Khóa luận Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp diclofenac natri tạo ra từ gluconacetobacter xylinus trong môi trường nước dừa già

K Diclofenac Natri trong việc giải phóng thuốc. -Ý nghĩa thực tiễn + Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Gluconacetobacter Xylinus + Tăng sinh khả dụng của thuốc Diclofenac Natri Từ kết quả nghiên cứu có thể áp dụng vào thực tiễn 3 5. Tính mới của đề tài (nếu có) Bổ sung các dữ liệu khoa học về cơ chế giải phóng thuốc Diclofenac Natri từ các loại vật liệu CVK nạp thuốc trong các môi trường giải phóng thuốc mô phỏng theo đường dạ dày – ruột khác nhau. Kết quả của đề tài có thể là cơ sở định hướng cho việc ứng dụng sản xuất các chế phẩm chữa bệnh từ vật liệu CVK nạp thuốc. 4 NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu cellulose vi khuẩn ( CVK) 1.1.1. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter Xylinus Gluconacetobacter Xylinus được xếp vào chi Gluconacetobacter, thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae [8]. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hóa dị dưỡng. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh trong môi trường nuôi cấy dịch thể, chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường một lớp màng cellulose [8]. Sự phát triển của Gluconacetobacter và khả năng tổng hợp cellulose tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu có trong môi trường nuôi cấy. Một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus: độ pH thấp, lượng oxy cần cung cấp rất lớn, nhiệt độ thích hợp là 25-30ºC [8]. 1.1.2. Màng cellulose vi khuẩn Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết mắt xích β-D- Glucose, có công thức cấu tạo là ( C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật. Trong gỗ lá kim, cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích. Cellulose vi khuẩn ( CVK) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ[7]. Cellulose vi khuẩn có cấu trúc và đặc tính giống với cellulose thực vật (PC)[7]. Nhưng cellulose vi khuẩn có những đặc tính vượt trội do được cấu tạo từ các bó sợi microfibril và không có sự kết hợp của các hợp chất phân tử. những đặc tính ưu việt hơn của cellulose vi khuẩn là: độ chịu lực tốt hơn, tính đàn hồi, độ bền cơ học cao hơn, Cellulose vi khuẩn được tạo thành từ 2 loại cấu trúc tinh thể riêng biệt có nguồn sản xuất từ vi sinh vật, kích thước khoảng 20 micromet. Mức độ 5 polimer hóa của CVK thường từ 2000 – 6000 gốc glucose (1 số vi khuẩn đặc biệt có thể đạt 16000- 20000 gốc glucose). Tính chất của cellulose vi khuẩn: Có cấu trúc mạng tinh thể và có kích thước ổn định. Có sức căng, độ bền sinh học, độ bền hóa học, độ bền cơ học và độ tinh sạch cao. Có khả năng phục hồi sau khi bị thủy phân bởi 1 số vi sinh vật. Có khả năng chịu nhiệt và khả năng tạo tinh thể tốt. Được tổng hợp một cách trực tiếp dưới dạng sợi chỉ nhỏ hoặc dạng màng mỏng. Do cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lignin và cấu trúc của CVK có thể biến đổi trong quá trình nuôi cấy nên ta có thể kiểm soát được kích thước, lý tính cũng như chất lượng của cellulose trong quá trình nuối cấy [6]. Cellulose được xem là nguồn vật liệu có nhiều ưu thế nên hiện nay ứng dụng của cellulose đang được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực: Trong y học: Màng CVK từ Gluconacetobacter Xylinus tẩm mù u có tác dụng giống màng sinh học trị bỏng. Đặc biệt, người ta đã sử dụng màng CVK tinh sạch để làm da nhân tạo trong chữa vết thương [12]. Trong thực phẩm: các sản phẩm ứng dụng của CVK như màng bao thực phẩm, một số món tráng miệng, 1.2. Thuốc Diclofenac Natri 1.2.1.Công thức hóa học và tên gọi Diclofenac là một thuốc chống viêm không steroid[2]. + Công thức phân tử: C14H11Cl2NO2 + Tên quốc tế: Diclofenac Natri + Tên IUPAC: 2-(2-(2,6- dichlorophenylamino)phenyl)acetic acid + Công thức cấu tạo: được mô tả ở hình 1.1 6 Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Diclofenac 1.2.2.Tính chất - Diclofenac Natri là chất bột kết tinh trắng hoặc hơi vàng, hút ẩm nhẹ. - Diclofenac Natri dễ tan trong methanol, trong ethanol 96%, hơi tan trong nước, khó tan trong aceton [4]. - Nóng chảy ở khoảng 280°C [4]. 1.2.3.Công dụng và cơ chế tác động của Diclofenac Diclofenac- một dẫn chất của acid phenylacetic. Diclofenac là thuốc chống viêm không steroid[2] có tác dụng chống viêm, giảm đau và giảm sốt mạnh. Ngoài ra, Diclofenac cũng có thể được sử dụng để điều trị các cơn đau khác (như đau răng, đau sau khi sinh). Tuy nhiên với các cơn đau nghiêm trọng và bất ngờ thì nên sử dụng các thuốc giảm đau có tác dụng giảm đau nhanh hơn Diclofenac. Diclofenac là một chất ức chế mạnh hoạt tính của cyclooxygenase, do đó làm giảm đáng kể sự tạo thành những chất trung gian của quá trình viêm như prostaglandin, prostacyclin và thromboxan. Diclofenac cũng điều hòa con đường lipoxygenase và sự kết tụ tiểu cầu 1.2.4. Động học giải phóng của thuốc Diclofenac được hấp thụ qua đường tiêu hóa sau khi uống. Thuốc được hấp thu nhanh hơn nếu uống lúc đói. Diclofenac gắn rất nhiều với protein huyết tương, chủ yếu với albumin (chiếm khoảng 99 %) [2]. Khoảng 50% liều uống được chuyển hóa qua gan lần đầu và sinh khả dụng trong máu tuần hoàn xấp xỉ 50% sinh khả dụng của liều tiêm tĩnh mạch. 2 giờ sau khi uống, nồng độ thuốc đạt tối đa trong huyết tương, 4 đến 6 giờ sau khi uống, nồng độ trong 7 dịch bao hoạt dịch đạt mức cao nhất. Tác dụng của thuốc xuất hiện 20 - 30 phút sau tiêm bắp, 30 - 60 phút sau khi đặt thuốc vào trực tràng, 60 - 120 phút sau khi uống. Nửa đời trong huyết tương khoảng 1 - 2 giờ. Nửa đời thải trừ khỏi dịch bao hoạt dịch là 3 - 6 giờ. Xấp xỉ 60% liều dùng được thải qua thận dưới dạng các chất chuyển hóa còn một phần hoạt tính và dưới 1% ở dạng thuốc nguyên vẹn; phần còn lại thải qua mật và phân. Hấp thụ, chuyển hóa và đào thải không phụ thuộc vào tuổi. Nếu liều lượng và khoảng cách giữa các lần dùng thuốc được tuân thủ theo chỉ dẫn thì thuốc không bị tích lũy, ngay cả khi chức năng thận và gan bị giảm. Chỉ định Ðiều trị dài ngày viêm khớp mạn, thoái hóa khớp. Thống kinh nguyên phát. Ðau cấp (viêm sau chấn thương, sưng nề) và đau mạn. Viêm đa khớp dạng thấp thiếu niên. 1.2.5. Dược lực học của thuốc Diclofenac có cấu trúc liên quan với Meclofenamat Natri và Acid Meclofenacmic và có tác động dược lí tương tự như các NSAID nguyên thủy khác. Thuốc có tác dụng kháng viêm, giảm đau và hạ sốt. Tác dụng của thuốc là làm thoái hóa mạch máu mới sinh trong mô viêm của động vật. Ngoài ra còn làm ức chế sự hình thành mạch máu. Cơ chế hoạt động của thuốc chưa được xác lập rõ ràng, nhưng có nhiều tác dụng liên quan đến sự ức chế tổng hợp prostaglandin [2]. 1.2.6.Tác dụng không mong muốn của thuốc (5 - 15% người bệnh dùng Diclofenac bị ảnh hưởng bởi tác dụng phụ ở bộ máy tiêu hóa) [2]. Chú ý: Trong số các thuốc chống viêm không steroid, Diclofenac độc hơn Ibuprofen và Ibuprofen, là thuốc ít độc nhất nhưng vẫn hiệu quả. Tác dụng phụ thường gặp, ADR > 1/100 Toàn thân: Đau đầu, bồn chồn. 8 Tiêu hóa: Ðau vùng thượng vị, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, trướng bụng, chán ăn, khó tiêu. Gan: Tăng các transaminase. Tác dụng phụ ít gặp, 1/1000 < ADR < 1/100 Toàn thân: Phù, dị ứng (đặc biệt co thắt phế quản ở người bệnh hen), choáng phản vệ kể cả tụt huyết áp, viêm mũi, mày đay. Tiêu hóa: Ðau bụng, chảy máu đường tiêu hóa, làm ổ loét tiến triển, nôn máu, ỉa máu, ỉa chảy lẫn máu, kích ứng tại chỗ (khi đặt thuốc vào trực tràng). Hệ thần kinh: Buồn ngủ, ngủ gật, trầm cảm, mất ngủ, lo âu, khó chịu, dễ bị kích thích. Da: Mày đay. Hô hấp: Co thắt phế quản. Mắt: Nhìn mờ, điểm tối thị giác, đau nhức mắt. Tai: Ù tai Tác dụng phụ hiếm gặp, ADR <1/1000 Toàn thân: Phù, phát ban, hội chứng Stevens - Johnson, rụng tóc. Hệ thần kinh: Viêm màng não vô khuẩn. Máu: Giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu trung tính, tăng bạch cầu ái toan, giảm bạch cầu hạt, thiếu máu. Gan: Rối loạn co bóp túi mật, test chức năng gan bất thường, nhiễm độc gan (vàng da, viêm gan). Tiết niệu: Viêm bàng quang, đái máu, suy thận cấp, viêm thận kẽ, hội chứng thận hư. 1.3. Tình hình trên thế giới và Việt Nam 1.3.1. Trên thế giới Trên thế giới, đã có những công trình nghiên cứu về thuốc Diclofenac natri như: 9 - Laila Hassanein Emara, Nesrin Fouad Taha, Rania Mohamed Badr , Nadia Mohamed Mursi (2012)[21] đã nghiên cứu phát triển hệ thống bơm thẩm thấu để phân phối có kiểm soát Natri Diclofenac - Mitra Jelvehgari , Hadi Valizadeh , Ramin Jalali Motlagh, Hassan Montazam (2014)[22] đã nghiên cứu xây dựng và đặc tính hóa lý của Buccoadhesive Microspheres chứa Diclofenac Sodium. - Srikanth A ABSTRACT, Nagaveni, SaravanaKumar, Prasanna Raju Y(2013)[20] đã nghiên cứu đặc tính và chế tạo DICLOFENAC SODIUM loại MICROCAPSULES LOADED. 1.3.2. Ở Việt Nam Ở Việt Nam việc nghiên cứu BC làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là một hướng đi mới. Các nghiên cứu và ứng dụng của màng CVK mới dừng lại ở mức độ khiêm tốn và hầu hết là ở điều kiện phòng thí nghiệm. Hiện nay, chúng ta đã có thể tự sản xuất màng CVK bằng phương pháp sản xuất đơn giản là lên men tĩnh. Phương pháp này sử dụng trang thiết bị đơn giản, giá thành thấp và tốc độ sinh sản nhanh, mang lại nhiều hiệu quả trong việc sản xuất màng CVK ứng dụng vào thực tiễn. 10 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Khả năng giải phóng Diclofenac của màng CVK được lên men từ môi trường nước dừa già. 2.2. Phạm vị nghiên cứu, địa điểm và thời gian - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm. - Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường ĐHSP Hà Nội 2. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 2.3.1.1. Chủng vi sinh Vi khuẩn cellulose từ Gluconacetobacter Xylinus được nuôi cấy tại phòng sạch Vi sinh- Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội 2. 2.3.1.2. Nguyên liệu và hóa chất Nguyên liệu: nước dừa già, nước cất. Hóa chất: Thuốc Diclofenac dạng tinh khiết và dạng chế phẩm bán trên thị trường (viên nén). Vật liệu Cellulose được sản xuất bằng cách sử dụng vi khuẩn lên men trong môi trường nước dừa già. Đường glucose, acid acetic, peptone, diamoni photphat, amoni sulfat, acid citric, cao nấm men, nước cất, cồn 96o. 2.3.1.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản). 11 - Cân phân tích CP 224S, cân kỹ thuật TE 412 (Sartorius – Thụy Sỹ) - Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA - Buồng cấy vô trùng (Haraeus) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức) - Bể ổn nhiệt 1013 - Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức) - Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh) - Bể rửa siêu âm TCP 280 - Tủ lạnh Daewoo - Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác. (hộp nhựa, cốc đong 500ml, 1000ml, pipet, bình tam giác, kéo, giấy bạc, giấy thấm, ) 2.3.2. Cách bố trí thí nghiệm - Thí nghiệm 1: Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già - Thí nghiệm 2: Xử lý và kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK - Thí nghiệm 3: Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc thông qua hệ thống được thiết kế - Thí nghiệm 4: Dựng đường chuẩn Diclofenac - Thí nghiệm 5: Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc vào màng ở môi trường nước dừa già 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.3.1.Chế tạo màng CVK từ môi trường nước dừa già Bước 1: Sấy các bình đựng và dụng cụ ở 200°C, sau khi sấy xong lấy ra và để nguội Bước 2: Chuẩn bị môi trường theo Bảng 2.1 12 Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men tạo màng Cellulose vi khuẩn Thành phần Môi trường nước dừa già Glucose 30g Peptone 10g Diamoni photphat 0,3g Amoni sulfat 0,5g Acid acetic 2% Nước dừa già 1000ml Dịch giống 10% Thêm dịch giống vào từng môi trường với lượng như nhau và tối thiểu bằng 10% thể tích môi trường [14]; pH của môi trường được đo và hiệu chỉnh = 4-6 [10, 19], pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác [10]. Bước 3: Hấp khử trùng môi trường ở 111°C trong 15 phút. Bước 4: Lấy môi trường ra khử trùng bằng tia UV từ 15-30 phút rồi để nguội môi trường. Bước 5: Bổ sung 10% dịch giống và 2% acid acetic, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch. Bước 6: Chuyển dịch sang dụng cụ nuôi cấy theo kích thước nghiên cứu, dùng gạc vô trùng bịt miệng dụng cụ, đặt tĩnh trong khoảng 4-14 ngày ở 28°C Bước 7: Thu màng CVK thô, rửa sạch chủng dưới vòi nước 2.3.3.2. Xử lí vật liệu CVK - Mục đích: Loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn. - Phương pháp: Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tạo thành màng dày ở mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường. 13 + Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy hấp màng trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 113°C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1 giờ + Sau khi ngâm NaOH, vớt màng đặt dưới vòi nước chảy đến khi màng trắng trong. Thử quỳ tím kiểm tra môi trường bề mặt màng CVK cần đạt là trung tính, ta thu được CVK tinh khiết [13,6]. Màng Cellulose vi khuẩn thô được xử lý theo sơ đồ Hình 2.1 Hình 2.1. Sơ đồ xử lý CVK sau khi lên men Màng sau khi thu được cần đạt những yêu cầu sau: - Mềm mại, dẻo dai, mỏng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt - Có độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô - Độ dày thích hợp của màng CVK thô: chọn màng CVK có độ dày 0,5cm và 1cm để tiến hành làm thực nghiệm Tách màng CVK thô Ngâm trong NaOH 3% Ngâm trong HCl 3% Ngâm trong nước Thu CVK tinh chế Ép loại nước 48 giờ, rửa và ép 48 giờ, rửa và ép 48 giờ, kiểm tra tạp chất 14 2.3.4. Phương pháp pha dung dịch đệm Lượng thuốc được giải phóng được tiến hành thử nghiệm ở dung dịch đệm có pH là 2; 4,5; 6,8; 7,4. Pha các dung dịch đệm có pH như trên: - Dung dịch đệm pH = 2,0: Hoà tan 6,57g kali clorid trong nước, thêm 11,9ml dung dịch acid hydrocloric 0,1M và thêm nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng HCl hoặc NaOH). - Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong 1000ml nước, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH). - Dung dịch đệm pH = 6,8: Hoà tan 68,8g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nước vừa đủ 1000ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). - Dung dịch đệm pH = 7,4: Hoà tan 0,6g kali dihydrophosphat; 6,4g dinatri hydrophosphat và 5,85g natri clorid trong nước vừa đủ 1000 ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần (Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH). 2.3.5. Phương pháp dựng đường chuẩn của thuốc Diclofenac Pha thuốc Diclofenac trong Ethanol ở các nồng độ 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% Sử dụng máy đo quang phổ UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) của các dung dịch mẫu chứa thuốc Diclofenac ở các bước sóng 276nm, 278nm, 281nm. Tiến hành đo 3 lần sau đó lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc để dựng đường chuẩn Giá trị mật độ quang phổ của dung dịch thuốc ở các nồng độ khác nhau thể hiện ở Bảng 2.2. 15 Bảng 2.2. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 276nm STT Nồng độ ( mg/ml) Giá trị OD 276nm(n=3) Giá trị trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 10 0,105 0,108 0,108 0,107 ± 0,001 2 20 0,213 0,214 0,215 0,214 ± 0,001 3 40 0,426 0,42 0.444 0,43 ± 0,008 4 60 0,643 0,638 0,645 0,642 ± 0,003 5 80 0,85 0,86 0,87 0,86 ± 0,006 6 100 1,06 1,075 1,075 1,07 ± 0,006 Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm Excel 2010, kết quả được đồ thị như Hình 2.2 Hình 2.2. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 276nm y = 0.1857x - 0.1333 R² = 0.9922 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 1 2 3 4 5 6 7 OD 276nm OD 276nm 16 Bảng 2.3. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n=3) ở bước sóng 278nm STT Nồng độ (mg/ml) Giá trị OD 278nm (n=3) Giá trị trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 10 0,116 0,116 0,119 0,117 ± 0,013 2 20 0,21 0,25 0,23 0,23 ± 0,013 3 40 0,49 0,46 0,46 0,47 ± 0,013 4 60 0,66 0,76 0,68 0,7 ± 0,04 5 80 0,95 0,94 0,96 0,94 ± 0,006 6 100 1,169 1,173 1,171 0,171 ± 0,001 Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm Excel 2010, kết quả được đồ thị như Hình 2.3 Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 278nm y = 0.218x - 0.1583 R² = 0.9917 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 2 4 6 8 OD 278nm OD 278nm 17 Bảng 2.4. Mật độ quang (OD) của dung dịch Diclofenac ở các nồng độ khác nhau (n =3) ở bước sóng 281nm STT Nồng độ (mg/ml) Giá trị OD 281nm (n=3) Giá trị trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 10 0,118 0,123 0,1235 0,12 ± 0,002 2 20 0,24 0,28 1.005 0,25 ± 0,014 3 40 0,48 0,49 0,72 0,49 ± 0,001 4 60 0,7 0,8 0,5 0,74 ± 0,004 5 80 0 985 0,98 0,23 0,99 ± 0,04 6 100 1,233 1,234 0,119 1,234 ± 0,001 Dựng đồ thị biểu diễn và lập đường chuẩn Diclofenac bằng phần mềm Excel 2010, kết quả được đồ thị như Hình 2.4 Hình 2.4. Phương trình đường chuẩn của Diclofenac ở bước sóng 281nm Ta thu được 3 phương trình đường chuẩn ở 3 bước sóng khác nhau: + Tại bước sóng 276 nm: Y = -0.2002x + 1.2522 (R2= 9905) (1) y = 0.2297x - 0.1667 R² = 0.9926 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 1 2 3 4 5 6 7 OD 281nm OD 281nm 18 + Tại bước sóng 278 nm: Y = -0.218x + 1.3677 (R2= 9917) (2) + Tại bước sóng 281 nm: Y = -0.2297x + 1.4413 (R2 = 9926) (3) Trong đó: x - nồng độ Diclofenac (mg/ml). y - giá trị OD tương ứng. R2 là hệ số tương quan. 2.3.6. Xác định lượng thuốc được hấp thụ vào vật liệu BC Lượng thuốc Diclofenac hấp thụ vào màng CVK được tiến hành thử nghiệm trên 2 mẫu: Mẫu 1: Dùng màng CVK có độ dày 0,5cm. Mẫu 2: Dùng màng CVK có độ dày 1cm. Cho 2 mẫu màng CVK đã sấy khô và 2 bình tam giác có chữa sẵn 100ml dung dịch Diclfenac 5%. Sau đó cho vào bể rung siêu âm để ở nhiệt độ 37oC, trong thời gian 30 phút, 1 giờ, 2 giờ lấy mẫu ra đo quang phổ để xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng đến khi giá trị OD không đổi hoặc có thay đổi nhưng không đáng kể, thực hiện lặp lại thí nghiệm 3 lần rồi lấy giá trị trung bình để tính toán. Lấy giá trị OD thu được thay vào phương trình đường chuẩn (1), (2), (3) tương ứng với các bước sóng ta được nồng độ Diclofenac (C%) trong dung dịch, từ đó tính được khối lượng Diclofenac có trong dung dịch theo công thức số 4[5]: C% (w/v) = [mct(mg)/Vdd(ml)] × 100% (4) Trong đó: C%: nồng độ phần trăm khối lượng – thể tích chỉ số mg chất tan có trong 10ml dung dịch Mct: khối lượng chất tan (mg) Vdd: thể tích của dung dịch (ml) Công thức tính lượng thuốc được hấp thụ qua vật liệu BC: 19 mBC = mBC(2) – mBC(1) (5) Trong đó: mBC là khối lượng thuốc được hấp thụ qua vật liệu BC (mg) mBC(1) là khối lượng của vật liệu BC lúc ban đầu (mg) mBC(2) là khối lượng của vật liệu BC sau khi hấp thụ thuốc (mg) Hiệu suất nạp thuốc vào màng được tính theo công thức sau: H = (𝑄𝑡−𝑄𝑑 ) 𝑄𝑡 × 100% Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào màng Qt: lượng thuốc lí thuyết Qd: lượng thuốc còn lại 2.3.7. Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc vào màng ở môi trường nước dừa già ❖ Môi trường khảo sát là pH = 2; pH = 4,5; pH = 6,8; pH = 7,4[1][24] ❖ Cách tiến hành: - Lấy vật liệu BC đã được nạp thuốc Diclofenac với độ dày 0,5cm hoặc 1cm và độ rộng (1,5x1,5) cho vào các bình chứa 900ml môi trường pH như trên. - Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ 37oC ± 0,5°C. - Sau các khoảng thời gian 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 24h, tiến hành rút mẫu để đo mật độ quang phổ của các mẫu đó. - Sau mỗi khoảng thời gian số lượng mẫu rút ra là 5ml và được bổ sung 5ml dung dịch đệm tương ứng. - Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần để tính toán lấy giá trị trung bình. ❖ Công thức tính tỉ lệ giải phóng thuốc [24]: 20 R% = 𝐶𝑡𝑥𝑉1+ ∑ 𝐶𝑖𝑥𝑉2 𝑖=𝑛−1 𝑖=1 𝑚 x100% (6) Trong đó: R: Tỉ lệ giải phóng thuốc; Ct: Nồng độ của Diclofenac trong dung dịch tại thời điểm t; V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau; n: Số lượng mẫu lấy ra từ dung dịch giải phóng; V2: Thể tích dung dịch đệm thêm vào; m: Khối lượng thuốc hấp thu vào các vật liệu CVK. 2.3.8. Phương pháp xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, sau đó lấy giá trị trung bình để tính toán. Các số liệu được phân tích, xử lý thông qua phần mềm Excel 2010 và phần mềm JMP phiên bản 9.0. Kết quả được biểu diễn dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Kiểm định giả thiết về giá trị trung bình của các mẫu bằng cách sử dụng test thống kê. Những khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi trị số p < 0,05. 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Màng CVK được nuôi cấy từ môi trường nước dừa già Khi được nuôi cấy tĩnh trong bình tam giác ở điều kiện nhiệt độ phòng vi khuẩn Gluconacetobacter Xylinus sẽ sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường để sinh trưởng và phát triển. Vi khuẩn làm quen với môi trường, làm giảm nhẹ pH môi trường bằng cách sinh ra acid. Sau đó vi khuẩn bắt đầu sản sinh ra một lớp màng CVK trên bề mặt môi trường có màu trắng đục có lẫn nhiều tạp chất, lớp màng này dày dần lên đến khi môi trường hết chất dinh dưỡng, sau 7-10 ngày nuôi cấy tĩnh màng có độ dày khoảng 0,5-1cm, vào ngày thứ 10 màng có độ dày 1cm. Tùy thuộc vào thời gian nuôi cấy mà ta thu được màng có độ dày khác nhau. Hình 3.1. Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già 3.2. Thu màng CVK thô từ môi trường Khi nuôi cấy tĩnh trong môi trường nước dừa già màng CVK có màu trắng ngà, bề mặt phẳng, trơn, chứa nhiều nước. Ở mỗi thời điểm khác nhau ra thu được màng có độ dày mỏng khác nhau. Thu màng nuôi cấy ở ngày thứ 5 thì độ dày của màng khoảng 0,3cm, đến ngày thứ 7 độ dày của màng 22 khoảng 0,5cm. Như vậy ta có thể chế tạo được màng CVK có độ dày theo mong muốn, như Hình 3.2 Hình 3.2. Màng thu được sau quá trình nuôi cấy Hình 3.3. Màng CVK được bảo quản trong tủ lạnh 23 3.3. Tinh chế màng CVK Mục đích: Loại bỏ các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn, giúp màng có thể hấp thụ được lượng thuốc tối đa. Sau khi tách ra từ môi trường nuôi cấy, màng CVK được rửa với nước rồi ngâm trong dung dịch NaOH 3%, sau 48 giờ ngâm dung dịch có màu nâu, tiếp tục rửa màng CVK với nước rồi ngâm với HCl trong 48 giờ. Cuối cùng lấy màng ra rửa với nước và ta thu được màng CVK tinh chế có màu trắng. Hình 3.4. Màng CVK đang được xả dưới vòi nước 3.4. Xác định lượng thuốc Diclofenac giải phóng khỏi màng CVK Màng sau khi hấp thụ Diclofenac được sấy khô ở nhiệt độ 120oC trong thời gian 20 phút. Cho vào 2 lọ chứa sẵn 1000ml dung dịch đệm có pH =2, pH =4,5, pH = 6,8, pH = 7,4. 24 Hình 3.5. Màng CVK thu được sau quá trình hấp thụ Cho màng BC vào các dung dịch đệm có độ pH lần lượt là 2; 4,5; 6,8; 7,4 (mỗi bình có dung tích 900ml). Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/ phút ở nhiệt độ 37oC Hình 3.6. Màng được cho vào máy giải phóng Sau 0,5h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 10h, 12h, 24h lấy mỗi mẫu 5ml dung dịch ra đo quang phổ đồng thời đưa lại vào các lọ vừa lấy 5ml dung dịch đệm tương ứng. 25 Hình 3.7. Mẫu được rút ra các lọ nhỏ để đo quang phổ Giá trị OD đo được tại các thời điểm lấy mẫu được trình bày ở các Bảng 3.1 và Hình 3.7, Bảng 3.2 và Hình 3.8. 26 Bảng 3.1. Mật độ quang khi tiến hành giải phóng thuốc tại các thời điểm khác nhau trong các môi trường pH khác nhau đối với màng không ép Độ dày của CVK (cm) pH Thời gian giải phóng thuốc (giờ) 0,5 1 2 4 6 8 10 12 24 0,5cm 2 0,12 ± 0,0021 0,14 ± 0,0033 0,16 ± 0,0028 0,26 ± 0,0045 0,32 ± 0,0043 0,37 ± 0,0058 0,46 ± 0,0034 0,65 ± 0,0028 0,75 ± 0,0045 1cm 0,15 ± 0,0039 0,17 ± 0,002 0,19 ± 0,004 0,3 ± 0,0028 0,36 ± 0,0067 0,49 ± 0,0035 0,57 ± 0,0048 0,68 ± 0,0057 0,82 ± 0,005 0,5cm 4,5 0,16 ± 0,0042 0,18 ± 0,0061 0,2 ± 0,0084 0,31 ± 0,0047 0,38 ± 0,0048 0,53 ± 0,0056 0,65 ± 0,0029 0,72 ± 0,0054 0,81 ± 0,0077 1cm 0,17 ± 0,0067 0,2 ± 0,0074 0,22 ± 0,0086 0,32 ± 0,0057 0,43 ± 0,0026 0,58 ± 0,0045 0,69 ± 0,0036 0,78 ± 0,0019 0,85 ± 0,0056 0,5cm 6,8 0,16 ± 0,0061 0,21 ± 0,0052 0,24 ± 0,0034 0,34 ± 0,0065 0,46 ± 0,0051 0,62 ± 0,0066 0,71 ± 0,0078 0,79 ± 0,0073 0,91 ± 0,0035 1cm 0,24 ± 0,0049 0,39 ± 0,0025 0,41 ± 0,0042 0,49 ± 0,0063 0,56 ± 0,0054 0,64 ± 0,0037 0,75 ± 0,0064 0,83 ± 0,0045 0,95 ± 0,0049 0,5cm 7,4 0,14 ± 0,0026 0,18 ± 0,0061 0,21 ± 0,0064 0,28 ± 0,0038 0,42 ± 0,0022 0,59 ± 0,0037 0