Khóa luận Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của ba giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv, 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11 lông roi, vi khuẩn này phát triển tối ưu ở nhiệt 29oC trong môi trường có bổ sung mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh khối u trên cây (chủ yếu là cây hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây. Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thước là 2,6Mb. Ngoài ra vi khuẩn 12 còn mang plasmid lớn có kích thước 200 - 800 kb (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là Plasmid Ti, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv, 2005). Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thương và xâm nhập vào cây qua vết thương đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó là Plasmid Ti. Plasmid Ti mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không mang Plasmid Ti thì được xem như là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ màu trắng, ban đầu được tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi. Các khối u có thể mền và xốp và có thể bị vỡ vụn khi chạm vào, nhưng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ. Các khối u có đường kính đến 30 cm nhưng phổ biến là 5 – 10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường. Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen trên Plasmid Ti sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này như một nguồn cacbon 2.3.2. Ti-plamid Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Plasmid Ti như một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T- DNA mang các gen tổng hợp các hormon thực vật và vùng gen vir, ngoài ra còn có một số gen mã hoá cho việc tái sinh plasmid, cho việc tiêu hoá opine. Trong cấu trúc của Plasmid Ti , hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen vir (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002). 2.3.2.1 Chức năng của T-DNA T-DNA là một đoạn DNA có kích thước 10-30 kb, trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u (Gelvin, 2003). Trong Plasmid 13 Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự nucleotide của bờ phải và bờ trái tương tự nhau và đều có kích thước 25bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể được bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trước và tiến dần về phía trái. Việc đảo ngược bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Gelvin, 2003; Zhu và ctv, 2000). T-DNA mã hóa một vài protein và các protein này biểu hiện trong tế bào cây được chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen được chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây, yếu tố tăng cường sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây được cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-DNA khác được cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv,1991). Trong khi đó gen tml làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích (Tinland và ctv, 1992). Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác. Một nhóm gen được chuyển thứ hai đều khiển sản xuất nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một aminoacid với một keto acid hoặc một đường (Dessaux và ctv, 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lượng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thường trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine được tổng hợp từ khối u. Dựa trên các kiểu opine đựơc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng như là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine. Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Gen ocs mã hóa cho 14 octopine synthase, enzyme này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic acid và tất cả những opine này đều được phát hiện trong các khối u (Dessaux và ctv, 1998). Sản phẩm của gen mas2’ được cho là làm kết nối glutamine hoặc glutamic acid với glucose (mặc dù đều này chưa đựơc chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic acid. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic acid (Dessaux và ctv, 1998). Bởi vậy, các khối u được tạo ra bởi Plasmid Ti kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine. 2.3.2.2 Chức năng của các gen vir Vùng vir trên Plasmid Ti có khoảng 25 gen được nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002) và vùng này có kích thước khoảng 30- 40 kbp (Riva và ctv, 1998). Những gen vir này mã hoá cho các vai trò như: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, gia công đoạn T-DNA, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ. Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thương của cây thông qua dấu hiệu hoá học tiết từ vết thương. Các tín hiệu hoá học từ vết thương ở tế bào cây chủ tạo ra được nhận biết trước tiên bởi VirA protein, rồi đến VirG protein để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir được kích hoạt tối đa ở pH acid với sự hiện diện của các hợp chất phenol như là acetosyringone (AS), chất mà được giải phóng khi tế bào cây bị tổn thương (Ziemienowicz, 2001). Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào, protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thương của cây. VirA có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trường. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể được kích thích bởi đường, các opine khối u hoặc amino acid (Zhu và ctv, 2000; Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá, sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG được phosphoryl hoá bởi aspartic acid còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv, 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thước khoảng 12bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv, 1987). 15 Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn và đưa sợi đơn T- DNA vào trong tế bào cây. Các protein được mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T- DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T-DNA. Protein VirD2 được tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ vai ở vị trí tương đồng (Zupan và ctv, 1996; Deng và ctv,1998). Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn DNA , nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv, 1998), protein VirE2 là protein chiếm số lượng nhiều nhất. Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy sự hấp thu phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir khác cũng được cho là có chức năng trong việc tạo gia công T-DNA là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã được thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cường sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo sợi đơn T-DNA nhưng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv, 2000). Ngoài ra, Protein VirD2 được cho là có chức năng trong sự hòa hợp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đưa T-DNA vào nhân tế bào và lưu lại cùng với T-DNA trong các bước hòa hợp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự hòa hợp T-DNA đã được đề nghị: VirD2 hoạt động như một integrase và VirD2 hoạt động như một ligase (Ziemienowicz, 2001). Hệ thống chuyển nạp T-DNA được mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB đều khiển tạo chiên mao và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase và được cho là cung cấp năng lượng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA. Hệ thống VirB đưa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bước cần cho chuyển T-DNA vào nhân và hòa hợp với DNA của cây được thực hiện (Zhu và ctv, 2000). 16 Hình 2.2. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv, 2000) 2.3.2.3 Cơ chế lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tạo ra. Vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các dấu hiệu hoá học. Đều này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Plasmid Ti sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của Plasmid Ti là mã hoá các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Plasmid Ti (Valentine, 2003 ) Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ đều khiển quá trình tạo sợi đơn T-DNA. Quá trình tạo sợi đơn T-DNA được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và 17 VirD2 thực hiện. Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T- DNA. Phức hợp T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 được chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp được mã hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào. (Valentine, 2003 ) Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (Valentine, 2003 ) Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng với DNA của cây và gắn vào. Sau đó nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tương đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây được hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự hòa hợp của T-DNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Valentine, 2003 ). Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (Valentine, 2003 ) 18 CHƢƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sử dụng plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi và gen gus để xây dựng quy trình chuyển nạp gen với hệ thống thanh lọc bằng mannose đối với cây bông vải. 3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: khóa luận được thực hiện từ ngày 21/03/2005 đến ngày 31/07/2005. Địa điểm: khóa luận được thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, huyện Cờ Đỏ, TP. Cần Thơ. 3.3. Vật liệu nghiên cứu Giống bông vải Coker 312 và VN36P. Hạt bông vải tự thụ được thu từ cây bông vải trồng ở nhà lưới của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Mẫu cấy: trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi. Dụng cụ, thiết bị, hoá chất ở bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (phụ lục 7). 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1.Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy Hạt của các giống bông vải được đốt lớp xơ bao quanh bằng axit sunfurit đậm đặc (H2SO4 98%), rồi rửa dưới vòi nước máy nhiều lần cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 400C khoảng 48 giờ để đạt độ ẩm 14%. Sau khi sấy, hạt được khử trùng bề mặt với cồn 700 trong 2 phút rồi rửa bằng nước cất vô trùng (3 lần), tiếp theo hột được khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% (w/v) có vài giọt Tween 20, lắc ở tốc độ 100 vòng/phút thực hiện 2 lần mỗi lần 10 phút (giữa 2 lần khử trùng bằng HgCl2 có rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng), sau đó hạt được rửa nhiều lần với nước cất vô trùng (6 lần) rồi được bảo hoà qua đêm trong nước cất. 19 Sau khi bảo hòa qua đêm, hạt tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% có vài giọt Tween 20 (thực hiện 2 lần mỗi lần 5 phút). Sau đó những hạt nứt nanh được bóc vỏ trong đều kiện vô trùng và cấy vào môi trường nảy mầm MSG (phụ lục 1) và nuôi ở nhiệt độ 28 - 29 0C, độ ẩm tương đối bằng 50%. Sau 5-7 ngày ta loại bỏ những keo bị tạp nhiễm, chọn những cây không bị tạp nhiễm làm nguồn vật liệu thí nghiệm. Từ cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi đã được nuôi cấy, các trụ hạ diệp được cắt thành những đoạn dài khoảng 0,5 cm dùng làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển nạp gen. Hình 3.1. Hạt bông vải sau khi tách vỏ và cấy vào môi trường nảy mầm Hình 3.2. Cây mần in vitro 5 ngày tuổi. 20 3.4.2. Quy trình chuyển nạp gen 3.4.2.1. Nguồn plasmid Nguồn plasmid được sử dụng để nghiên cứu là vector pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào vi khuẩn biến dưỡng đường mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 (Hoekema và ctv, 1983). Hình 3.3. Sơ đồ vector pManCa mang gen pmi và gen gus 3.4.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector pManCa từ ống tồn trữ trong glycerol (50%, v/v) ở nhiệt độ -800C được nuôi cấy trên môi trường đặc ABG (Chilton và ctv, 1974) có 50 mg/l kanamycin và ủ ở 280C trong 72 giờ. Trên môi trường đặc ABG (phụ lục 4) chọn một khuẩn lạc phát triển tốt đem nuôi cấy trong 3ml môi trường lỏng YEP (An và ctv, 1988) có bổ sung 50mg/l kanamycin và nuôi qua đêm (24-28 giờ) ở 280C trên máy lắc với tốc độ 200vòng/phút. Sau khi nuôi cấy 24-28 giờ, cấy chuyền sang 50 ml môi trường YEP (phụ lục 5) có kanamycin 50mg/l và nuôi cấy khoảng 16- 18 giờ ở 280C, lắc 200 vòng/phút đến khi OD600 đạt khoảng 0,5 - 1. 3.4.2.3. Lây nhiễm (đồng nuôi cấy) Chủ yếu dựa theo quy trình của Chen và ctv, 2000 (US Patent số: WO 00/77230 A1) với một vài thay đổi: OD600 pha loãng là 0,5, thời gian ngâm mẫu trong dịch vi khuẩn là 30 phút và lây nhiễm trên môi trường không có giấy thấm (Chen và ctv tiến hành thí nghiệm với OD600 pha loãng là 0,3, thời gian 5 phút và lây nhiễm trên môi trường có giấy thấm). 21 Vi khuẩn sau khi chuẩn bị được đem li tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong 10 phút. Sau khi li tâm, phần lắng được pha loãng bằng môi trường lây nhiễm không có phytagel (có bổ sung AS) và lắc với tốc độ 220 vòng/phút ở 280C trong 1giờ để chuẩn bị cho lây nhiễm. Từ cây mầm in vitro đã được chuẩn bị ta cắt lấy đoạn trụ hạ diệp, sau đó đoạn cắt trụ hạ diệp được cắt thành những mẫu dài khoảng 0,5 cm rồi ngâm trong dịch vi khuẩn pha loãng (OD600 ~ 0,5) khoảng 30 phút. Sau khi lây nhiễm các mẫu cấy được chuyển vào đĩa petri có giấy thấm tuyệt trùng cho khô mẫu sau đó cấy sang đĩa petri có môi trường đồng nuôi cấy MSCo (phụ lục 2). Các đĩa mẫu sau đó được giữ trong tủ nuôi ở 210C trong đều kiện chiếu sáng liên tục khoảng 72 giờ. 3.4.2.4. Thanh lọc Sau khi đồng nuôi cấy với vi khuẩn, mẫu cấy được rửa vi khuẩn bằng nước cất vô trùng 2 lần để loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên bề mặt mẫu cấy và kháng sinh carbernicillin 500 mg/l để ức chế vi khuẩn mọc trở lại. Sau khi rửa, mẫu cấy được đặt lên đĩa petri có giấy thấm vô trùng trong vài phút cho khô mẫu. Sau đó mẫu cấy được cấy chuyền lên môi trường thanh lọc MMS1 (phụ lục 3) có tác nhân thanh lọc là đường mannose và glucose ở các nồng độ khác nhau theo sự tăng dần nồng độ mannose (2,5% w/v, 30% w/v và 35% w/v) và giảm dần nồng độ glucose (10% w/v, 5% w/v và 0% w/v) qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần. Bảng 3.1. Nồng độ đường mannose và glucose ở các lần thanh lọc Lần thanh lọc Mannose Glucose I II III 25g/l 30g/l 35g/l 10g/l 5g/l 0g/l Sau khi thanh lọc thì các mô sẹo chuyển gen giả định (biến dưỡng đường mannose) xuất hiện. Tỉ lệ mô sẹo chuyển gen giả định được theo dõi. Từ các mô sẹo sống sót sau khi thanh lọc, ta chọn ra những mô sẹo phát triển tốt, có màu xanh hơi vàng và rời rạc để tách nhỏ và cấy chuyền lên môi trường phát sinh phôi MMS2 (phụ lục 6). 22 3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi Sự biến đổi hình thái mô sẹo trong quá trình lây nhiễm và chọn lọc: Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo dõi sự thay đổi hình thái mô sẹo qua các giai đoạn là sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1, thanh lọc lần 2 và thanh lọc lần 3. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo: Sau các lần thanh lọc tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo được chúng tôi theo dõi và ghi nhận. Từ tỉ lệ này chúng ta có thể so sánh được sự khác nhau giữa các giống đồng thời cũng đánh giá được hiệu quả của hệ thống thanh lọc đang thực hiện. 23 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sự hình thành và phát triển mô sẹo Trong nghiên cứu chuyển nạp gen với mẫu cấy là trụ hạ diệp thì sự hình thành và phát triển của mô sẹo có một ý nghĩa rất quan trọng. Từ các mô sẹo được hình thành sau khi lây nhiễm và qua quá trình thanh lọc chúng ta có thể chọn ra được các mô sẹo chuyển gen có khả năng tái sinh để tiếp tục tái sinh thành cây chuyển gen. Sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1 thì mô sẹo đều bắt đầu hình thành và phát triển ở cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm. Mô sẹo có màu xanh lá cây tuy nhiên ở mẫu đối chứng sự phát triển của mô sẹo đồng đều hơn so với mẫu lây nhiễm có thể là do mẫu lây nhiễm bị tổn thương do ngâm trong dịch vi khuẩn và rửa lại bằng nước và kháng sinh khi tiến hành lây nhiễm (Hình 4.2). Hình 4.1. Mẫu cấy giống Coker 312 sau khi lây nhiễm trên môi trường MSCo 24 Hình 4.2. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 1. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hai tuần trên môi trường thanh lọc lần 2, mô sẹo phát triển thành một khối to gấp 3 – 4 lần so với mô sẹo trên môi trường thanh lọc lần 1 (Hình 4.3). So sánh giữa đối chứng và mẫu lây nhiễm ta thấy ở mẫu đối chứng thì khối mô sẹo cứng, có màu xanh đậm còn ở mẫu lây nhiễm thì mô sẹo có màu xanh hơi vàng và chắc, một số mô sẹo có xu hướng rời ra khi chạm kẹp vào. Theo Mishra và ctv (2003) thì các mô sẹo này đáp ứng tốt với khả năng tái sinh. Hình 4.3. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 2. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm 25 Hình 4.4. Mẫu cấy giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.5. Mẫu cấy VN36P sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. Trên môi trường thanh lọc lần 3 chúng tôi thấy các mô sẹo tiếp tục phát triển và kích thước mô sẹo lớn hơn trên môi trường thanh lọc lần 2. Ngoài ra, chúng tôi còn thấy được sự khác biệt giữa đối chứng và mẫu lây nhiễm. Các mẫu đối chứng chuyển sang màu xanh đậm hơn, khối mô sẹo cứng và dính chặt vào nhau, trong khi đó ở mẫu lây nhiễm thì khối mô sẹo chắc, các mô sẹo rời và có màu xanh vàng rõ hơn khi quan sát dưới kính hiển vi. Một số mẫu ở đối chứng bắt đầu có hiện tượng hoá nâu và chết, tuy nhiên vẫn còn một số 26 mẫu sống sót, có thể là do trong các khối mô sẹo có sự tích lũy đường glucose (Hình 4.4, Hình 4.5 và Hình 4.6). Các mô sẹo có màu xanh vàng, chắc, rời rạc từ khối mô sẹo còn sống trong giai đoạn này được tách nhỏ và tiếp tục cấy chuyền lên môi trường thanh lọc giống như ở lần 3 (Hình 4.7). Sau 2 tuần quan sát chúng tôi thấy các mô sẹo được tách nhỏ từ mẫu đối chứng điều bị chết còn ở mẫu lây nhiễm thì một số mô sẹo tiếp tục phát triển có màu xanh vàng, rời rạc, đây là các mô sẹo đáp ứng tốt với khả năng tái sinh và có khả năng sinh phôi tốt (Mishra và ctv, 2002; Sakhanokho và ctv, 2001). Tuy nhiên số mô sẹo chuyển màu nâu đen trong nghiệm thức chuyển gen cũng rất nhiều. Ở các mô sẹo chết và trên một số mô sẹo hóa nâu chúng tôi thấy có xuất hiện các mô sẹo mới. Các mô sẹo này có thể là những mô sẹo được chuyển nạp gen (Hình 4.8). Hình 4.6. Mẫu cấy giống Coker 312 chết trên môi trường thanh lọc lần 3. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm Hình 4.7. Khối mô sẹo giống Coker 312 sau khi thanh lọc lần 3. A: mô sẹo được tách nhỏ và chuyển tiếp lên môi trường thanh lọc lần 3, B: mô sẹo không được tách và chuyển lên môi trường thanh lọc lần 3. 27 Hình 4.8. Mô sẹo giống VN36P được tách nhỏ sau 2 tuần trên môi trường thanh lọc lần 3 A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần thanh lọc Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy mô thông thường và chuyển gen. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành theo dõi sự hình thành mô sẹo của các mẫu cấy sau khi kết thúc mỗi lần thanh lọc (thời gian cho mỗi lần thanh lọc là 2 tuần). Bảng 4.1. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 38 146 100 97,3 2 34 146 34 143 100 97,9 3 36 147 36 144 100 97,9 4 34 143 34 139 100 97,2 Trung bình 100 97,6 28 Bảng 4.2. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 trên giống VN36P Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 1 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 42 148 42 146 100 98,6 2 39 146 39 143 100 97,9 3 42 147 42 143 100 97,3 4 40 143 40 142 100 99,3 Trung bình 100 98,3 Bảng 4.3. Tỉ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 trên giống Coker 312 Số lần thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống và tạo mô sẹo sau khi thanh lọc lần 2 Tỉ lệ (%) Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm Đối chứng Lây nhiễm 1 38 150 38 143 100 95,3 2 34 146 34 141 100 96,6 3 36 147 36 143 100 97,3 4 34 143 34