Khóa luận Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi Soma và tạo hạt nhân tạo ở cây Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)

thể chịu đựng được những tổn hại ở mức tối thiểu. 33 2.6.3 Qui trình tạo hạt nhân tạo Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu tạo hạt nhân tạo  Với nguyên liệu là chồi (shootbud) Dùng dao cắt những chồi (shootbud) có kích thước 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro.  Với nguyên liệu là phôi vô tính Dùng dao tách rời các phôi hình tim. 34 Bước 2. Dùng pince cấy gắp các phôi/chồi cho vào môi trường tạo vỏ alginate. Bước 3 Dùng pipette 10ml hút môi trường alginate có chứa chồi/phôi nhỏ vào dung dịch CaCl2.2H2O 100mM trong 15 phút. Somatic embryos formed from cultured plant parts are ideal for artificial seed production. Bước 4. Dùng pince gắp hạt vào đĩa petri có chứa nước cất vô trùng để làm sạch lượng CaCl2.H2O còn sót lại. Bước 5. Cấy hạt nhân tạo vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng). 35 2.6.4 Các nhân tố cần thiết trong việc tổng hợp hạt nhân tạo Quá trình tổng hợp hạt nhân tạo từ phôi vô tính là một công việc được thực hiện với nhiều bước nhưng ít tốn kém. Để việc tổng hợp hạt thành công thì đòi hỏi một yêu cầu cơ bản đó là phải có một số lượng lớn các phôi vô tính chất lượng cao, có sức sống tốt, và các phôi này phải phát triển đồng bộ. Yêu cầu về một chất lượng tốt toàn diện của các phôi vô tính là yếu tố quan trọng hơn cả để đạt được tần suất biến đổi từ phôi đến cây con cao. Quá trình làm vỏ bọc cho phôi chỉ quan trọng trong sự vận chuyển phôi, nó không phải là một nhân tố làm giới hạn sự phát triển của hạt nhân tạo. Có rất nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi được cho vào môi trường có chất điện phân thích hợp như đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion. Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993). Alginate được sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi như tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dưỡng, có các đặc tính tương hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để được lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ được phôi khỏi những tổn thương bên ngoài. 2.6.5 Nguyên tắc và điều kiện khi tạo vỏ bọc bằng chất nền alginate sodium Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nước, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và csv, 1998). 36 Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na + có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lượng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+. Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ưu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất. Không như phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dưỡng, chất điều hòa tăng trưởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trưởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nước, hay các tổn thương cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi người ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật. Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dưỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cường khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dưỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi. 37 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Sinh học của Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thí nghiệm từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. 3.2 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu  Dụng cụ Tủ cấy, nồi hấp vô trùng, máy lắc, bình tam giác dung tích 300 ml, đĩa inox và các dụng cụ khác. Dụng cụ nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1,2 atm, 121oC trong 25 phút.  Mẫu cấy PLB (protocorm like body) cây lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) in vitro.  Môi trường nuôi cấy Các thí nghiệm được thực hiện trên 2 môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) và VW (Vacin và Went, 1949). Môi trường được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP, 2,4D, TDZ, và các chất khác (khoai tây, nước dừa, đường, than hoạt tính) tùy theo mỗi nghiệm thức thí nghiệm. pH môi trường 5,7. Thể tích môi trường là 70ml/bình tam giác. Bột sodium alginate, agar được dùng tạo gel và dung dịch CaCl2.2H2O 100mM giúp tạo vỏ cứng cho hạt. Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1,2 atm, nhiệt độ 121 0C trong 20 phút.  Điều kiện nuôi cấy Phòng dưỡng cây có nhiệt độ 250C± 20C, thời gian chiếu sáng 16 giờ, cường độ chiếu sáng 2.500 lux, ẩm độ 75-80%. 38 3.2.2 Phương pháp 3.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm Thực hiện 5 thí nghiệm theo các giai đoạn sau : - Giai đoạn 1 : tạo mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro. - Giai đoạn 2 : tạo phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro. - Giai đoạn 3 : tạo cây lan Hồ Điệp in vitro hoàn chỉnh từ phôi soma. - Giai đoạn 4 : tạo hạt nhân tạo từ phôi soma và tạo cây hoàn chỉnh từ hạt nhân tạo. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức cấy 3 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 mẫu.  Tổng số mẫu cấy ở mỗi thí nghiệm: 45 mẫu. 39  Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body) Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thí nghiệm gồm 13 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ (mg/l) 2,4-D BAP 1.1(đối chứng) VW 0 0 1.2 VW 0,01 0 1.3 VW 0,1 0 1.4 VW 1 0 1.5 VW 0 0,01 1.6 VW 0 0,1 1.7 VW 0 1 1.8 VW 0,1 0,01 1.9 VW 0.1 0.1 1.10 VW 0.1 1 1.11 VW 1 0.01 1.12 VW 1 0.1 1.13 VW 1 1 Các chất khác agar (8,6g/l) + sucrose (40g/l) + nước dừa (200ml/l) + than (1g/l) 40 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức: Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ Đƣờng (mg/l) Nƣớc dừa (ml/l) 2.1(đối chứng) VW 0 0 2.2 VW 20 100 2.3 VW 20 150 2.4 VW 20 200 2.5 VW 40 100 2.6 VW 40 150 2.7 VW 40 200 2.8 VW 60 200 2.9 VW 80 200 Các chất khác 2,4-D (0,1 mg/l) + BAP (0.01 mg/l) + agar (8,6 g/l) + than(1 g/l) 41  Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro Bước 1: Tăng sinh khối mô sẹo Thí nghiệm 3a : môi trường đặc, Thí nghiệm 3b : môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút), Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức: Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ của TDZ (mg/l) 3.1(đối chứng) VW 0 3.2 VW 0,1 3.3 VW 1,0 3.4 VW 2,0 3.5 VW 3,0 Các chất khác : đường (40 g/l) + nước dừa (200g/l) Có hay không có bổ sung agar (8,6g/l) tùy vào thí nghiệm Bước 2: Phát sinh phôi soma Mô sẹo thu được từ thí nghiệm 3 được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường đặc ½ VW. 42  Thí nghiệm tái sinh chồi từ phôi soma Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Hàm lƣợng (g/l) Khoai tây Than 4.1(đối chứng) MS 0 0 4.2 MS 30 0 4.3 MS 30 1 4.4 ½MS 30 1 4.5 VW 0 0 4.6 VW 30 0 4.7 VW 30 1 4.8 ½VW 30 1 Chất khác : đường (30g/l) + agar (8,6g/l) 43  Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo Thí nghiệm 5 : Ảnh hưởng của môi trường tạo vỏ hạt đến sự tái sinh cây con từ hạt nhân tạo Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức Nghiệm thức Môi trƣờng Hàm lƣợng sodium alginate (g/l) 5.1(đối chứng) MS 30 5.2 1/2MS 30 5.3 1/5MS 30 5.4 VW 30 5.5 1/2VW 30 5.6 1/5VW 30 Các chất khác : agar (8,6g/l) + đường (30g/l) Dùng dao phẩu thuật tách rời các phôi hình tim. Dùng pince cấy gắp các phôi cho vào môi trường tạo vỏ alginate. Dùng pipette hút môi trường alginate có chứa phôi nhỏ vào dung dịch CaCl2.2H2O 100mM. Sau 15 phút dùng pince cấy gắp hạt vào đĩa petri có nước cất vô trùng. Rửa hạt bằng nước cất vô trùng làm sạch lượng CaCl2.2H2O còn sót lại bên ngoài vỏ hạt. Sau khi thực hiện xong giai đoạn tạo vỏ hạt nhân tạo, hạt được cấy vào môi trường nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng). Quan sát khả năng tái sinh thành cây con của hạt. 44 3.2.2.2 Chỉ tiêu theo dõi  Thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB _Thời gian hình thành mô sẹo (NSC): tính từ ngày cấy chuyền đến khi có 50% mẫu cấy xuất hiện mô sẹo. _Màu sắc của mô sẹo. _Độ cứng của mô sẹo. _% mẫu cấy hình thành mô sẹo: (Số mẫu hình thành mô sẹo / Số mẫu cấy)*100 _% mẫu cấy hình thành mô sẹo+PLB: (Số mẫu vừa hình thành mô sẹo vừa hình thành PLB/ Số mẫu cấy) *100. _% mẫu cấy hình thành PLB: (Số mẫu hình thành PLB / Số mẫu cấy) *100. _% mẫu không phản ứng+mẫu chết: (Số mẫu không phản ứng và số mẫu chết/ Số mẫu cấy) *100.  Thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo _Hệ số tạo phôi: Số phôi tạo ra / Số mẫu cấy.  Thí nghiệm tái sinh cây con từ phôi soma _Tỉ lệ mẫu chết (%): (Số mẫu chết / Số mẫu cấy)*100. _Hệ số nhân chồi: Số chồi tạo ra / Số mẫu cấy. _Số lá /chồi: Tổng số lá / Tổng số chồi. _Số rễ /chồi: Tổng số rễ / Tổng số chồi. _Chiều dài lá (mm). _Chiều dài rễ (mm).  Thí nghiệm tạo hạt nhân tạo _Tỉ lệ nảy mầm: (Số hạt nảy mầm / Số hạt được cấy)*100.  Các chỉ tiêu được theo dõi 1 tuần/lần.  Số mẫu cấy ở mỗi thí nghiệm: 45 mẫu. 3.2.2.3 Xử lý số liệu Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 7.0 và Excel. 45 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  Các thí nghiệm tạo mô sẹo từ PLB (protocorm like body) Thí nghiệm 1 : Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) 2,4-D là chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm Auxin, còn BA là chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm Cytokinin. Sự kết hợp giữa 2 chất này ở một tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho mẫu cấy có hiệu quả tạo mô sẹo rất cao. Bảng 4.1 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến thời gian hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Nghiệm thức 2,4D (mg/l) BA (mg/l) Thời gian hình thành mô sẹo (NSC) Màu sắc của mô sẹo Độ cứng của mô sẹo 1 (ĐC) 0 0 19.88 Trắng xanh Xốp 2 0,01 0 20.88 Trắng xanh Xốp 3 0,1 0 20.55 Trắng xanh Xốp 4 1 0 20.55 Trắng xanh Xốp 5 0 0.01 19.66 Vàng xanh Chắc 6 0 0.1 19.77 Vàng xanh Chắc 7 0 1 20.00 Vàng xanh Chắc 8 0,1 0.01 20.22 Vàng xanh Chắc 9 0.1 0.1 19.44 Vàng xanh Chắc 10 0.1 1 20.44 Vàng xanh Chắc 11 1 0.01 20.44 Trắng xanh Xốp 12 1 0.1 21.00 Trắng xanh Xốp 13 1 1 20.44 Vàng xanh Chắc 46  Nhận xét: Kết quả cho thấy thời gian hình thành mô sẹo ở nghiệm thức 9 (môi trường VW bổ sung thêm 0.1 mg/l 2,4-D và 0.1 mg/l BA) là sớm nhất: 19.44 NSC. Tuy nhiên không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức. Về mặt hình thái của mô sẹo, chúng tôi nhận thấy:  Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ.  Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì mô sẹo thường có màu vàng xanh và khá chắc. Mô sẹo trắng xốp Mô sẹo vàng xanh Hình 4.1 Màu sắc của mô sẹo 47 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng 2,4-D và BAP đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Nghiệm thức 2,4D (mg/l) BA (mg/l) %mẫu cấy hình thành mô sẹo %mẫu cấy hình thành mô sẹo + PLB %mẫu hình thành PLB %mẫu không phản ứng+mẫu chết 1 (ĐC) 0 0 24.44 H 15.55 C 33.33 A 26.68 E 2 0,01 0 46.67 E 13.33 D 8.89 DE 31.11 D 3 0,1 0 53.33 D 15.56 C 6.67 EF 24.44 E 4 1 0 68.89 B 11.11 E 8.89 DE 11.11 G 5 0 0.01 62.22 C 15.56 C 15.56 B 6.67 H 6 0 0.1 48.89 E 22.22 A 11.11 CD 17.78 F 7 0 1 48.89 E 13.33 D 4.44 F 33.34 CD 8 0,1 0.01 80.00 A 8.89 F 6.67 EF 4.44 H 9 0.1 0.1 53.33 D 6.67 G 8.89 DE 31.11 D 10 0.1 1 42.22 F 11.11 E 8.89 DE 37.78 B 11 1 0.01 46.67 E 20.00 B 13.33 BC 20.00 F 12 1 0.1 35.56 G 13.33 D 15.56 B 35.55 BC 13 1 1 22.22 H 6.67 G 6.67 EF 64.45 A CV(%) 4,05 7.7 20 9.7  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Sau khoảng thời gian từ 30 – 45 ngày sau khi cấy, sự đáp ứng của mẫu cấy với các loại môi trường đã có sự khác biệt rõ ràng. Nghiệm thức 1 (đối chứng) có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo thấp, vì ở môi trường không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng, PLB có khuynh hướng tăng sinh tạo thêm nhiều PLB mới. 48 Riêng nghiệm thức 13 có tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cũng rất thấp, mẫu cấy phát triển yếu nên tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng khá cao (64.45%). Ở nghiệm thức 8 (2,4-D=0.1mg/l kết hợp BA=0.01mg/l) là môi trường có tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo lớn nhất: 80% và đây cũng là môi trường có tỉ lệ mẫu chết và không phản ứng ít nhất (4.44%).  Kết luận sơ bộ Ở nghiệm thức đối chứng, PLB cũng có khả năng tạo mô sẹo nhưng còn thấp, chủ yếu là tăng sinh PLB hoặc mẫu không phản ứng. Nghiệm thức 8 đạt tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất và tỉ lệ mẫu chết thấp nhất nên thích hợp để tạo mô sẹo lan Hồ Điệp từ PLB. Nghiệm thức 5 chứng tỏ việc sử dụng kết hợp 2,4-D và BA ở nồng độ cao cùng lúc đã gây ức chế quá trình phát triển của mẫu cấy PLB lan Hồ Điệp. Qua kết quả thu nhận được ở thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy:  Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D cao hơn BA thì từ protocorm sẽ phát triển thành mô sẹo nhiều hơn và mô sẹo có màu trắng xốp, dễ vỡ.  Ở các môi trường có tỉ lệ 2,4-D thấp hơn BA thì khả năng hình thành mô sẹo sẽ thấp, còn khả năng tăng sinh protocorm và tái sinh chồi tăng lên. Do đó mô sẹo thường có màu vàng xanh và khá chắc.  Ở môi trường mà tỉ lệ 2,4-D và BA quá cao thì mẫu rất dễ chết, khả năng tạo mô sẹo thấp. 49 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Đường đóng vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy mô, đây là nguồn cung cấp carbohydrate chủ yếu, giúp cho cây có khả năng sinh trưởng trong điều kiện in vitro. Bên cạnh đó, nước dừa cũng được sử dụng khá phổ biến do nước dừa có chứa Myo- Inositol, Riboflavin, Axit folic…có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu cấy trong quá trình tạo mô sẹo cũng như tái sinh cây. Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến thời gian hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro Nghiệm thức Đƣờng (g/l) Nƣớc dừa (ml/l) Thời gian hình thành mô sẹo (NSC) 1 (ĐC) 0 0 0.00 B 2 20 100 21.11 A 3 20 150 20.89 A 4 20 200 19.89 A 5 40 100 21.11 A 6 40 150 20.22 A 7 40 200 20.22 A 8 60 200 20.56 A 9 80 200 20.22 A CV(%) 13.8  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Nghiệm thức 4 có thời gian hình thành mô sẹo sớm nhất, có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng do ở nghiệm thức này không có sự xuất hiện mô sẹo. Bên cạnh đó, nghiệm thức 4 lại không có sự sai khác về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại (trừ nghiệm thức đối chứng). 50 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) Nghiệm thức Đƣờng (g/l) Nƣớc dừa (ml/l) %mẫu cấy hình thành mô sẹo %mẫu cấy hình thành mô sẹo + PLB %mẫu hình thành PLB %mẫu không phản ứng+mẫu chết 1 (ĐC) 0 0 0.00 F 0.00 G 71.11 A 28.89 A 2 20 100 60.00 C 15.56 B 11.11 C 13.33 D 3 20 150 55.56 D 17.78 A 8.89 CD 17.78 C 4 20 200 48.89 E 11.11 C 22.22 B 17.78 C 5 40 100 64.44 BC 8.89 D 8.89 CD 17.78 C 6 40 150 55.56 D 11.11 C 8.89 CD 24.44 B 7 40 200 80.00 A 8.89 D 6.67 D 4.44 E 8 60 200 62.22 BC 6.67 E 2.22 B 28.89 A 9 80 200 66.67 B 4.44 F 2.22 B 26.67 AB CV(%) 4,9 12.3 6.8 10  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường và nước dừa đến khả năng hình thành mô sẹo từ PLB của cây lan Hồ Điệp in vitro, 40 ngày sau cấy chúng tôi nhận thấy, trừ nghiệm thức đối chứng, các nghiệm thức còn lại đều xuất hiện mô sẹo. Mô sẹo ban đầu có màu trắng vàng xốp, sau đó chuyển sang màu vàng xanh và chắc. Trong đó, nghiệm thức 7 (VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa) có tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất: 80% mẫu, có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng: không có mẫu nào hình thành mô sẹo. Ngoài ra, nghiệm thức đối chứng còn có tỉ lệ mẫu không phản ứng và mẫu chết cao nhất (28.89%). Ngược lại, nghiệm thức 7 có tỉ lệ mẫu chết thấp nhất (4.44%). 51  Kết luận sơ bộ Về khả năng tạo mô sẹo, khi ta thay đổi nồng độ đường (0-80g/l) và nước dừa (0-200 ml/l) thì tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cũng thay đổi. Chứng tỏ nồng độ đường và nước dừa có ảnh hưởng lớn đến khả năng tạo mô sẹo của protocorm lan Hồ Điệp, có tác dụng kích thích khả năng tạo mô sẹo khi tăng nồng độ. Trong đó môi trường VW bổ sung 40g/l đường và 200ml/l nước dừa cho tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo cao nhất (80% mẫu) nên được khuyến khích sử dụng. 52  Các thí nghiệm phát sinh phôi soma từ mô sẹo Thí nghiệm 3 : Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng TDZ trong điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả năng hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) TDZ là chất kích thích sinh trưởng đặc biệt thuộc nhóm cytokinin. Ngoài tính chất tạo chồi của một cytokinin, nó còn có khả năng tăng sinh mô sẹo của một auxin, hoặc được dùng thay thế cho auxin hoặc tổ hợp auxin và cyokinin trong sự hình thành phôi ở nhiều loài cây khác nhau. Qua đó, thí nghiệm sử dụng TDZ trong sự hình thành phôi soma từ mô sẹo của cây lan Hồ Điệp in vitro được tiến hành qua 2 bước như sau:  Bước 1. Tăng sinh mô sẹo (45NSC) Thí nghiệm 3a : Nuôi cấy trên môi trường đặc Sau khoảng thời gian 30-45 ngày sau khi cấy, chúng tôi quan sát thấy mô sẹo nuôi cấy trên môi trường đặc phát triển tốt, sinh khối tăng nhanh và sự phát triển của mô sẹo ở các nghiệm thức khá đều nhau. Trong đó, phần lớn sinh khối tạo thành là mô sẹo, chỉ có một số ít là các cấu trúc giống phôi. Do đó, môi trường đặc chỉ thích hợp cho việc cảm ứng sự phát triển của mô sẹo. Hình 4.2 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường đặc TDZ 2mg/l. 53 Thí nghiệm 3b : Nuôi cấy trên môi trường lỏng và lắc (100 vòng/phút) Khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường lỏng lắc chúng tôi quan sát thấy lượng sinh khối tạo ra ít hơn so với nuôi cấy trên môi trường đặc, phần lớn có màu tối và khá chắc. Trong đó nghiệm thức 4 với nồng độ TDZ 2mg/l có lượng sinh khối cao nhất và màu sáng hơn các môi trường còn lại, đặc biệt xuất hiện một số mô sẹo có màu xanh. Hình 4.3 Mô sẹo lan Hồ Điệp trên môi trường TDZ lỏng lắc.  Bước 2: Phát sinh phôi soma (45NSC). Mô sẹo thu được từ thí nghiệm 3 được tách thành những cụm nhỏ và cấy chuyền sang môi trường ½ VW. Sau 45 ngày nuôi cấy chúng tôi nhận thấy xuất hiện nhiều các cấu trúc giống phôi trên bề mặt embryo callus (sinh khối thu được ở bước 1). Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi thì chúng ta có thể thấy rằng các dạng này có hình thái tương tự như hình thái phôi vô tính, cũng trãi qua tất cả các giai đoạn phát triển: hình cầu, hình tim, hình thuỷ lôi, hình lá mầm. Kết luận rằng đây chính là phôi vô tính của lan Hồ Điệp (phalaenopsis.sp) TDZ 1mg/l TDZ 2mg/l 54 Phôi hình cầu Phôi hình tim Phôi hình thuỷ lôi Phôi hình lá mầm Hình 4.4 Các giai đoạn phát sinh phôi ở lan Hồ Điệp Sự phát sinh phôi vô tính này có sự khác nhau đáng kể giữa các mẫu cấy chuyền từ những bình nuôi cấy ở thí nghiệm 3.  Mô sẹo từ các bình nuôi cấy đặc ở thí nghiệm 3a ban đầu tiếp tục gia tăng sinh khối, chỉ có 1 số ít phôi vô tính xuất hiện.  Mô sẹo từ các bình nuôi cấy lỏng lắc ở thí nghiệm 3b có kết cấu khá chắc và tạo ra lượng phôi vô tính khá nhiều. 55 Bảng 4.5 Số phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3a và 3b sang môi trường đặc 1/2VW CV(%) 23 18,3  Ghi chú: Các giá trị trung bình theo sau không cùng mẫu tự trong cùng một cột có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0,05.  Nhận xét: Kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu quả tạo phôi ở những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường TDZ lỏng lắc ở thí nghiệm 3b cao hơn hẳn so với những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường TDZ đặc ở thí nghiệm 3a. Trong đó, số phôi hình thành nhiều nhất (39,67 phôi) là ở những mẫu cấy được cảm ứng trên môi trường lỏng lắc với nồng độ TDZ 2mg/l. Trong khi nghiệm thức đối chứng không có phôi nào được tạo ra. Biểu đồ 4.1 Thí nghiệm gia tăng sự phát sinh phôi Nghiệm thức Nồng độ của TDZ (mg/l) Số phôi/mẫu cấy từ môi trƣờng đặc (3a) Số phôi /mẫu cấy từ môi trƣờng lỏng lắc (3b) 3.1 0 0.00 D 0.00 E 3.2 0,1 2.67 C 4.33 D 3.3 1,0 4.33 BC 12.67 C 3.4 2,0 10.67 A 39.67 A 3.5 3,0 5.67 B 20.00 B 56 TDZ 0mg/l (đối chứng) TDZ 2mg/l Hình 4.5 Phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3a sang môi trường đặc 1/2VW. TDZ 0,1mg/l TDZ 1mg/l TDZ 2mg/l TDZ 3mg/l Hình 4.6 Phôi được tạo ra khi cấy chuyền mô sẹo từ thí nghiệm 3b sang môi trường đặc 1/2VW. 57  Kết luận sơ bộ: Vậy, việc thêm vào môi trường nuôi cấy TDZ nồng độ 2mg/l là thích hợp nhất cho việc cảm ứng tạo phôi vô tính trên lan Hồ Điệp. Thêm vào đó, giai đoạn nuôi cấy mô sẹo trong điều kiện lỏng lắc là rất cần thiết cho việc cảm ứng phôi vô tính hình thành nhiều hơn và dễ nhận biết hơn. Môi trường nuôi cấy đặc ban đầu cũng tạo được phôi vô tính, tuy nhiên tỉ lệ phôi tạo thành không cao nên phương pháp này không cho được kết quả tốt nhất. 58  Thí nghiệm tái sinh chồi từ phôi soma Thí nghiệm 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường đến quá trình tái sinh cây lan Hồ Điệp in vitro từ phôi soma Khi tiến hành nuôi cấy tái sinh cây, người ta thường bổ sung vào môi trường rất nhiều chất dinh dưỡng. Trong đó, khoai tây được sử dụng khá phổ biến, bổ sung khoai tây vào môi trường nuôi cấy giúp cây in vitro tăng trưởng tốt. Bên cạnh đó, chồi lan khi phát triển thường tiết ra hợp chất phenol gây độc cho mẫu cấy. Do đó trong nuôi cấy người ta còn bổ sung thêm than hoạt tính để hấp thu bớt độc tố do mẫu cấy tiết ra. Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường có hoặc không có bổ sung khoai tây và than đến quá trình tái sinh cây từ phôi soma lan Hồ Điệp, 75 NSC chúng tôi thu được kết quả như sau: Bảng 4.6 Sự phát sinh hình thái của phôi soma ở các loại môi trường (75NSC) Nghiệm thức Xuất hiện mô sẹo Xuất hiện protocorm Xuất hiện chồi Xuất hiện rễ chồi MS X X MS+30g Khoai tây X X X MS+30g Khoai tây+1g Than X X X ½ MS+30g Khoai tây+1g Than X X X VW X X X VW+30g Khoai tây X X X VW+30g Khoai tây+1g Than X X X ½ VW+30g Khoai tây+1g Than X X  Ở môi trường MS không tạo chồi mà lại xuất hiện một ít protocorm + mô sẹo.  Ở môi trường MS+30g khoai tây có xuất hiện chồi và cả protocorm + mô sẹo.  Ở môi trường MS+30g khoai tây+1g Than có xuất hiện chồi nhiều hơn nhưng chủ yếu là protocorm và 1 ít mô sẹo.  Ở môi trường ½ MS+30g khoai tây+1g Than xuất hiện chồi nhiều hơn và 1 ít protocorm. 59  Ở môi trường VW có xuất hiện 1 ít chồi nhưng chủ yếu là mô sẹo + protocorm.  Ở môi trường VW+