Khóa luận Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus trong môi trường chuẩn

đề tài Theo y học hiện đại bệnh dạ dày, tá tràng là kết quả của sự mất cân bằng giữa một bên là yếu tố phá hủy và một bên là yếu tố bảo vệ niêm mạc dạ dày, tá tràng. Bệnh có rất nhiều nguyên nhân gây nên nhƣ: chế độ ăn uống, do thuốc, Bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng có thể gây nhiều biến chứng vô cùng nguy hiểm nhƣ: xuất huyết, viêm teo niêm mạc, thủng dạ dày, nguy hiểm hơn có thể dẫn tới ung thƣ dạ dày. Đây là một trong những căn bệnh khá phổ biến hiện nay và có chiều hƣớng gia tăng trong các nƣớc đang phát triển. Hiện nay, trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, bệnh này chiếm tỉ lệ khá cao khoảng 30%, đứng đầu các bệnh về tiêu hóa. Omeprazole natri là loại thuốc đƣờng tiêu hóa với sinh khả dụng thấp. Omeprazol natri đƣợc dùng trong điều trị các bệnh về đau dạ dày, trào ngƣợc dạ dày - thực quản; loét dạ dày – tá tràng; hội chứng Zollinger – Ellison. Omeprazol natri là dƣợc chất thuộc nhóm ức chế bơm proton đƣợc sử dụng sớm và rộng rãi nhất trong việc điều trị viêm loét dạ dày tá tràng, đạt hiệu quả cao. Omeprazol natri rất dễ bị thủy phân trong môi trƣờng axit vì vậy các chế phẩm có chứa omperazol natri dùng đƣờng uống chủ yếu đƣợc điều chế dƣới dạng viên nén hay nang cứng pellet bao tan trong ruột [10]. Cellulose vi khuẩn (CVK) đƣợc tạo ra bởi vi khuẩn Gluconacetobecter xylinus có cấu trúc hóa học rất giống với cellulose ở thực vật, nó có tiềm năng nhƣ 1 hệ thống vận chuyển và phân phối thuốc do có cấu trúc mạng siêu mảnh cỡ nano của nó vì vậy hệ mạng lƣới cấu trúc CVK đƣợc nạp Omeprazole natri có thể tạo hệ trị liệu phóng thích kéo dài nhằm làm tăng sinh khả dụng của thuốc. Nghiên cứu này nhằm tăng hiệu suất hấp thụ thuốc Omeprazole natri của vật liệu CVK lên men từ môi trƣờng chuẩn. Kết quả nghiên cứu khác cho thấy CVK đƣợc lên men từ môi trƣờng chuẩn có tiềm năng làm hệ vận tải và phân phối thuốc qua đƣờng uống [20]. Nhờ vào những đặc tính vô cùng độc đáo trên của CVK nhằm tăng khả năng hấp thụ thuốc có kiểm soát và tăng sinh khả dụng của thuốc omeprazole natri trong điều trị bệnh nên chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc Omeprazole natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trƣờng chuẩn”. 2 2. Mục đích nghiên cứu - Đánh giá khả năng hấp thụ Omeprazole natri của vật liệu cenllulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong môi trƣờng chuẩn, từ đó ứng dụng vào trong y học chữa bệnh nhằm tăng khả năng hấp thụ thuốc Omeprazole natri, tăng hiệu quả chữa bệnh. - Tạo đƣợc màng CVK nạp thuốc Omeprazole natri từ môi trƣờng chuẩn. - Xây dựng hệ thống CVK hấp thụ thuốc Omeprazole natri. 3. Đối tƣợng , phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri của màng CVK đƣợc lên men từ môi trƣờng chuẩn. - Phạm vi nghiên cứu: Quá trình nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn * Ý nghĩa về khoa học - Tiếp tục nghiên cứu khả năng của màng CVK trong việc hấp thụ thuốc tại chỗ. Việc nghiên cứu sự hấp thụ thuốc Omeprazole natri vào màng CVK có thể giải quyết và khắc phục hạn chế của thuốc Omeprazole natri, để đạt đƣợc hiệu quả cao khi dùng thuốc để điều trị các bệnh lý. - Đánh giá những tiềm năng của màng CVK hấp thụ Omeprazole natri để từ đó chúng ta có thể đƣa ra các hƣớng nghiên cứu ở trên các loại thuốc khác. * Ý nghĩa về thực tiễn - Trong nghiên cứu, sử dụng màng CVK tạo ra hệ thống hấp thụ thuốc omeprazole natri định hƣớng để làm nên hệ thống khắc phục những hạn chế trong việc điều trị của thuốc omeprazole natri trên thị trƣờng. - Nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thuốc omeprazole natri. - Từ kết quả nghiên cứu đƣợc có thể ứng dụng vào đời sống thực tiễn. 3 NỘI DUNG Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK) và sinh vật tổng hợp cellulose 1.1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK) 1.1.1.1. Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Cấu trúc của CVK phụ thuộc khá chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. CVK có những tính chất rất đặc biệt trong môi trƣờng nuôi cấy tĩnh nhƣ: độ tinh khiết cao, khả năng đàn hồi rất tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, không độc hại và không gây ra dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn [4]. Cấu trúc của CVK đƣợc thấy dõ ở hình 1.1. Hình 1.1. Cấu trúc của cellulose vi khuẩn 1.1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn Ngày nay nhờ vào kỹ thuật và công nghệ hiện đại nhƣ phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân. Mà chúng ta đã xác định đƣợc cấu trúc của cellulose vi khuẩn, giúp chúng ta xác định đƣợc dạng kết tinh của cellulose. CVK đƣợc cấu tạo bởi hai loại cấu trúc tinh thể là cellulose Iα và Iβ. Trong các sợi nhỏ cellulose đều có sự tham gia của hai loại cấu trúc tinh thể này. Hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết thu đƣợc từ cellulose thực vật nhƣng chúng ta chƣa tìm ra cách để thu nhận đƣợc các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này. Cấu trúc CVK thì chứa nhiều tinh thể Iα hơn cấu trúc màng cellulose thực vật. Tỉ lệ này dao động trong khoảng 64%, đến 71% tuỳ vào loại vi sinh vật và nhiệt độ môi trƣờng. Ở cellulose thực vật, Iα chỉ chiếm khoảng 20%. [12]. 4 Giƣờng nhƣ cấu trúc tinh thể đƣợc coi là một yếu tố rất quan trọng để xác định đƣợc các tính chất của cellulose. 1.1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn - Kích thƣớc ổn định, sức căng và sức bền sinh học cao. - Khả năng giữ nƣớc đáng kể và hút nƣớc cực tốt, tính xốp chọn lọc - Độ tinh khiết cao so với các loại cellulose khác, CVK có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn và đây là nguồn nguyên liệu tái sinh. - Độ bền dai cơ học lớn, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, trọng lƣợng nhẹ, độ bền đáng kể,... [4], [5]. - Quan sát màng CVK trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) loại FE – SEM S4800 HITACHI với độ phân giải 1 nm cho thấy màng có các sợi cellulose rất nhỏ, mảnh, đồng nhất, liên kết chặt chẽ với nhau thể hiện ở hình 1.2. [4]. Hình 1.2. Cấu trúc sợi cellulose của màng CVK 5 1.1.1.1. Đặc tính của màng cellulose vi khuẩn Ở trong môi trƣờng nuôi cấy tĩnh, trên bề mặt của chúng tích lũy môi trƣờng dinh dƣỡng lỏng tạo thành lớp màng mỏng giống nhƣ da, sau đó tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm nhƣ giấy da với độ dày 0,01 – 0,5 nm. Sản phẩm này mang những tính chất rất đặc biệt nhƣ: độ tinh khiết cao, khả năng đàn hồi tốt, sự kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, không gây độc hại và không gây ra dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng ngăn cản khuẩn. cùng với những tính chất nổi trội này CVK đƣợc ứng dụng thực tiễn ở rất nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học. [4], [6]. 1.1.1.2. Ứng dụng của màng CVK Màng CVK đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ: thực phẩm, y dƣợc, sản phẩm rừng, mỹ phẩm, dầu mỏ và nhiều lĩnh vực khác [1], [2], [3], [4], [5],[8]. - Trong lĩnh vực thực phẩm: Làm kem, salad, thạch dừa, nƣớc uống siro không có cholesterol, thịt nhân tạo - Trong lĩnh vực y dƣợc: Màng trị bỏng, màng nano bọc thuốc, làm da nhân tạo, - Trong lĩnh vực sản phẩm rừng: Gỗ nhân tạo, giấy - Trong lĩnh vực mỹ phẩm: móng nhân tạo, 1.1.2. Vi sinh vật tổng hợp cellulose Cellulose vi khuẩn đƣợc tổng hợp nên từ rất nhiều loài vi sinh vật trong đó chủng G. xylinus. G. xylinus đƣợc nói đến khá nhiều. Những vi sinh vật tổng hợp hình thành nên cấu trúc của cellulose khác nhau thì cấu trúc của cellulose là khác nhau. Dƣới đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose. [3], [4]. 6 Bảng 1.1. Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học Acetobacter Lớp màng ngoại bào Dải cellulose Để giữ vi khuẩn trong môi trƣờng hiếu khí Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nƣớc thải Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nƣớc thải Agrobacterium Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nƣớc thải Pseudomonas Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nƣớc thải Rhizobium Sợi ngắn Tham gia vào hầu hết thực vật Sarcina Cellulose dị hình Không rõ Zoogloea Chƣa xác định rõ cấu trúc Sự kết bông trong nƣớc thải Trong đó, Gluconobacter đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất cellulose. Đặc biệt chủng G. xylinus là vi khuẩn tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và đƣợc các nhà nghiên cứu tập trung vào nhiều nhất vì nó có những đặc điểm nổi trội nhƣ: năng suất tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho nhiều mục đích sử dụng 1.1.2.1. Vi khuẩn G. xylinus G. xylinus là vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia. A. xylinum có thể đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau nhƣ từ nƣớc quả, hay từ một số loài thực vật nhƣ lá của cây cọ, từ giấm, từ thạch dừa, từ nấm Kombucha, trà,... [4]. 1.1.2.2. Đặc điểm hình thái của G. xylinus - G. xylinus là vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, dạng hình que, thẳng 7 hay hơi cong, không di động, không sinh bào tử, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. - Khi môi trƣờng thiếu chất dinh dƣỡng, G. xylinus sẽ biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt nhƣ: tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sau đó sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính giống. - Khuẩn lạc của G. xylinus có kích thƣớc rất nhỏ, bề mặt trơn và nhầy, khuẩn lạc lồi lên ở phần giữa, dày và màu sẫm hơn các phần xung quanh, phần rìa mép khuẩn lạc nhẵn. [4], [6]. 1.1.2.3. Đặc điểm sinh trưởng của G. xylinus G. xylinus có thể sử dụng rất nhiều nguồn cacbon khác nhau, tùy vào các chủng vi khuẩn mà nguồn đƣờng đƣợc sử dụng cũng khác nhau. G. xylinus có thể chuyển hóa glucose thành axit gluconic, và đây cũng là nguyên nhân làm pH trong môi trƣờng nuôi cấy sẽ giảm khoảng 1 đến 2 đơn vị trong khi nuôi cấy. Khi nuôi ở môi trƣờng thạch, khi còn non khuẩn lạc sẽ mọc riêng lẻ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau khoảng 3 đến 5 ngày. Đến khi già tế bào mọc dính thành cụm, và mọc theo đƣờng chúng ta cấy giống. [4]. G. xylinus có khả năng chịu đƣợc pH thấp, vì thế ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm axit axetic hay axit xitric vào môi trƣờng nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn và làm tăng hiệu suất tổng hợp cellulose. [5]. 1.1.3. Môi trường nuôi cấy G. xylinus - Môi trƣờng nuôi cấy G. xylinus là môi trƣờng đƣợc tổng hợp từ các nguồn dinh dƣỡng thiết yếu nhƣ từ nguồn cacbon, nito, các yếu tố vi lƣợng, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trƣởng. Nhu cầu sử dụng đƣờng của G. xylinus là khá lớn và giữ vai trò quan trọng trong khi tổng hợp CVK vì vậy đã có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác nhƣ: rỉ đƣờng, nƣớc mía, nƣớc dừa già, nƣớc vo gạođể làm nguyên liệu nuôi cấy G. xylinus - Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn G. xylinus tạo CVK chúng ta có thể tham khảo ở 1 số tài liệu. [5], [6], [7], [8], [11]. 8 Thêm dịch giống vào từng môi trƣờng với lƣợng nhƣ nhau và tối thiểu bằng 10% thể tích môi trƣờng. pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh bằng 4-6 (pH tốt nhất cho sự phát triển của G. xylinus là 6, pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác). [5]. Môi trƣờng chuẩn là môi trƣờng nuôi cấy thƣờng đƣợc sử dụng để sản xuất CVK, kể cả khi nuôi cấy tĩnh hoặc động, và nó đƣợc mô tả lần đầu tiên vào năm 1954 bởi Schramm và Hestrin. [11]. 1.2. Tổng quan về thuốc Omeprazole natri Công thức cấu tạo, tính chất hóa học, lý học, dƣợc động học, cơ chế tác động của thuốc Omeprazole natri đƣợc nêu chi tiết trong các tài liệu [1], [7], [8]. 1.2.1. Công thức cấu tạo - Công thức phân tử: C17H19N3O3S - Tên khoa học: 5 - methoxy- 2-[[(4 - methoxy - 3,5 - dimethyl – 2 - pyridinyl) methyl] sulfinyl] - 1H - benzimidazole. - Công thức cấu tạo của thuốc Omeprazole natri đƣợc thể hiện ở hình 1.3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của Omeprazole 1.2.2. Loại thuốc và Dạng thuốc * Loại thuốc: Thuốc chống các bệnh về dạ dày, tá tràng, ức chế bom proton. * Dạng thuốc: - Viên nang đến ruột mới tan 1mg – 20mg. 9 - Lọ bột tiêm 40mg kèm ống dung môi 10ml. - Viên bao phim 10 – 20mg. 1.2.3. Tính chất lý hóa của Omeprazole natri 1.2.3.1. Lý tính Omeprazol dƣới dạng bột trắng đục hoặc trắng ngà. Rất khó tan trong nƣớc, khó tan trong aceton và isopropanol, tan trong dicloromethan, methanol và ethanol, nóng chảy ở khoảng 1550C kèm theo sự phân hủy. [7]. 1.2.3.2. Hoá tính Omeprazol natri vừa có tính axit, vừa có tính bazo, hấp thụ rất mạnh bức xạ tử ngoại. Các tính chất này đƣợc ứng dụng trong định lƣợng, định tính và trong bào chế omeprazol natri. Độ ổn định của omeprazol natri phụ thuộc vào độ pH. Trong môi trƣờng axit, omeprazol natri nhanh chóng bị phân huỷ còn ở trong môi trƣờng kiềm thì omeprazol natri rất bền vững . 1.2.4. Dược lý và cơ chế tác dụng Omeprazol natri là một dẫn xuất của benzimidazole không có hoạt tính ức chế enzym ở môi trƣờng trung tính, nhƣng ở pH ≤ 5 omeprazol đƣợc proton hoá tạo thành 2 dạng acid sulphenic và sulphenamic. Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfohydryl của enzym H+ - K+ - ATPase ở tế bào thành nên ức chế bài tiết acid trong khoảng hơn 48 giờ. Do vậy Omeprazol natri đƣợc dùng để điều trị các rối loạn về dạ dày và thực quản: trào ngƣợc axit dạ dày thực quản, viêm loét dạ dày tá tràng. [9] 1.2.5. Dược động học Omeprazole natri là một chất làm giảm bài tiết dịch vị dạ dày do ức chế bơm proton ở các tế bào thành dạ dày. Thuốc có tác dụng nhanh và kéo dài. Omeprazole natri đƣợc hấp thu tốt ở ruột non sau khi uống khoảng 3 – 6 giờ. Sinh khả dụng sau khi uống liều đầu tiên đạt khoảng 35% và đạt tới trên 60% sau khi dùng vài liều. Sự hấp thu của thuốc phụ thuộc vào liều dùng, không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn. Thuốc liên kết cao với protein huyết tƣơng (khoảng 95%) và đƣợc phân bố vào các mô ở các tế bào thành dạ dày. Thời gian bán thải của thuốc ngắn (khoảng 45 phút), nhƣng tác dụng ức chế bài tiết dịch vị kéo dài, nên chỉ cần dùng một liều mỗi ngày. Omeprazole natri hầu nhƣ chuyển hoá hoàn toàn tại gan, đào thải rất chóng, chủ yếu qua nƣớc tiểu (80%), còn lại theo phân. Dƣợc động học của thuốc thay đổi 10 không có ý nghĩa ở ngƣời già hay ngƣời có chức năng thận suy giảm. Với những ngƣời suy giảm chức năng gan, sinh khả dụng của thuốc tăng và độ thải giảm, nhƣng không có biểu hiện tích luỹ thuốc trong cơ thể. [9] 1.2.6. Tác dụng, hạn chế của thuốc 1.2.6.1. Tác dụng của Omeprazole natri - Ức chế đặc hiệu với bơm proton H+/K+ ATPase ở tế bào thành dạ dày do đó giảm tiết axit ở dịch vị, tác dụng nhanh, kéo dài nhƣng hồi phục đƣợc. - Chỉ định: + Trào ngƣợc dịch dạ dày - thực quản. + Loét dạ dày - tá tràng. + Hội chứng Zollinger - Ellison. 1.2.6.2. Hạn chế của thuốc Omeprazole natri - Thƣờng gặp: có triệu chứng đau đầu, hay ngủ, chóng mặt, buồn nôn, táo bón, chƣớng bụng. - Ít gặp: Có thể gây ra tình trạng mất ngủ, mệt mỏi, ngứa, nổi mề đay, tăng tạm thời men gan transminase,... Hiếm gặp: Một số trƣờng hợp có thể đổ mồ hôi, phù ngoại biên, giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu có thể trầm cảm, rối loạn thị giác, chứng to vú ở đàn ông, đau cơ khớp, viêm thận kẽ, thay đổi số lƣợng tế bào máu; rối loạn thần kinh (kích động, trầm cảm) 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc Hiện nay trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu về ứng dụng màng CVK trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ: lĩnh vực thực phẩm ( màng bọc bảo quản trái cây, chất bảo vệ thực phẩm,)trong lĩnh vực y học ( tạo ruột giả, màng trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo trong việc điều trị các bệnh về tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da ,[2], [4], [5], [6], [8]. Về thuốc omeprazole natri: Đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến thuốc Omeprazole natri nhƣng hƣớng ứng dụng màng CVK làm tăng sinh khả dụng của Omeprazole natri vẫn còn rất ít ngƣời nghiên cứu do đó đề tài mở ra một hƣớng đi 11 mới nhằm tăng sinh khả dụng của Omeprazole natri đồng thời giảm các tác dụng phụ của thuốc. [16], [17], [18]. Ở Việt Nam: Vấn đề nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ G. xylinus ngày càng đƣợc quan tâm. Ông Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ G. xylius đạt hiệu cao. CVK cũng đã đƣợc nghiên cứu tạo màng trị bỏng , làm mặt nạ dƣỡng da, cố định bạc nano làm màng lọc nƣớc uống nhiễm khuẩn,[2], [4], [5], [6], [8]. Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ Quỳnh đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetbacter xylinus tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng”, kết quả nhận thấy màng CVK tạo bởi G. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi cellulose nhỏ, dai, độ bền cao, độ thấu khí cao, độ hút và giữ nƣớc tốt có triển vọng ứng dụng làm màng trị bỏng. [3] Đã có đề tài nghiên cứu liên quan đến thuốc Omeprazole. Omeprazole đƣợc sử dụng nhiều trong chữa trị các bệnh nhƣ: trào ngƣợc dịch dạ dày - thực quản, loét dạ dày - tá tràng, hội chứng Zollinger - Ellison nhƣng ít nghiên cứu nhằm hạn chế các tác dụng phụ cũng nhƣ yếu điểm của thuốc. [1], [7]. 12 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu - Thuốc Omeprazole natri dạng tinh khiết hay chế phẩm đƣợc bán trên thị trƣờng . - NaOH 0,1M và những hóa chất khác có nguồn gốc khác nhau nhƣ (đƣờng glucose, acid acetic, amoni sulfat, điamoni phosphate, NaOH,) và một số hóa chất khác ở dạng tiêu chuẩn phân tích đƣợc cung cấp từ Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. - Màng CVK đƣợc lên men từ môi trƣờng chuẩn gồm: Glucose (20g), pepton (5g), dinatri phosphat (khan) (NA2HPO4) (2,7g) (ngậm nƣớc 6,4g), cao nấm men (5g), acid citric (1,15g), nƣớc cất 2 lần (1000ml). 2.1.2. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu - Máy đo quang phổ UV - 2450 ( Nhật Bản) - Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ) - Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S - Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA ( Nhật Bản) - Buồng cấy vô trùng (Haraeus- Đức) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức) - Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức) - Máy nƣớc cất 2 lần (Hamilton - Anh) - Bể ổn nhiệt 1013(Đức) - Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump, Anh) - Máy lắc (Lab companion, SKF-2075, Hàn Quốc) 2.1.3. Vật liệu tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng CVK Đƣờng glucose, cao nấm men, peptone, Disodium phosphate hydro (Na2HPO4), axit citric, nƣớc cất, NaOH, HCl, đều đạt tiêu chuẩn phân tích 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị màng CVK 2.2.1.1. Tạo màng CVK thô 13 Tạo màng CVK từ môi trƣờng chuẩn. Quá trình lên men thu màng CVK thô đƣợc tiến hành thực hiện theo các bƣớc sau: [6], [11]. - Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng 2.1. Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng chuẩn tạo màng CVK Thành phần Trọng lƣợng Glucose 20g Peptone 5g Cao nấm men 5g Dinatri hidrophotphat (khan) (Na2HPO4) 2,7g Axit citric 1,15g Nƣớc cất 2 lần 1000ml - Bƣớc 2: Hấp khử trùng môi trƣờng đã pha ở 113oC trong 15 phút. - Bƣớc 3: Sau khi hấp xong đƣa môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong khoảng 15p rồi để nguội. - Bƣớc 4: Bổ xung thêm khoảng 10%-15% dịch giống và 2% axit acetic, lắc đều cho dịch giống phân bố đều khắp trong dung dịch. - Bƣớc 5: Sử dụng gạc vô trùng bịt kín miệng bình sau đó ủ tĩnh trong khoảng từ 10 - 14 ngày ở 28oC. - Bƣớc 6: Thu vật liệu Cellulose thô, rửa sạch dƣới vòi nƣớc. 2.2.1.2. Tạo màng CVK tinh khiết trước khi hấp thụ thuốc Xử lí màng CVK thô để thu đƣợc màng CVK tinh khiết chúng ta cần làm theo quy trình hình 2.1. 14 Lấy màng CVK thô Rửa bằng nƣớcc cất Bình 1000ml NaOH 0,3M (20 - 30 màng d=1,5cm) Hấp trong 113o C, 15 phút Xả nƣớc, 8 giờ Màng CVK tinh khiết Hình 2.1. Quy trình tạo màng CVK tinh khiết - Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK. [6]. - Kiểm tra sự hiện diện của protein trong màng CVK sau khi tinh chế: Định tính bằng thuốc thử là axit Trichloro axetic (CCl3COOH). - Màng CVK sau khi tinh khiết đƣợc đục nhỏ bằng khuôn tròn và đƣa vào 2 ống nghiệm: 15 Ống 1 (ống đối chứng) chứa màng và 10ml nƣớc cất 2 lần, Ống 2 (ống thí nghiệm) chứa 10ml nƣớc, sau đó nhỏ vài giọt axit Trichloro axetic vào ống 2, sau đó lắc đều. Nếu sau đó nƣớc trong ống 2 không bị đục, nhƣ ống đối chứng thì màng đã sạch. Ngƣợc lại, nếu bị đục thì màng chƣa sạch và tiếp tục xả nƣớc. 2.2.2. Quét phổ hấp thụ của thuốc Omeprazole natri Đem 2,0 mg chế phẩm trong dung dịch natri hydroxyd 0,1 M đi và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi, hòa tan tất cả với nhau. Đo phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thu đƣợc từ bƣớc sóng 200 nm đến 400 nm để tìm đƣợc bƣớc sóng hấp thụ cực đại của thuốc Omeprazole natri. 2.2.3. Chế tạo màng CVK dùng để nạp thuốc Omeprazole natri 2.2.3.1. Xây dựng đường chuẩn thuốc Omeprazole natri Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi chép mật độ quang hấp thụ của thuốc Omeprazole natri. Chuẩn bị mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau nhƣ sau: Pha dung dịch Omeprazole natri ở các nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,1mg/ml; 0,2mg/ml; 0,4mg/ml; 0,6mg/ml; 0,8mg/ml và 1mg/ml. Sử dụng dung môi là NaOH 0,1M. Đo UV ở bƣớc sóng hấp thụ cực đại của Omeprazole natri. Sau 3 lần đo, lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc omeprazole natri để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc omeprazole natri. 2.2.3.2. Nạp Omeprazole natri vào màng CVK Cho màng CVK vào 20ml dung dịch Omeprazole natri 30mg (dung môi NaOH 0,1M) thời gian 2 giờ ở 2 trƣờng hợp thể hiện ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Các trƣờng hợp hấp thụ thuốc Omeprazole natri Trƣờng hợp Đƣờng kính màng CVK Độ dày màng CVK Điều kiện nạp thuốc của màng TH1 d= 1,5cm 0,5cm - Lắc 100 vòng/phút - Nhiệt độ 40oC d= 1,5cm 1cm TH2 d= 1,5cm 0,5cm - Lắc 120 vòng/phút - Nhiệt độ 50oC d= 1,5cm 1cm 16 * Xác định lượng thuốc được nạp vào màng CVK. Sau 2 giờ đồng hồ lấy màng ra và xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng. Dùng máy đo quang phổ UV – 2450 để xác định đƣợc nồng độ thuốc, xác định khối lƣợng thuốc lƣợng thuốc Omeprazole natri trong màng CVK đã nạp thuốc. Hiệu suất nạp thuốc vào màng CVK đƣợc tính theo công thức (1) [14]. EE (%) = x 100% (1) Trong công thức (1): EE: Hiệu suất thuốc nạp vào màng (%). Qt: Lƣợng thuốc lí thuyết (mg). Qd: Lƣợng thuốc còn lại (mg). 2.2.3.3. Phương pháp xửu lý số liệu thống kê Lặp lại 3 lần mỗi thí nghiệm để lấy trung bình sau đó tính toán và phân tích thống kê và xử lý số liệu qua phần mềm Excel để phân tích phƣơng sai và xác định khoảng tin cậy. Tất cả các dữ liệu đƣợc trình bày theo giả định trung bình và độ lệch chuẩn “MEAN ± SD”. [15] 17 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu màng CVK thô và tạo CVK tinh khiết 3.1.1. Thu màng CVK thô Sau khoảng 10 - 13 ngày, thu màng CVK thô có độ dày 0,5cm - 1cm từ dịch nuôi cấy tĩnh G. xylinum nhƣ hình 3.1. a. Màng CVK trong bình nuôi cấy 18 Hình 3.1. Màng CVK thô lên men từ môi trƣờng chuẩn b. Màng CVK thô c. Màng CVK thô d = 1cm 19 Qua hình 3.1 chúng ta có thể có thể thấy đƣợc màng thô đƣợc tạo thành có tính chất dai, nhẵn;có màu vàng ngà, khả năng chịu lực cao và khả năng thấm hút của màng tốt. Kết quả thu đƣợc tƣơng tự nhƣ kết quả nghiên của tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự năm 2012. 3.1.2. Tạo màng CVK tinh khiết Sau khi sử lý màng CVK thô thì ta thu đƣợc CVK tinh khiết theo quy trình đã nêu ở hình 2.1. Màng CVK tinh khiết đáp ứng đƣợc yêu cầu sau: mềm mại, dễ gấp mà không cần phải thêm một vật liệu dẻo nào, có độ bền khi kéo và độ đàn hồi tốt. Hình ảnh màng CVK tinh khiếp đƣợc thể hiện ở hình 3.2. Hình 3.2. Màng CVK tinh khiết Màng CVK tinh khiết d = 1cm 20 * Thí nghiệm để kiểm tra độ tinh sạch của màng đƣợc trình bày ở hình 3.3. Hình 3.3. Thí nghiệm kiểm tra độ tinh sạch của màng Kết quả sau khi chúng ta cho thuốc thử là vài giọt axit Trichloro axetic vào ống thí nghiệm có chứa màng CVK và lắc lên thì dung dịch không bị vẩn đục, chứng tỏ màng CVK đã tinh khiết, sau đó dùng màng đó để hấp thụ thuốc. 3.2. Phổ hấp thụ tử ngoại của thuốc Omeprazole natri Quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thuốc từ bƣớc sóng 200nm đến 400nm, kết quả tìm đƣợc hai cực đại hấp thụ của thuốc tại bƣớc sóng 275nm (OD = 1,213) và 305nm (OD = 2,068) thể hiện ở hình 3.4. 21 Hình 3.4. Phổ hấp thụ tử ngoại của thuốc Omeprazole natri Kết quả tìm ra bƣớc sóng hấp thụ cực đại của thuốc tƣơng tự nhƣ kết quả ghi trong tài liệu Dƣợc điển Việt Nam là bƣớc sóng 276nm và 305nm. [1]. 3.3. Đƣờng chuẩn hấp thụ thuốc Omeprazole natri Ghi kết quả OD đã thu đƣợc và dựng đƣờng chuẩn của mẫu với C% trình bày dƣới bảng 3.1 Bảng 3.1. Mật độ quang c