Khóa luận Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định marker liên kết tính kháng bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa Cayenne (Ananas comosus) bằng phương pháp RAPD

giá trị bằng nửa khoảng cách giữa hai OTU; sau đó, cặp đơn vị tiến hóa này đƣợc xem nhƣ một OTU mới và khoảng cách giữa OTU mới này với một OTU khác là trung bình khoảng cách giữa OTU đó với OTU còn lại trong nhóm. Thuật toán tiếp tục 12 nhóm các OTU có khoảng cách nhỏ nhất cho đến khi chỉ còn có hai OTU . Sau cùng là tạo một cây tiến hóa có gốc . Để đánh giá độ chính xác của cây phân loài thì phƣơng pháp thông dụng nhất là dựng bootstrap. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là thay đổi các thông số của ma trận khoảng cách để tạo ra nhiều ma trận khoảng cách khác có cùng kích thƣớc với ma trận gốc. Mỗi một ma trận tạo ra sẽ lập thành một cây phát sinh loài. Độ tin cậy của 1 phân nhóm đƣợc đánh giá dựa vào mức độ lập lại của phân nhóm đó. 2.4. Một số nghiên cứu ứng dụng marker phân tử trong phân tích đa dạng di truyền dứa trên Thế Giới và Việt Nam [4] 2.4.1. Nghiên cứu trên Thế Giới Hiện nay, nhu cầu sản lƣợng dứa trên thế giới dùng cho chế biến ngày càng tăng đòi hỏi các nhà chọn giống phải tạo ra những giống có chất lƣợng phù hợp với nhu cầu thị trƣờng. Vì thế, nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền trên dứa đã đƣợc thực hiện và thành công với sự đóng góp của các loại marker (chỉ thị) phân tử nhằm cung cấp những thông tin về di truyền để chọn giống chính xác hơn. Những thành công đƣợc thể hiện qua những nghiên cứu sau: Nghiên cứu sự đa dạng di truyền dứa bằng marker AFLP ( Cecilia Y. Kato và ctv, 1992). Sự đa dạng di truyền đƣợc tiến hành trên 70 giống dứa (Ananas comosus L) và 3 họ có liên quan (Ananas ananassoidies, Ananas bracteatus và Ananas erctifolius). Kết quả cho thấy việc lai khác loài giữa A. comonus và A. ananassoidies với mức tƣơng quan của A. comonus (0,398) và A.ananassoidies (0,381). Qua đó cho thấy sự khác biệt di truyền trong số các giống dứa phần lớn có thể do đột biến. Phân tích đa dạng di truyền phân tử dứa bằng marker RFLP (Duval và ctv, 2001) đã cho thấy đƣợc sự giống nhau giữa Ananas comosus và Pseudananas comosus là 58,7% qua sử dụng 18 probe tƣơng đồng để lai. Xác định đặc tính của phôi dứa (Ananas spp) bằng marker AFLP: 40 giống (dòng) dứa đƣợc thu thập và xác định mức độ đa hình giữa các giống, đặc tính của chúng. Sự phân nhóm di truyền đã chỉ rõ mối liên quan giữa các nhóm và sự khác 13 biệt với các loài hoang dại. Sự khác biệt này do tự bản thân giống hoặc do yếu tố môi trƣờng, tỷ lệ đột biến và sự khác biệt dòng soma. Xác định độ tin cậy kiểu gene của cây dứa vi nhân giống liên quan đến marker isozyme và RAPD (Sergio Feuse và ctv, 2003). Đánh giá sự liên quan di truyền của giống dứa Ananas và Pseudananas bằng marker RAPD (Claudete de Fátima Ruas1và ctv, 2001). 2.4.2. Nghiên cứu ở Việt Nam Ở nƣớc ta, hiện nay đã có một số viện nghiên cứu và các trƣờng đại học đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gene bằng các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ RAPD, AFLP, SSR… Tuy số lƣợng của các nghiên cứu này chƣa nhiều nhƣng đã cho thấy chúng ta có khả năng thực hiện những nghiên cứu sử dụng công nghệ tiên tiến nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống, vật nuôi, cây trồng. Dƣới đây là một số nghiên cứu đã ứng dụng thành công trên dứa nhƣ: Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống (dòng) dứa bằng phƣơng pháp RAPD (Hoàng Thị Bích Thuỷ và Bùi Văn Lệ, 2004). Kết quả nghiên cứu này đã phân nhóm đƣợc 7 giống (dòng) qua sử dụng 9 loại primer đã xác định đƣợc các quần thể Trung Quốc 220 và Trung Quốc 250; Đắc Lắc và Thái Lan có cùng nguồn gốc và quần thể dứa Lâm Đồng và Đắc Lắc; Lâm Đồng và Thái Lan là các quần thể xa nhau về mặt nguồn gốc. “Nghiên cứu đa dạng nguồn gene dứa Cayenne bằng phƣơng pháp marker phân tử” (Lê Thị Thanh Tuyền và Nguyễn Thị Lang, 2004). 13 primer RAPD (10 nucleotide) đƣợc sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của 50 dòng dứa Cayenne ở đồng bằng Sông Cửu Long (Long Định và viện lúa ĐBSCL). Bên cạnh phân tích bằng sinh học phân tử đề tài còn tiến hành đánh giá đa dạng nguồn gene dựa vào dữ liệu kiểu hình với các chỉ tiêu sau: Chiều cao cây, chiều rộng cây, chiều dài lá, chiều rộng lá, số lá, ngày trổ hoa, trọng lƣợng trái, hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở một số vị trí trên lá nhƣ ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá. Kết quả: Phân nhóm di truyền của 50 giống Cayenne dựa trên dữ liệu sản phẩm PCR - RAPD phân thành 3 nhóm chính, với khoảng cách 14 phân nhóm là 0,66. Nhóm I gồm 20 dòng dứa, nhóm II gồm 3 dòng và nhóm III là 27 dòng, trong mỗi nhóm đều chứa những dòng dứa có nguồn gốc nhập ngoại và nhập nội. Sự tƣơng đồng về di truyền giữa nhóm I hoặc nhóm II với nhóm III là 49 % và nhóm I với nhóm II là 63%; trong cùng một nhóm thì nhóm III có mức tƣơng đồng về di truyền cao nhất 71%. Khoảng cách di truyền giữa 50 dòng dứa Cayenne qua phân nhóm dao động từ 0,27 – 1,0 với những dòng dứa đƣợc trồng từ dạng nuôi cấy mô có sự tƣơng đồng về di truyền cao nhất. Bên cạnh đồng bằng Sông Cửu Long, nơi cung cấp dứa có chất lƣợng thì Tp. Hồ Chí Minh cũng là vùng dứa lớn. Để phát triển tốt hơn ngành dứa ở vùng này thì điều trƣớc tiên là phải đánh giá về đa dạng di truyền nguồn dứa để phục vụ công tác chọn giống và lai giống. 2.5. Bệnh héo do virus [1] Bệnh héo đỏ đầu lá hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới. Theo Sether D.M. và Hu J.S. (2002), bệnh đã xuất hiện ở Mỹ, Đài Loan, Singapore, Brazil, Jamaica, Philippines, Venezuela, Thái lan, Malaysia và cả ở Việt Nam. Đây là bệnh rất nguy hiểm và ảnh hƣởng lớn đến nghề trồng dứa. Không nhƣ các bệnh khác trên dứa do vi khuẩn, nấm hay tuyến trùng đều có các loại thuốc phòng trị đặc hiệu, bệnh héo đỏ đầu lá cho đến nay vẫn chƣa có biện pháp phòng trừ triệt để ngoài việc hạn chế sự lây lan là diệt môi giới truyền bệnh (Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2001). Bệnh do virus PMWaV gây ra. Virus đƣợc bảo tồn và lan truyền sang đời sau chủ yếu qua chồi giống và tàn dƣ của cây bệnh. Những chồi giống mang mầm bệnh lại thƣờng chỉ biểu hiện triệu chứng vào giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa trở đi, tức là sau một thời gian trồng rất dài (9 - 12 tháng). Chính đặc điểm này của bệnh héo đỏ đầu lá đã gây nên những thiệt hại kinh tế to lớn cho ngƣời trồng dứa (Borroto E.G. và cs, 1998). 15 2.5.1. Lịch sử phát hiện virus PMWaV [14] [12] [16] [17] Trong những năm 1920, ngƣời trồng dứa ở Hawaii nhận thấy có nhiều kiến trong các vùng trồng dứa bị bệnh. Họ cho rằng kiến là nguyên nhân gây bệnh và tìm cách tiêu diệt kiến để bảo vệ vƣờn dứa. Illingworth (1931) đã chứng minh rằng kiến không phải là nguyên nhân gây bệnh mà rệp sáp mới là nguyên nhân gây bệnh. Carter (1939) báo cáo rằng nƣớc bọt của rệp sáp gây độc cho dứa dựa trên các quan sát sau : Bệnh xảy ra khi có 1 lƣợng lớn rệp hiện diện trên dứa; có mối quan hệ bằng thực nghiệm giữa số lƣợng rệp, thời gian rệp tồn tại trên dứa với cừơng độ bệnh; cây phục hồi khi rệp bị diệt. Carter và Schmidt (1935) thực hiện thí nghiệm xác định số lƣợng rệp tối thiểu để gây bệnh héo đỏ đầu lá. Tuy nhiên tỉ lệ mắc bệnh lại không khác biệt có ý nghĩa giữa lô chỉ thả 1 rệp với lô đối chứng không có rệp, do lô chỉ thả 1 rệp chỉ có vài cây biểu hiện bệnh. Carter kết luận 1 rệp cũng có thể gậy bệnh và bệnh có thời gian ủ bệnh có thể tới 2 tháng. Gunasinghe và German (1989), Maramorosch và cộng sự (1984), Ullman và cộng sự (1989) đã phân lập đƣợc 1 loại closterovirus hình que trên các cây dứa có và không có triệu chứng bệnh và gọi là Pineapple Mealybug Wilt-associated Virus (PMWaV). Hu và cộng sự (1996) phát hiện PMWaV trên rệp thu từ các cây dứa bệnh mà không phát hiện PMWaV trên rệp thu từ bí đỏ. Các nghiên cứu này đã chứng minh đƣợc PMWaV là nguyên nhân chính gậy ra bệnh héo đỏ đầu là trên dứa. Melzer và cộng sự (2001) đã phát hiện có ít nhất 2 loại PMWaV (PMWaV-1, PMWaV-2) gây bệnh trên dứa. Sether và Hu (2002) chứng minh rằng bệnh chỉ biểu hiện triệu chứng khi có sự xâm nhiễm của rệp sáp và virus PMWaV-2, bệnh không biểu hiện triệu chứng khi không có rệp hoặc cây có rệp mà chỉ nhiễm PMWaV-1. Sether, Hu, Melzer, Busto và Zee (2004) thực hiện RT-PCR với primer thoái hóa cho protein HSP-70 đã phát hiện thêm 2 loại PMWaV là PMWaV-3 và PMWaV-4. Nhƣ vậy cho đến nay đã phát hiện đƣợc 4 loại PMWaV trên dứa có biểu hiện triệu 16 chứng bệnh nhƣng chỉ có PMWaV-2 gây biểu hiện triệu chứng theo nghiên cứu của Sether và Hu (2002). 2.5.2. Tác nhân lây truyền bệnh [1] [19] [20] PMWaV-1 và PMWaV-2 đƣợc truyền bởi 2 loại rệp sáp: Dysmicoccus brevipes (rệp màu hồng) và D. neobrepes (rệp màu xám) (Sether và Hu, 1997; Sether và cộng sự, 1998). Hình 2.2 Rệp sáp hồng (Dysmicoccus brevipes) và rệp sáp xám (D. neobrepes) (Nguồn: Rệp sáp D. neobrevipes sinh sản hửu tính. Không đẻ trứng, trứng nở trong cơ thể con mẹ và ấu trùng chui ra từ con mẹ gọi là crawler. Giai đoạn crawler là giai đoạn phát tán chính. Crawler di chuyển trong khoảng thời gian ngắn không quá 1 ngày và có thể di chuyển hàng trăm mét nhờ gió. Con cái trải qua 3 lần lột xác trƣớc khi thành thục. Các giai đoạn ấu trùng của con cái kéo dài 11–23 ngày, 6–20 ngày và 7–28 ngày theo thứ tự. Tổng thời kì ấu trùng của con cái khoảng 26–52 ngày. Trong thời kỳ ấu trùng rệp chỉ ăn trong giai đoạn 1 và 2. Khi con cái trƣởng thành có 1 khoảng thời gian 25 ngày trƣớc khi nó sinh lứa con đầu tiên. Trong khoảng thời gian này con cái giao phối với con đực. Con cái sau đó sinh trong khoảng 30 ngày và chết sau 4 ngày ngừng sinh sản. Mỗi con cái có thể sinh 350 con nhƣng có thể lên tới 1000 con. Con cái không đƣợc giao phối sống trung bình 148 ngày, trong khi con cái đƣợc giao phối sống trung bình 95 ngày. Con đực lột xác 4 lần trƣớc khi mọc cánh (trƣởng thành); mỗi giai đoạn ấu trùng kéo dài 11–19 ngày, 7–19 ngày, 2–7 ngày và 2–8 ngày theo thứ tự. Tổng thời 17 gian giai đoạn ấu trùng là 22–53 ngày. Con đực chỉ ăn trong giai đoạn 1 và 2. Các lần lột xác xảy ra trong kén sáp trong khoảng thời gian là 12 ngày. Khi ra khỏi kén thì con đực trƣởng thành chỉ dài 1 mm với 1 đôi cánh màng và không có vòi chích hút (mouthparts). Con đực trƣởng thành sống đƣợc khoảng 3-7 ngày. Con đực có vòng đời khoảng 59–117 ngày. Rệp sáp Dysmicoccus brevipes có các đặc điểm sinh học tƣơng tự nhƣ rệp sáp Dysmicoccus neobrevipes: Giai đoạn ấu trùng của con cái trải qua 3 giai đoạn lần lƣợt là 10; 6,7 và 7,9 ngày. Giai đoạn ấu trùng của con đực gồm 4 giai đoạn 9,9; 5,8; 2,5 và 3,7 ngày. Giai đoạn từ ấu trùng đến thành trùng khoảng 24 ngày (cả đực và cái). Thành trùng cái sống trong khoảng từ 17- 49 ngày, trong khi đó thành trùng đực chỉ sống đƣợc 1-3 ngày. Thành trùng cái đẻ từ 19-137 con, trong tự nhiên tỷ lệ đực cái là 1:1. Rệp sáp D. brevipes Có 2 kiểu sinh sản: Đơn tính và lƣỡng tính. Kiểu sinh sản đơn tính tìm thấy ở Hawaii, ở đây chỉ có con cái đƣợc sinh ra và không cần con đực thụ tinh. Còn ở Brazil có cả 2 dạng sinh sản đơn tính và lƣỡng tính. Ở nƣớc ta Rệp xuất hiện nhiều vào các tháng có ẩm độ không khí 70-80%, nhiệt độ thấp 15-20oC. Rệp tập trung ở gốc dứa, phần ngầm dƣới đất và sát trên mặt đất. Vào tháng 5-9 rệp thƣờng bò trên lá, quả, chồi ở trên cao. Rệp sáp bám vào các lá non, vào gốc lá già, vào mắt quả, vào rễ cây để hút dịch cây làm cây sinh trƣởng kém, lá vàng và khô. Trong khi chích hút nhựa chúng thải ra chất đƣờng mật hấp dẫn kiến và nấm bồ hóng làm cho cây kém phát triển trầm trọng. Khi cây dứa suy kiệt (gần hết nhựa) thì kiến lại tha rệp đến cây khác. Ngoài ra Kiến còn ăn một số động vật là kẻ thù tự nhiên của rệp nên có thể xem rệp và kiến có sự cộng sinh với nhau. Rệp thực chất không chứa virus, chúng sống trên cây dứa nhiễm PMWaV và thu đƣợc virus. Rệp tiếp thu và truyền virus trong suốt quá trình dinh dƣỡng. Không có ký chủ khác của virus đƣợc tìm thấy ngoài cây dứa mặc dù nhiều loài cỏ cũng là ký chủ của 2 loại rệp này. Điều đó cho thấy cây dứa nhiễm PMWaV là nguồn chứa virus duy nhất cho rệp truyền sang cây khác. 18 2.5.3. Triệu chứng [1] Theo Sether D. M. và cộng sự (1998), biểu hiện triệu chứng bệnh rất thất thƣờng và có quan hệ với thời tiết, mật độ rệp sáp và hệ gene của dứa. Theo Nguyễn Văn Kế (2002), bệnh biểu hiện đầu tiên trên các lá già nhất, sau đó đến các lá già và các lá bên trên. Dứa bị bệnh thì lá bị đỏ đầu, các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trƣơng nƣớc, rìa lá cuốn về phía lƣng, đầu lá cong xuống đất, hóa nâu và khô dần. Rễ ở những cây bị nhiễm bệnh cũng bị hƣ hoại, khi nhổ lên thì thấy phần vỏ rễ tuột ra khỏi phần lõi nhƣ một cái ống. Tùy theo giống từ khi cây bị nhiễm bệnh tới khi biểu hiện triệu chứng mất từ 2 tuần đến 6 tháng. Nhiều cây con bị nhiễm trong vƣờn ƣơm không có dấu hiệu bệnh, sau một thời gian trồng mới biểu hiện. Hình 2.3 Cây dứa bệnh và không bệnh héo đỏ đầu lá a: Dứa không bệnh; b: dứa bệnh Bệnh héo đỏ đầu lá thƣờng trải qua 4 giai đoạn phát triển: Xâm nhiễm: Biểu hiện bệnh là chóp lá có màu đỏ. Lây lan: Lá chuyển từ màu đỏ sang hồng, mép phiến lá uốn cong về phía mặt dƣới. Héo lá: Các lá bị bệnh khô dần, lá ở nõn vẫn mọc bình thƣờng. Gây chết cây. 19 Hình 2.4 Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá Trong chu kì của thực vật, giai đoạn cây đang phân hóa mầm hoa và sau đó một chút là lúc cây dễ nhiễm bệnh nhất. Hậu quả là quả bị nhỏ, chua, khô, mắt lộ rõ, không có giá trị thƣơng phẩm (Trần Thế Tục - Vũ Mạnh Hải, 2001). 2.5.4. Cách phòng trị [1] [20] Để phòng trừ bệnh héo đỏ đầu lá, theo Nguyễn Văn Kế (2000), cần áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp nhƣ: Chọn giống kháng bệnh. Lấy giống từ vùng ít bệnh. Xử lý vật liệu trồng bằng thuốc trừ rệp sáp. Trƣớc khi trồng, khử đất để trừ kiến và các ổ rệp. Vệ sinh đồng ruộng để khỏi lây lan vụ sau. Trong quá trình dứa phát triển cần theo dõi phun thuốc trừ rệp, kiến. Hiện nay trên thế giới biện pháp sinh học đã đƣợc áp dụng khá phổ biến và tỏ ra hữu hiệu để phòng trị rệp sáp trên dứa. Các loài thiên địch sau đây đã đƣợc du nhập và Hawaii để phòng trị rệp sáp: Các loài kí sinh bao gồm Aenasius cariocus Compere, Aenasius colombiensis Compere, Anagyrus ananatis Gahan, Euryhopauus propinquus Kerrich, Hambletonia pseudococcina Compere và Ptomastidae abnormis (Girault). Động vật ăn thịt bao gồm Cryptolaemus montrouzieri Mulsant, Lobodiplosis pseudococci Felt, Nephus bilucernarius Mulsant, Scymnus (Pullus) unicatus Sicard và Scymnus pictus Gorham. Tuy nhiên các loài này sẽ không hiệu quả nếu có sự hiện diện của kiến công sinh. 20 Hình 2.5 Bọ rùa Cryptolaemus montrouzieri [10] a: Ấu trùng; b: Bọ rùa trƣởng thành Hình 2.6 Ong bắp cày Anagyrus ananatis [10] 2.6. Marker liên kết tính kháng bệnh trên thực vật. 2.6.1. Tính kháng bệnh trên thực vật [2] Cây thể hiện tính kháng đối với ký sinh gây bệnh là do chúng mang các đặc tính phân loại khác với nhóm ký chủ của ký sinh gây bệnh, hoặc là cây chứa các gene kháng mà ký sinh không có gene tƣơng ứng để phá vỡ. Hiện tƣợng từ kháng trở thành nhiễm của cây trồng đối với vi sinh vật gây bệnh là do số lƣợng khác nhau của gene kháng hiện diện ở mỗi giống và ảnh hƣởng của gene kháng đối với ký 21 sinh. Trƣờng hợp giống nhiễm nặng đối với vi sinh vật gây bệnh là do không có gene kháng một cách hiệu quả chống lại nòi gây bệnh đó. Nhƣ vậy, sự kháng bệnh của cây trồng là do gene điều khiển. Một số giống cây trồng có thể có tính kháng đơn gene hoặc đa gene tuỳ theo số gene đối kháng với một đối tƣợng bệnh cây mà nó có. 1.1.1.1 2.6.1.1. Kháng bệnh đơn gene (monogenic resistance) Tính kháng bệnh đơn gene thƣờng do một gene có tính trội điều khiển hoặc có thể do một vài gene điều khiển nhƣng các gene này định vị rất gần nhau và liên kết với nhau rất chặt chẽ. Các gene kháng này có tính chuyên biệt cao đối với một dòng sinh lý của mầm bệnh. Do đó các giống có tính kháng đơn gene thƣờng kháng rất mạnh đối với dòng sinh lý của mầm bệnh tƣơng ứng. Tuy nhiên, khi gặp dòng sinh lý khác của mầm bệnh, các giống này trở thành nhiễm bệnh và nhiễm nặng. Sử dụng thƣờng xuyên giống kháng đơn gene rất dễ dẫn đến sự chuyển đổi dòng sinh lý mới của mầm bệnh và tấn công đƣợc giống này. 1.1.1.2 2.6.1.2. Kháng bệnh đa gene (polygenic resistance) hay QTL kháng Tính kháng bệnh của nhóm này đƣợc biểu hiện bởi nhiều gene. Các gene kháng này có thể có gene trội lẫn gene lặn và định vị trên các loci có tính số lƣợng (QTL). Do có nhiều gene kháng nên các giống trong nhóm này có thể kháng với nhiều dòng sinh lý khác nhau của mầm bệnh. Nhờ đó, tính kháng của giống thƣờng bền hơn, lâu bị phá vỡ hơn nhóm giống kháng đơn gene. Tuy nhiên, tính kháng của nhóm này thƣờng không mạnh bằng nhóm kháng đơn gene. Các giống kháng đa gene thƣờng gây phiền phức cho các nhà lai tạo giống do có nhiều gene kháng và có cả gene lặn nên phân ly rất phức tạp và khó chọn lọc về sau. 1.1.2 2.6.2. Xác định marker phân tử liên kết gene kháng bệnh ở thực vật Hiện nay rất nhiều marker phân tử cho tính kháng bệnh ở thực vật đã đƣợc xác định dựa vào phƣơng pháp PCR hay lai phân tử. Có marker liên kết với các gene 22 kháng bệnh chuyên biệt và cũng có marker liên kết với QTL kháng. Mặc dù hầu hết những marker gắn với QTL còn cách biệt quá xa với nhau, chƣa đủ sức dự đoán chính xác cho một chƣơng trình chọn lọc giống hiệu quả nhƣng các marker phân tử này cũng đã đóng góp to lớn trong việc chọn lọc các giống cây trồng có khả năng kháng bệnh. 2.6.3. Một số nghiên cứu phát hiện marker phân tử cho tính kháng bệnh trên thực vật bằng kỹ thuật RAPD B. Moury và ctv (2000) đã sử dụng 250 primer RAPD phân tích 153 cá thể F2 của tổ hợp lai PI195301(mẩn cảm)xPI152225(kháng bệnh) đã xác định đƣợc 4 maker liên kết tính kháng bệnh héo đốm do virus trên tiêu (OPAC10-593bp, OPAH13-800bp, OPAF16-250bp, OPB01-750bp) [9]. Xác định maker liên kết tính kháng bệnh nấm vảy ở lúa mì (Guihong YU và ctv, 2003) [13]: Dùng 520 primer RAPD phân tích quần thể F7 của tổ hợp lai Ning894037 (kháng)xAlondra (mẩn cảm), Guihong đã xác định đƣợc 3 primer S1384, S1360, S1319 khuếch đại 4 band (640bp, 600bp, 350bp, 820bp) liên kết với tính kháng bệnh nầm vảy ở lúa mì. Marker phân tử liên kết gene Vbj kháng bệnh nấm vảy trên táo bắt nguồn từ táo dại Malus baccata jackii (M Gygax và ctv, 2004) [15]: Quần thể 173 cá thể F2 từ tổ hợp lai A722-7× cv. Golden Delicious (A×GD) (Giống A722-7 mang gene Vbj kháng bệnh mấm vảy, còn giống Golden Delicious là giống mẩn cảm) đƣợc chọn ra 10 cây kháng và 10 cây bêṇh. Dùng 506 primer RAPD (10 nucleotide) để thƣc̣ hiêṇ phản ứng PCR cho 20 cây này. M.Gygax và ctv đã xác định đƣợc 3 primer RAPD là: OPB08, OPK08, OP123 khuếch đại các band 710bp, 848bp, 869bp có hiện diện trong nhóm kháng và mẹ A722-7(có gene Vbj) nhƣng không hiện diện trong nhóm mẩn cảm và bố GD. Phân tích 173 cây con F2 của AxGD thì thấy 3 marker đã liên kết với gene Vbj có tần số liên kết là 16,2% - 22%. Các nghiên cứu trong nƣớc chỉ dừng lại ở việc sử dụng các marker phân tử có sẵn để chọn giống. Tuy nhiên trong các nghiên cứu này thƣờng không dùng marker RAPD mà dùng các marker nhƣ SSR, RFLP, STS do marker RAPD không ổn định. Marker RAPD chỉ đƣợc ứng dụng trong nghiên cứu xác định các loại marker khác thông qua bảng đồ di truyền. 23 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đánh giá đa dạng di truyền của các giống dứa Cayenne tại Tp. Hồ Chí Minh 3.1.1. Thời gian và địa điểm Tiến hành từ tháng 2/2007 tới tháng 7/2007 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật (Viện Công nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng, Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh). 3.1.2. Đối tƣợng Các cây dứa Cayenne thuộc 3 giống Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng sạch bệnh virus đƣợc tạo bằng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (kết hợp xử lý nhiệt) cung cấp bởi Bộ môn CNSH (Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh). 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị Găng tay (Malaysia). Máy ly tâm 14.000 vòng/phút (Hettich, Đức). Tủ sấy (Anh). Tủ ủ mẫu (Anh). Tủ – 20oC (Sanyo, Nhật). Nồi hấp autoclave (Nhật). Máy điện di (Biorad, Thụy Điển và Cosmo Bio Co, Nhật). Máy vortex (Đức). Tủ hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam / Anh). Máy chụp gel (Biorad, Thụy Điển). Giếng, lƣợc đổ gel. Máy PCR PTC Thermocycle 100. Máy quang phổ UV – VIS. Cuvette. 24 3.1.4. Hóa chất  Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số từ lá dứa Dung dịch phenol:chloroform:isoamylalcohol (PCI) (25 : 24 : 1). Dung dịch isopropanol lạnh. Ethanol 96 % và ethanol 70 %. Dịch tách chiết CTAB (2% CTAB, 1,4M NaCl, 100 mM Tris – HCl pH 8, 20mM EDTA, 0,1% Mercaptoethanol). Dung dịch TE 1X (1M Tris – HCl, 0,5M EDTA). Nƣớc cất siêu sạch khử ion. Hóa chất dùng cho kiểm tra DNA Agarose (BioRad). Ethidium bromide. Loading dye. Nƣớc cất 2 lần. Dung dịch TAE 0,5X (Tris acetat 40mM, EDTA 0,1mM, pH 8,0). Ladder 0,1 – 3 kb (Biorad). Dung dịch TE 1X (1M Tris – HCl, 0,5M EDTA).  Hóa chất dùng cho phản ứng PCR-RAPD Bộ GoTaq polymerase (Promega) gồm: Taq polymerase, MgCl2 và Taq buffer. dNTPs mix (Promega). 32 Primer (10 nucleotide) (Promega). Nƣớc (cất 2 lần rồi khử ion, hấp, chiếu tia UV). 3.1.5. Phƣơng pháp tiến hành 3.1.5.1. Ly trích DNA tổng số từ lá dứa Chọn những cây dứa khỏe. Lấy khoảng 3-4 lá non, không lấy lá già, cắt bỏ phần ngọn, lau sạch rồi cho vào túi nilon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu và giữ mát trong thùng đá. Sau đó mẫu đƣợc đem giữ ở tủ –20oC tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 25 Thực hiện ly trích theo quy trình của Dolye có cải tiến (1990). Nghiền 0,5 g lá trong nitơ lỏng, cho bột mịn vào eppendorf 1,5 ml. Thêm 1 ml dung dic̣h CTAB đa ̃đƣơc̣ đun nóng ở 650C. Mâũ đƣơc̣ ủ trong 1 giờ ở 650C. Ly tâm, chuyển phần dịch qua eppendorf mới. Sau đó thêm vào 500 μl phenol/chloroform/isoamilalcohol (25:24:1), lắc nhẹ và đều. Ly tâm trong 15 phút ở 11.000 vòng/phút. Hút dịch nổi và tủa DNA bằng cách thêm vào isopropanol, để ở 40C trong 15 – 30 phút . Rửa lại DNA bằng ethanol 700. Ly tâm và để khô. Sau đó hòa trong dung dịch TE 1X. Bảo quản mẫu ở -200C.  Đánh giá kết quả bằng điện di DNA tổng số sau khi ly trích sẽ đƣợc đánh giá định tính bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau khi điện di, gel sẽ đƣợc ngâm trong dung dịch ethidium bromide trong 10 phút sau đó đƣợc đƣợc chụp bằng máy chụp gel. Cách tiến hành: Pha dung dịch TAE 0,5X. Pha gel agarose với nồng độ 1% (15 ml cho gel 6 và 8 giếng, 30ml cho gel 12 và 17 giếng). Đun bằng lò Viba 2 phút cho agarose tan thật đều. Để nguội đến 50-550C, đổ vào khuôn, cài lƣợc vào. Chờ 30 phút để agarose đông. Gở lƣợc ra rồi đặt bảng gel vào buồn điện di. Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 1 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút. Nhuộm ethidium bromide khoảng 10 phút (có mang bao tay). Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có DNA thì band DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm 26 nhạt của band điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. Nếu địên di kiểm tra kết quả RAPD thì pha gel 2 % và điện di ở điều kiện 50 V, 400 A trong 60 phút.  Đánh giá kết quả bằng phƣơng pháp đo mật độ quang Ngƣời ta tính tỉ lệ OD260/OD280 để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì dung dịch acid nucleic đƣợc xem là sạch. Khi mẫu có lẩn protein hay phenol thì tỉ lệ này sẽ thấp hơn và mẫu DNA không đạt yêu cầu để thực hiện RAPD. Một cách tổng quát, hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức: Hàm lƣợng DNA (ng/µl) = [(62,9*OD260)-(36*OD280)] * Độ pha loãng Phƣơng pháp tính gần đúng hàm lƣợng DNA bằng OD: Xây dựng đƣờng chuẩn: dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần với dung dịch TE 1X: hút 20 µl dung dịch DNA hòa tan với 1,980 ml TE 1X). Tiến hành đo OD ở 2 bƣớc sóng OD260, OD280. Đối với một dung dịch DNA sợi đôi, sự hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm tăng lên khi phân tử DNA bị biến tính tức là khi hai sợi tách rời nhau. Ngƣời ta gọi đó là hiệu quả siêu sắc (hyperchromic effect). Sau khi đo OD các mẫu DNA tổng số đƣợc pha loãng về nồng độ 50ng/μl để thực hiện phản ứng RAPD. Đây là nồng độ đƣợc cho là tối ƣu cho phản ứng RAPD. 3.1.5.2. Tối ƣu hoá phản ứng RAPD Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ Taq polymerase Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 27 Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong tối ƣu hoá nồng độ Taq polymerase Hoá chất Nồng độ Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 PCR buffer dNTPs Primer Mg 2+ Taq polymerase DNA mẫu Nƣớc cất 1X 0,2 mM 1 pm/ l 3 mM 0,5 U 50 ng Thêm vào cho đủ 25 l 1X 0,2 mM 1 pm/ l