Khóa luận Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayene bằng phương pháp market phân tử

dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ stock Nồng độ Thể tích Tris (pH 8.0) 1 M 10 mM 0,5ml EDTA 0,5 M 0,5 mM O,1ml Nước cất 49,4ml Tổng cộng 50,0ml 3.2.2.2. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện điện di trên gel agarose - Máy điện di loại nằm ngang (Gibco BRL model 4001 - Life technologies) - Máy chụp hình gel bằng tia UV - Agarose (Mỹ) - Dung dịch TAE 50X Bảng 3.4: Thành phần dung dịch TAE 50X Thành phần Thể tích 1 lít Tris base 2M 242 g Glacial acetic acid 57,1 ml EDTA 0,5 M, pH 8.0 100 ml - Ethidium bromide - DNA ladder làm thang chuẩn - DNA loading buffer 24 Bảng 3.5: Thành phần dung dịch loading buffer Thành phần Thể tích Tris 1 M (pH=8.0) 0,5 M Glycerol 5,0 ml EDTA 0,5 M (pH=8.0) 100 l Xylen Cyanol 0,2 % 15 mg Bromophenol blue 0,2 % 15 mg Nước cất 4,5 ml Tổng cộng 50 ml 3.2.2.3. Dụng cụ và hóa chất để thực hiện phản ứng chuỗi PCR - Máy thermal cycler (Biorad) - Mẫu DNA ly trích - Dung dịch stock của dNTPs (5 mM). - Dung dịch stock của PCR buffer (10X). Bảng 3.6: Thành phần dung dịch đệm PCR 10X Thành phần Nồng độ Nồng độ cuối Thể tích Tris (pH 8.3) 1 M 200 mM 1,0 ml KCl 1 M 500 mM 2,5 ml MgCl2 150 mM 15 mM 0,5 ml Gelatin 0,01 % 0,5 ml Nước cất 1,0 ml Tổng cộng 5,0 ml - Primer: 13 primer được sử dụng để khảo sát tính đa dạng di truyền của dứa có kích thước 10 nucleotide từ các bộ kit của hãng Operon tổng hợp từ Nhật, pha dung dịch kit tại Viện Lúa ĐBSCL. - Taq polymerase tổng hợp : sản xuất tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long . 25 3.3. Phƣơng Pháp 3.3.1. Đánh giá kiểu hình Tập đoàn 50 dòng dứa Cayenne được trồng trong đều kiện tự nhiên, không xử lý ra hoa và tiến hành đo các đặc tính nông học trong cùng thời gian ở giai đoạn các cây trưởng thành và bắt đầu cho hoa. Thí nghiệm được bố trí ngẩu nhiên hai lần lập lại, cách đo được tiến hành như sau: - Chiều cao cây (cm) đo từ mặt đất đến đỉnh của lá. - Chiều rộng cây (cm) đo khoảng cách lá vươn rộng ra hai bên. - Chiều dài lá (cm) đo ngẫu nhiên 3 lá trên / 1 cây, chiều rộng lá đo phần rộng của lá. - Số lá: thiết lập đo và điếm từng lá trên một cây. - Ngày trổ hoa: tính từ ngày trồng cho đến khi cây có hoa và nhú trái. - Trọng lượng trái (kg) đo lúc trái được thu hoạch. - Quan sát hình dạng lá có gai, không gai hay lá viền (chỉ có gai một phần hoặc ở một số vị trí trên lá như ngọn, gốc hoặc giữa lá) và màu sắc lá ghi nhận ở những mức độ màu khác nhau. Phân tích số liệu thu thập thông qua phần mềm IRRISTAT vesion 3.0 và sau đó phân tích nhóm dựa vào chương trình NTSYS (Numercial Taxonomy System) version 2.1. Để phân tích nhóm dựa vào số liệu (numercial classficatory analysis), ta sử dụng hệ số CORR (Pearson product-moment correlation coefficient) như là đơn vị để tính sự tương quan giữa các dòng dứa dựa vào tính trạng hình thái và giá trị CORR được tính toán theo Sneath và Sokal (1973). Dựa trên ma trận tương quan (Correlation matrix), sơ đồ hình cây thể hiện mối tương quan được xây dựng theo phương pháp UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average), một trong những mô hình phân tích nhóm SAHN (sequential, agglom-erative, hierarchic, non- overlapping) (Sneath và Sokal, 1973). 3.3.2. Đánh giá kiểu gen 3.3.2.1. Tách chiết DNA DNA của dứa được tách chiết theo quy trình CTAB (Cetultrimethylammonium bromide) cải tiến (Nguyễn Thị Lang, 2002). Phương pháp này đặc biệt ổn định cho ly trích DNA từ mô thực vật giàu polysaccharide (Sun và ctv, 1994), cho DNA chất 26 lượng cao, tốn nhiều thời gian nhưng rẻ tiền hơn so với nhiều phương pháp khác (Henry T Nguyen, 1998). Quy trình gồm những bước sau: - Bước 1: Chọn và thu mẫu lá dứa (50 mẫu), chọn lá khỏe, non (2 cm) đặt vào ống tube và ghi nhãn cẩn thận. Ống tube chứa mẫu được giữ trong thùng đá lạnh. - Bước 2: Lá sẽ được rửa sạch, cắt nhỏ và đặt vào đĩa (spot test plate). - Bước 3:Thêm vào đĩa 660 µl dung dịch đệm ly trích DNA (DNA extraction buffer) (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM EDTA, 500 mM NaCl ). Nghiền các mô lá với chài (dụng cụ này phải được khử trùng bằng cồn và lau sạch trước khi sử dụng). - Bước 4: Tiếp tục nghiền đến khi dung dịch có màu xanh đó là dấu hiệu tế bào bị phá vỡ và phóng thích diệp lục. Dung dịch nghiền xong phải đặt vào đá khoảng 30 phút. - Bước 5: Thêm vào 660 l dung dịch tách chiết, trộn đều và chuyển 660 l dịch nghiền vào một tube sạch với thể tích là 1,5 – 2 ml đã được ghi nhãn cẩn thận. - Bước 6: Thêm 40 l SDS 20 % trộn đều và khéo léo, sau đó ủ trong water bath và lắc đều 10 phút ở nhiệt độ 650C. - Bước 7: Thêm vào dung dịch 100 l NaCl 5M và trộn thật kỹ. Thêm tiếp 100 l CTAB. Ủ dung dịch 10 phút ở nhiệt dộ 650C. - Bước 8: Thêm 900 l Chlorofom: iso amylalcohol (24:1) trộn đều và đem ly tâm trong 3 phút với tốc độ 13.000 vòng / phút. - Bước 9: Chuyển dịch nổi vào một tube mới 1,5 – 2 ml và thêm vào 600 l isopropanol trộn đều, tiếp tục ly tâm trong 5 phút với tốc độ 12000 vòng / phút. Sau khi ly tâm, đổ bỏ phần dung dịch phía trên. - Bước 10: Rửa phần kết tủa còn lại với cồn 70 % và phơi khô. - Bước11: Hòa tan DNA với 50 l TE . Giữ ở nhiệt độ -200C. 3.3.2.2. Kiểm tra chất lƣợng DNA Kiểm tra chất lượng DNA đã ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0.8 % trong dung dịch TAE 1X. Nhuộm gel với Ethidium bromide và chụp hình qua hệ thống gel document.  Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA - Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di. 27 - Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X - Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu quá trình đun mất nhiều nước thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ nồng độ yêu cầu. - Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều. Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch agarose xuống còn 550C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lược. Chiều dày gel khoảng 5 mm là thích hợp (Nguyễn Thị Lang, 1999). - Sau khi gel cứng, di chuyển lược ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí.  Tiến hành chạy điện di - Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể tích khoảng 2 l). Cho thêm 10 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều. Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di. - Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 100 mA, định thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng). - Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia UV. Chú ý thao tác này phải thật cẩn thận bởi hoá chất nhuộm rất độc, dễ gây ung thư. 3.3.2.3. Tiến hành PCR cho phản ứng RAPD  Trộn dung dịch PCR Cho các thành phần dung dịch sau vào các tube PCR đã được đánh mã số: - DNA 1,0 l (tuỳ thuộc vào nồng độ DNA). - Dung dịch đệm PCR 10X 2,0 l. - dNTP 2,0 l. - Primer cần sử dụng trong mỗi phản ứng 1,0 l. - Taq polymerase 0,5 l. - Thêm nước cất 2 lần cho đủ 20,0 l. Trộn đều, thêm giọt dầu (mineral oil) để tránh bay hơi, đậy nắp tube lại và cho vào máy PCR đã cài sẳn chu trình nhiệt. 28 Bảng 3.7: Thành phần hỗn hợp dung dịch chạy PCR Thành phần Nồng độ Nồng độ sau cùng Thể tích ( l) PCR buffer 10X 1X 2 dNTP 1 mM 100 M 2 Primer 5 M 0,25 M 1 Taq polymerase 5 unit / l 0,1 unit / l 0,5 DNA 25 ng / l 1,25 ng / l 1 H2O 13.5 Tổng cộng 20,0  Chạy chương trình PCR Sau khi lấy đủ các thành phần vào tube PCR, ta tiến hành chạy phản ứng với các bước tiến hành (Nguyễn Thị Lang, 2002) như sau: - Bước 1: Làm biến tính DNA ban đầu ở 940C trong 5 phút. - Bước 2: Biến tính DNA tiếp theo ở 940C trong 30 giây - Bước 3: Tiến hành lai primer và DNA ở 370C trong 30 giây - Bước 4: Tổng hợp ở 720C trong 1 phút. - Bước 5: Lặp lại bước 2 - 4 trong 36 lần. - Bước 6: Tổng hợp lần cuối ở 720C trong 5 phút. - Bước 7: Giữ lạnh ở 40C. Bảng 3.8: Chƣơng trình chạy PCR cho RAPD marker Chƣơng trình Kiểu Giai đoạn1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Số chu kì Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian 1 Chu kỳ 940C 5 phút 1 2 94 0 C 30 giây 370C 30 giây 720C 1 phút 35-36 3 72 0 C 5 phút 1 4 4 0 C 29  Kiểm tra và phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1.5 % Hút 10 l sản phẩm PCR và tiến hành chạy điện di trên gel agarose 1.5 % để kiểm tra sản phẩm. Trong khi cho sản phẩm PCR vào, ta nên để lại một giếng trên bản gel để nạp DNA ladder vào với số lượng là 3 l. Phương pháp tiến hành giống như kiểm tra sản phẩm DNA . Sản phẩm PCR sau khi điện di sẽ được chụp trên hệ thống gel document, những băng DNA có khuếch đại sẽ hiện lên trên bản gel nhờ nhuộm với ethiumbromide. Ta sẽ ghi nhận lại những băng DNA và đem xử lý trên chương trình NTSYSpc. 3.3.2.4. Phân tích dữ liệu PCR bằng phần mềm NTSYSpc (Rolfh) Phân tích đa dạng nguồn gen theo phần mềm NTSYSpc là chương trình phần mềm do Rohlf (1992) thiết kế dùng để tìm kiếm và thành lập kiến trúc những dữ liệu có nhiều biến. NTSYS (Numercial Taxonomy System) là hệ thống phân loại số trong nghiên cứu đa dạng quần thể ở mức độ DNA, dựa vào kết quả từ phương pháp in dấu vân tay DNA (DNA fingerpringting). Các băng được nhập vào chương trình theo quy tắc: nếu không có băng DNA sẽ ghi 0, nếu có băng ghi 1. Số liệu này sẽ được sử dụng để xây ma trận tương đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và được xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979): Sxy=2 xy / x + y - Xy: số băng giữa hai mẫu. - X: số băng của mẫu x. - Y: Số băng của mẫu y. - Sxy: Hệ số tương đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính được khoảng cách di truyền giữa x và y Dxy= 1 - Sxy Trên cơ sở toán học này, các nhà toán học đã xây dựng các phần mềm WINDIST và NTSYS cho máy tính. Chương trình WINDIST tạo ra ma trận tương đồng từ bộ dữ liệu nhập sẵn. Chương trình NTSYS version 2.1 tạo ra sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu (Kangle Zheng và ctv, 30 1995). Hiện nay 2 chương trình WINDIST và NTSYS được gộp lại thành chương trình package-NTSYS để tiện dụng hơn.  Cách nhập số liệu Dữ liệu thu được từ sản phẩm PCR sẽ nhập vào excell theo những qui định chung. Nếu như sản phẩm có băng hiện diện thì ta sẽ nhập là 1 và 0 nếu không hiện diện băng. Sau khi nhập số liệu, ở hàng đầu tiên chúng ta ký hiệu là 1 (đối với ma trận hình chữ nhật), cột thứ hai ghi số hàng, cột thứ ba ghi số cột, và cột thứ tư ghi số 0 nếu không có số liệu thiếu. Sau đó, bản số liệu trong excell sẽ được dùng để xây dựng ma trận tương đồng trong phần mềm NTSYS-pc version 2.1. 3.3.3. Ƣớc đoán độ chính xác giữa phân nhóm di truyền dựa vào dữ liệu kiểu hình và kiểu gen Độ chính xác trong phân nhóm dựa trên kiểu hình và kiểu gen được đánh giá thông qua kiểm tra ManTel (Mantel, 1967) với phương pháp Mxcomp (Matrix comparison) từ chương trình xử lý NTSYSpc version 2.1. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đánh giá đa dạng nguồn gen dựa vào dữ liệu kiểu hình Qua quan sát và ghi nhận những đặc tính nông học bao gồm chiều cao cây, chiều rộng tán, chiều rộng lá, chiều dài lá, số lá trên bụi, hình dạng lá, màu sắc lá, thời gian trổ hoa và năng suất trái của tập đoàn dứa Cayenne với 50 dòng khác nhau về đều kiện địa lý đã cho thấy sự đa dạng về kiểu hình giữa các dòng dứa trong cùng một giống với nhau. Những số liệu thu nhận được từ những chỉ tiêu hình thái đều khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa 1 % (phụ lục I). Độ đa hình giữa các nhóm trong giống được đánh giá theo phân tích nhiều biến (Multivariate analysis) và phân tích phân biệt (Discriminant analysis). Kết quả phân tích này được trình bày trong bảng 4.1, trong đó chỉ tiêu ngày trổ hoa và năng suất chỉ tính trên những dòng cho trái và thu hoạch trái vào thời điểm khảo sát. 31 Bảng 4.1: Đặc tính nông học của 50 dòng dứa từ Cayenne Tên dòng Cao cây (cm) Rộng tán (cm) Dài lá (cm) Rộng lá (cm) Số lá / bụi Tg trổ hoa (tháng) Năng suất (kg) OMK5 101ab 104 ab 71 a 4,6 ab 62 abc 16 1,2 OMK12 109 a-g 102,5 a 81,5 g-j 4,8 a-e 61,5 ab 17 3.2 OMK19 102 abc 102,5 a 80,5 e-j 4,75 a-d 62,5 a-d 15 1.1 OMK10 105.5 a-e 104 ab 82,5 hij 5,7 b-h 61 a Chưa trổ 0 OMK17 103.5 a-d 107,5 abc 82 gj 5 a-f 65 a-f Chưa trổ 0 OMK2 116.5 fgh 102,5 a 72,5 a-d 5,45 a-g 61,5 ab Chưa trổ 0 OMK7 118 h 105 ab 74 a-f 5,6 a-g 64 a-e Chưa trổ 0 OMK15 101 ab 108,5 a-d 71,5 ab 5,2 a-g 63 a-d Chưa trổ 0 OMK29 102 abc 104 ab 72 abc 5,1 a-f 64 a-e Chưa trổ 0 OMK18 100.5 a 107,5 abc 72,5 a-d 4,75 a-d 73,5 ij 16 2,4 OMK20 106 a-e 103 a 76 a-i 5,5 a-g 63 a-d 15 2.1 OMK4 105 a-e 105,5 ab 72 abc 5,45 a-g 61 a Chưa trổ 0 OMK11 108 a-f 103 a 82,5 hij 5,65 a-h 61 a 16 1.9 OMK1 101.5 ab 112 a-e 73,5 a-e 4,7 abc 66,5 a-h 16 1.1 OMK8 102.5 abc 102,5 a 72,5 a-d 5,25 a-g 62,5 a-d 16 2.5 OMK9 109 a-g 109 a-d 77,5 a-j 5,75 c-h 66 a-g 16 3 OMK3 103 a-d 119 d-h 73 a-d 5,55 a-g 68,5 c-i 16 1,3 OMK59 110 b-h 110 a-d 81 f-j 5,35 a-g 67,5 a-i 15 2.2 OMK16 103 a-d 112 a-e 72,5 a-d 4,6 ab 61,5 ab 17 1.3 OMK44 112 d-h 113,5 a-g 76 a-i 5,5 a-g 63 a-d 15 2.3 OMK48 114 e-h 102,5 a 71,5 ab 5,3 a-g 65,5 a-g 15 2 OMK42 111c-h 122,5 e-h 81 f-j 5,4 a-g 66,5 a-h 15 2.9 OMK43 103 a-d 109 a-d 77 a-j 5,6 a-g 62,5 a-d 16 1.6 OMK45 105 a-e 108 a-d 71,5 ab 4,95 a-f 76,5 j 17 2.6 OMK6 103 a-d 108,5 a-d 74 a-f 5,5 a-g 64 a-e Chưa trổ 0 OMK47 102.5 abc 105,5 ab 71,5 ab 4,55 a 63,5 a-d Chưa trổ 0 OMK52 104.5 a-d 105 ab 84 j 5,45 a-g 67,5 a-i Chưa trổ 0 OMK49 103.5 a-d 122,5 e-h 83,5 j 6,25 gh 62,5 a-d Chưa trổ 0 OMK50 107.5 a-e 107 ab 76 a-i 5,2 a-g 66,5 a-h Chưa trổ 0 OMK51 111 c-h 107,5 abc 70,5 a 5,55 a-g 65 a-f Chưa trổ 0 OMK61 101.5 ab 103 a 79,5 d-j 5,7 b-h 68 b-i Chưa trổ 0 OMK66 100.5 a 124 gh 74 a-f 5,1 a-f 71 f-j Chưa trổ 0 OMK67 107 a-e 122,5 e-h 77,5 a-j 6 fgh 71,5 f-j 17 2.85 OMK64 102 abc 123 fgh 71,5 ab 6 fgh 64 a-e Chưa trổ 0 OMK65 106 a-e 112,5 a-f 75 a-g 5,25 a-g 71 f-j 17 2.8 OMK71 112 d-h 122 e-h 73 a-d 5,1 a-f 71,5 f-j Chưa trổ 0 OMK72 102.5 abc 118,5 c-h 75,5 a-h 5 a-f 66,5 a-h Chưa trổ 0 OMK73 103.5 a-d 125 h 73 a-d 5,9 e-h 71,5 f-j Chưa trổ 0 OMK74 101 ab 125 h 83 ij 5,75 c-h 65,5 a-g Chưa trổ 0 OMK75 105.5 a-e 115 b-h 77,5 a-j 5,65 a-h 65,5 a-g Chưa trổ 2.3 OMK56 106 a-e 122 e-h 79 c-j 5,85 d-h 64 a-e 16 3.2 OMK76 102 abc 125 h 81 f-j 6,7 h 61,5 ab 16 2.9 OMK77 111 c-h 122 e-h 71 a 5,85 d-h 61,5 ab 16 1 OMK40 110 b-h 110,5 a-d 72 abc 5 a-f 69 d-i 15 2.4 OMK13 103 a-d 112,5 a-f 71,5 ab 5,3 a-g 62,5 a-d Chưa trổ 0 OMK62 106.5 a-e 123,5 gh 75,5 a-h 5,8 c-h 65,5 a-g Chưa trổ 0 OMK63 112 d-h 102,5 a 82,5 hij 6 fgh 64 a-e 17 3.5 OMK68 117.5 gh 121,5 e-h 78,5 b-j 5,6 a-g 70,5 e-j 17 2.75 OMK69 102.5 abc 124,5 gh 75 a-g 5 a-f 73 hij Chưa trổ 0 OMK70 102 abc 103 a 72,5 a-d 4,75 a-d 72 g-j Chưa trổ 0 Mean 105,7 111,86 75,9 5,38 65,76 2,2 Cv(%) 3,6 4,2 4 8,5 4,3 32 Giá trị trung bình theo sau những chữ số trong một cột có cùng mẫu tự khác biệt nhau không có ý nghĩa ở mức 5 % Từ kết quả bảng 4.1, sự đa dạng của 50 dòng dứa Cayenne về mặt kiểu hình được thể hiện như sau: - Chiều cao cây giữa các dòng trong giống có sự khác biệt với nhau về thống kê ở mức ý nghĩa 5 % và hệ số biến động 3,6 %. Chiều cao trung bình của giống biến động từ 100 – 118 cm và trung bình là 107,5 cm. Trong đó cao nhất là dòng OMK7 có nguồn gốc từ pháp (118 cm) và thấp nhất là những dòng dứa OMK18, OMK66 có nguồn gốc từ Bến Tre và Hà Nội (100 cm). Dựa vào biểu đồ 4.1 cho thấy những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom thì khác biệt không lớn bởi dù trồng ở những hình thức khác nhau nhưng chúng đều cùng một giống. 118 101 106.35 105.15 100.5 117.5 90 95 100 105 110 115 120 Min Max Trung bình Ca o câ y Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.1: Chiều cao cây của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom - Chiều rộng của tán cây cũng dao động từ 102,5 cm – 125 cm và trung bình 111,86 cm. Dòng có chiều rộng lớn nhất có nguồn gốc từ Hà Nội và sự khác biệt về chiều rộng tán của dòng này cũng có ý nghĩa so với các dòng dứa khác. - Chiều dài lá trung bình dao động từ 73,5 cm – 84 cm và chiều rộng lá trung bình khoảng 4,55 cm – 6,7 cm với hệ số biến động lần lượt là 4 % và 8,5 %. Một số dòng có cùng nguồn gốc nhưng lại khác biệt có ý nghĩa đối với hai tính trạng này như OMK12 và OMK10; OMK11 và OMK1. 33 - Số lá trên bụi giữa các dòng trong giống Cayenne cũng có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với số lá trung bình giữa các dòng dao động trong khoảng 61 – 76,5 lá và hệ số biến động 4,3 %. Kết quả từ biểu đồ 4.3 cũng cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về số lá giữa dòng trồng từ nuôi cấy mô và những dòng trồng từ dạng hom. Đều này cho thấy sự đa dạng trong giống Cayenne với tính trạng này. 61 76.5 61.22 73.5 6964 0 20 40 60 80 100 Min Max Trung bình Số lá / b ụi Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.2: Số lá / bụi của các dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom - Trong 50 dòng dứa khảo sát thì có 25 dòng cho thu hoạch trái chiếm 50%, thời gian trổ vào khoảng tháng 2 – tháng 4 và bắt đầu thu hoạch từ tháng 6 – tháng 7. Những dòng OMK63, OMK65, OMK67, OMK68 có nguồn gốc từ Hà Nội cho hoa muộn hơn so với các dòng khác (tháng 4). Thời gian ra hoa không đồng đều giữa các giống do không có xử lý ra hoa đồng loạt để ra hoa tự nhiên nhằm xét mức độ thích nghi đối với từng dòng trong giống. - Năng suất trái giữa các dòng trong giống cũng khác nhau, dòng OMK63 có khối lượng trái trung bình lớn nhất (3,5 kg) và nhỏ nhất 1 kg ở dòng OMK77, đối với các dòng nuôi cấy mô thì khối lượng trái trung bình lớn hơn so với các dòng trồng từ dạng hom (biểu đồ 4.3) nhưng độ ngọt của trái thì thấp hơn. Hình dạng trái và kích thước trái của giống Cayenne cũng có sự đa dạng giữa các dòng (hình 4.3). 34 3.2 2.84 1 2.09 2.85 2.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Min Max Trung bình Nă ng su ất trá i Dạng hom Nuôi cấy mô Biểu đồ 4.3: Năng suất trái của những dòng dứa trồng từ nuôi cấy mô và dạng hom. Hình 4.1: A: hình cây Thơm Trung An, B: hình cây Thơm Hà Nội Hình 4.2: Hình dạng và màu sắc lá với A: xanh đậm không gai, B: xanh đốm nâu không có gai, C: xanh đốm đỏ tía có gai, D: xanh có gai E: xanh đốm nâu gai viền. 35 Hình 4.3: A: Thơm Cần Thơ, B: Thơm Hà Nội Hình dạng và màu sắc lá của giống Cayenne cũng phân ly thành nhiều dạng khác nhau: - Màu sắc lá của giống đa dạng với 3 màu: xanh, xanh có đốm nâu và xanh có đốm đỏ tía (hình 4.1 và 4.2) đều này cho thấy có sự phân ly đối với tính trạng này giữa các dòng trong giống. Sự khác biệt này còn thể hiện ở những dòng dứa có cùng nguồn gốc như dòng OMK44 có màu xanh, OMK48 có màu xanh đốm nâu (Phụ lục II). - Hình dạng lá của giống Cayenne thường không có gai hoặc rất ít ở ngọn nhưng qua khảo sát cho thấy có sự khác biệt giữa các dòng trong giống (biểu đồ 4.4) với số dòng có hình dạng lá không có gai chiếm 60 %, có gai chiếm 20 % và lá viền (có gai nhưng chỉ ở một khoảng của lá như giữa, ngọn hoặc gốc lá) chiếm 20 %. Kết quả này đã chứng tỏ trong cùng một giống nhưng có sự phân ly về tính trạng được thể hiện qua kiểu hình. Đều này cho thấy có sự đa dạng nguồn gen giữa các dòng dứa từ Cayenne và sẽ là yếu tố góp phần phân loại làm cơ sở cho lai tạo giống. Đồng thời, tính trạng này khá ổn định, do vậy cần xét sự khác biệt về kiểu gen giữa các dòng dứa để tìm mối quan hệ liên kết giữa gen và tính trạng. A 36 Hình dạng lá 60%20% 20% không có gai Có gai Viền Biểu đồ 4.4: Sự đa dạng về hình dạng lá của 50 dòng Cayenne Dựa trên sự khác biệt có ý nghĩa về đặc tính nông học chiều cao cây, số lá trên bụi, chiều rộng tán, dài lá và rộng lá của 50 dòng dứa Cayenne, phân nhóm di truyền bằng phương pháp SAHN ( Sneath và Sokal, 1973) được thiết lập nhằm sắp xếp các dòng dứa thành những nhóm có mức độ tương quan gần nhau về mặt di truyền trên cơ sở biểu hiện kiểu hình. 37 PHAN NHOM KIEU HINH DUA CORR Coefficient -0.23 0.01 0.26 0.50 0.75 1.00 OMK12 OMK5 OMK47 OMK71 OMK40 OMK68 OMK16 OMK42 OMK29 OMK18 OMK70 OMK45 OMK65 OMK1 OMK66 OMK69 OMK72 OMK15 OMK64 OMK13 OMK62 OMK3 OMK73 OMK67 OMK43 OMK49 OMK75 OMK76 OMK56 OMK74 OMK6 OMK12 OMK59 OMK19 OMK17 OMK52 OMK50 OMK10 OMK11 OMK20 OMK63 OMK9 OMK8 OMK61 OMK2 OMK7 OMK48 OMK51 OMK44 OMK4 OMK77 Hình 4.4: Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa 50 dòng dứa Cayenne trên cơ sở kiểu hình. Bảng 4.2: Kết quả phân nhóm 50 dòng dứa cayenne dựa trên đặc tính kiểu hình Nhóm Tên dòng Số dòng I OMK5, OMK47, OMK71, OMK40, OMK68, OMK16, OMK42, OMK29, OMK18, OMK70, OMK45, OMK65, OMK1, OMK66, OMK69, OMK72. 16 II OMK15, OMK64, OMK13, OMK62, OMK3, OMK73, OMK67, OMK43, OMK49, OMK75, OMK76, OMK56, OMK74, OMK6 8 III OMK12, OMK59, OMK19, OMK17, OMK52, OMK50, OMK10, OMK11, OMK20, OMK63, OMK9, OMK8, OMK61 13 IV OMK2, OMK7, OMK48, OMK51, OMK44, OMK4, OMK77 7 38 Kết quả ở hình 4.4 và bảng 4.2 cho thấy 50 dòng dứa Cayenne được phân thành 4 nhóm chính ở mức tương quan 26 % về kiểu hình như sau: - Nhóm I và nhóm II có ít có sự tương quan, nhóm III và nhóm IV tương quan chỉ 2%. - Những dòng trong cùng một nhóm thì có sự tương quan chặt với nhau cho thấy chúng có thể xuất phát từ những quần thể có quan hệ với nhau về mặt di truyền như dòng dứa OMK1, OMK66, OMK69, OMK72 trong nhóm I hay các dòng OMK43, OMK49, OMK75, OMK76, OMK74 trong nhóm II. Qua kết quả nghiên cứu trên từng tính trạng và phân nhóm dựa vào đặc tính hình thái của 50 dòng dứa Cayennne cho thấy giữa các nhóm dòng có sự khác biệt về kiểu hình và chứng tỏ có sự đa dạng nguồn gen trong cùng một giống. Tuy nhiên, sự phân nhóm dựa vào kiểu hình ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố môi trường. Sự khác biệt và đa dạng của những tính trạng sinh trưởng như chiều cao cây, chiều dài lá, số lá trên bụi giữa các dòng dứa có thể không quy định bởi kiểu gen mà tùy theo đều kiện môi trường, đất đai, bóng rợp để cây phát triển. Do đó sự đa dạng nguồn gen của giống Cayenne cần phải được tiến hành dựa vào kiểu gen để xác định mức độ chính xác của việc phân nhóm. 4.2. Đánh giá đa dạng nguồn gen bằng kiểu gen 4.2.1. Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA Để thực hiện phản ứng PCR-RAPD nồng độ DNA được pha loãng từ 20 – 50 ng / µl cho phù hợp với lượng DNA cần thiết để thực hiện phản ứng PCR. Theo Antoni Raflski và một số tác giả khác thì nồng độ DNA thích hợp để chạy phản ứng PCR-RAPD từ 5 – 50 ng / 1 phản ứng (Antoni Rafalski và ctv, 1994). Các mẫu DNA của 50 dòng dứa sẽ được kiểm tra chất lượng trên môi trường agarose gel 0,8 % trong TAE 1X. Nếu DNA hiện diện trên gel không rõ và bị đứt đoạn thì cần phải tiến hành ly trích lại. DNA tốt khi xuất hiện những vạch sáng và mỏng. Kết quả kiểm tra được thể hiện trong hình 4.5. 39 Hình 4.5: Chất lƣợng DNA của các dòng dứa Cayenne trên gel agarose 0.8 %. 4.2.2. Sản phẩm phản ứng PCR với marker RAPD Để phát hiện sự đa hình, 13 primer đã được sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA genome thu được từ các mẫu lá của 50 dòng dứa Cayenne. Sản phẩm khuếch đại tạo ra từ những primer này được quan sát trên gel agarose 1.5%. Kết quả quan sát cho thấy chỉ có 9 primer cho sản phẩm khuếch đại, với 38 allen đa hình được tạo ra trung bình 4,28 allen / 1 primer, sản phẩm khuếch đại có kích thước từ 0,3 – 3 kb (bảng 4.3). Dựa vào sự khác biệt giữa các allen thể hiện qua các băng trên gel ta có thể xác định được sự khác nhau giữa các dòng dứa về mặt di truyền. Bảng 4.3: Danh sách các primer sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền của dứa Cayenne STT Ký hiệu Trình tự 5 ’ ..................................... 3 ’ Số băng phát hiện Kích thƣớc (kb) Ghi chú 1 OPD 02 GGACCCAACC 4 0,3 – 1,3 Primer từ bộ kit 2 OPA10 GTGATCGCAG 4 0,2 – 1,5 Primer từ bộ kit 3 RAPD3 GTAGACCCGT 4 0,2 – 3 Primer viện thiết kế 4 OPC15 GACGGATCAG 4 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit 5 RAPD2 GTTTCGCTCC 5 0,7 – 1,6 Primer viện thiết kế 6 RAPD4 AAGAGCCCGT 6 0,75 – 1,5 Primer viện thiết kế 7 RAPD6 CCCGTCAGCA 3 1,1 – 2,5 Primer viện thiết kế 8 AJ01 ACGGGTCAGA 3 0,4 – 1,018 Primer từ bộ kit 9 OPA04 AATCGGGCTG 5 0,3 – 2,5 Primer từ bộ kit 40 - Primer RAPD3: Sản phẩm khuếch đại được tạo ra với primer này là 4 và cả 4 sản phẩm đều đa hình, có kích thước từ 0,2 – 3 kb (hình 4.6a). Trong đó có duy nhất 3 băng có kích thước 3 kb ở các dòng Cayenne như OMK20 (11), OMK11 (13), OMK16 (19). Đều này có thể cho thấy sự khác biệt về di truyền của các dòng dứa này so với những dòng khác. Đối với primer này thì có 50 % số dòng dứa tạo sản phẩm khuếch đại, trong đó phần lớn các dòng dứa Hà