sung Na2S2O5 ở hàm lượng 0.2 g/l với thời gian 2 - 10 giờ trước khi cho vào lên men. Khi tiến hành nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy khoảng thời gian xử lý SO2 càng dài thì khả năng diệt khuẩn càng cao. Đặc biệt trong vòng 7 – 9 giờ, khả năng tạp nhiễm gần như không có. 3.2. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG DỨA 3.2.1. Chỉ tiêu cơ bản để tuyển chọn chủng nấm men Nấm men là yếu tố quan trọng trong sản xuất vang vì nó ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng của rượu trong toàn bộ quy trình công nghệ. Chọn được chủng nấm men đáp ứng được nhu cầu công nghệ cũng như tạo ra được sản phẩm có chất lượng là yếu tố hết sức quan trọng trong quá trình sản xuất. Để sản xuất được rượu vang từ dịch dứa nguyên chất thì chủng nấm men được lựa chọn phải đáp ứng được những yêu cầu cơ bản sau: Lên men được ở nồng độ đường cao và độ pH thấp Hiệu suất lên men cao, thời gian lên men ngắn Có khả năng kết lắng trong sản phẩm tốt Tạo được hương vị đặc trưng Ổn định trong sản xuất và bảo quản 3.2.2. Xác định khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm men Chúng tôi sử dụng các chủng nấm men thuần chủng trong bộ sưu tập nấm men tại “Phòng nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học enzym, prôtêin và kỹ thuật gen Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm” nhà C10, Đại học Bách Khoa Hà Nội và một số chủng của “Viện nghiên cứu rượu bia và nước giải khát”. Các chủng nấm men được sử dụng là: NHV, VL, RHN1, RHN2, H2, 28, LV7, SLS. Các chủng này được tôi họat