Khóa luận Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây Lan Vanda, khảo sát sự hiện diện của Mycorrhiza trên một số giống Lan

cấy, có nguồn gốc thực vật tự nhiên, không gây độc đối với cây. Agar hoà tan thành một thể keo có thể bám nƣớc và hấp thụ các hợp chất. Lƣợng agar thƣờng dùng từ 0,6- 0,8%, nếu nồng độ thấp (0,4%) môi trƣờng mềm loãng. Nồng độ cao (1%) môi trƣờng bị cứng, khó cấy và mô khó tiếp xúc với môi trƣờng. 14 f) Nước Nên sử dụng nƣớc cất để bảo đảm chất lƣợng nƣớc, chiếm khoảng 95% môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài nƣớc cất có thể dùng nƣớc khử ion nhƣng không dùng nƣớc máy. g) Yêu cầu pH pH môi trƣờng cấy mô từ 5,0-6,5 và thƣờng đƣợc điều chỉnh để đạt khoảng 6,0. Môi trƣờng có pH thấp (thấp hơn 4,5) hoặc cao (cao hơn 7,0) ức chế sự phát triển của mô. Nếu pH bắt đầu khoảng 5,0-7,0, sau khi hấp sẽ giảm đi 0,3-0,5 đơn vị. 2.2.4 Các bƣớc nhân giống in vitro Bước 1: Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Mẫu cấy thƣờng là chồi, mắt lóng, đỉnh sinh trƣởng, lá, rễ... đem rửa sạch và khử trùng bằng cồn, natri hypochlorit, calci hypochlorit. Sau đó, mẫu đƣợc đƣa vào môi trƣờng tạo điều kiện phân chia và phân hoá mạnh. Đối với mẫu dễ bị hoá nâu, môi trƣờng thƣờng bổ sung than hoạt tính hoặc ngâm mẫu với ascorbic acid và citric acid (25-150 mg/l mỗi loại) trƣớc khi cấy (Bùi Bá Bổng, 1995). Bước 2: Tạo thể nhân giống in vitro Thể chồi (multiple shoot) và thể cắt đốt (cutting) cấy vào môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng (cytokinin, GA3...) để tạo mô sẹo, tạo cụm chồi. Bước 3: Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng nhất nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Sự nhân giống này tuỳ thuộc vào khả năng tạo chồi nách hoặc phát khởi chồi bất định từ những khối giống nhƣ callus dƣới gốc chồi, rồi ra rễ. Bước 4: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Các chồi, callus hay mô sẹo sẽ đƣợc cấy vào môi trƣờng có auxin để tạo rễ, tạo thân, lá đầy đủ. Cây phải đƣợc nuôi cấy trong điều kiện giống nhƣ bên ngoài vƣờn ƣơm để thuần hoá cho đến khi cây con khỏe mạnh. 15 Bước 5: Chuyển cây in vitro ra vƣờn ƣơm Cây con phát triển tốt trong môi trƣờng in vitro đƣợc lấy ra và rửa sạch môi trƣờng nhân tạo bám ở gốc rễ, rồi đem trồng ra vƣờn ƣơm. Do thay đổi về điều kiện sống, cây con dễ bị tress, mất nƣớc và mau héo nên vƣờn phải mát, ẩm độ cao. 2.2.5 Các yếu tố ảnh hƣởng nhân giống in vitro a) Lựa chọn mẫu cấy Mô non (chồi đỉnh), chồi nách hay chồi bất định tái sinh tốt hơn so với mô già của cùng một cây. b) Môi trường nuôi cấy Môi trƣờng MS (Murashige và Skoog) cho kết quả tốt trong nhân giống cây ban đầu và nhân chồi tiếp theo. Để tạo chồi nách nồng độ auxin và cytokinin tƣơng đối thấp, còn tạo chồi bất định cần nồng độ cytokinin cao và auxin thấp; Còn tạo mô sẹo thì ngƣợc lại. Môi trƣờng rắn hay lỏng cũng ảnh hƣởng đến khả năng phát triển rễ. Agar giúp cây đứng vững và tăng khả năng thoáng khí tạo điều kiện hấp thu dƣỡng chất. Đối với cây tiết các độc tố nhƣ phenol thì cần thêm than hoạt tính hay PVP (polyvinyl pyrrolidone) để hấp thụ các chất này giúp cây tăng trƣởng tốt hơn. Môi trƣờng có thể bổ sung các chất ngăn cản sự oxyt hoá phenols nhƣ citric acid, ascorbic acid, thiourea hoặc L- cystine. Hoặc bổ sung thêm amino acid nhƣ glutamine, arginine và asparagine. Thƣờng xuyên cấy chuyền vào môi trƣờng mới nhằm tạo điều kiện dinh dƣỡng đầy đủ cho cây nuôi cấy in vitro sinh dƣỡng tốt. c) Ánh sáng và nhiệt độ Ánh sáng: Cƣờng độ ánh sáng phù hợp trong khoảng 1000-5000 lux. Thời gian chiếu sáng thƣờng 16 giờ sáng/8 giờ tối. Nhiệt độ: Ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây in vitro. Nhiệt độ tối ƣu khoảng 20-250C. 16 2.3 Công nghệ tạo hạt nhân tạo 2.3.1 Khái niệm Năm 1978, Murashige phát hiện đầu tiên về kỹ thuật hạt nhân tạo. Năm 1987, Redenbaugh và cộng sự đã phát triển thành công kỹ thuật tạo hạt nhân tạo. Về cơ bản, hạt nhân tạo giống hạt tự nhiên, có cấu tạo là phôi vộ tính đƣợc bọc bởi lớp áo bên ngoài bởi lớp gel và có khả năng nẩy mầm nhƣ hạt tự nhiên, nhƣng khác biệt là hạt nhân tạo không có phôi nhũ. Hình 2-2: Cấu tạo hạt nhân tạo Năm 1988, McKersie và cộng sự đã tạo thành công hạt nhân tạo cây cỏ linh lăng, 65% hạt biến đổi sau bƣớc làm khô. Năm 1985, Kitto và Janick bọc hạt nhân tạo cà rốt bằng polyxyethylene đạt tỷ lệ sống 3%. Janick (1988), tạo hạt nhân tạo thành công trên cần tây. Gray (1987) thành công trên nho và cây cỏ nón. Năm 1988, lúa mì đƣợc tạo hạt nhân tạo do Carman và cộng sự. 2.3.2 Mục đích Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy in vitro, tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính, đã mở rộng phạm vi ứng dụng mới cho việc tạo hạt nhân tạo nhằm mục đích vận chuyển, bảo quản, lƣu trữ giống dễ dàng hơn. Trong điều kiện tối ƣu thì hạt sẽ nẩy mầm khỏi lớp vỏ nhân tạo còn không sẽ chuyển sang trạng thái ngừng sinh trƣởng cho đến khi gặp điều kiện thuận lợi. Ngoài ra, còn có nhiều lợi ích cho việc nhân giống nhanh những thực vật nhƣ: 17 - Không tạo đƣợc hạt - Hạt tạo thành nẩy mầm với một số lƣợng thấp - Khả năng hạt sống sót rất thấp sau khi bảo quản 2.3.3 Các nhân tố tạo hạt nhân tạo 2.3.3.1 Tạo phôi vô tính Phôi soma đƣợc hình thành không thông qua quá trình tạo mô sẹo đƣợc gọi là phôi vô tính, phôi vô tính có thể tái sinh cây hoàn chỉnh hoặc nhân sinh khối trực tiếp bằng hệ thống nuôi cấy phù hợp. Phôi soma khác với phôi hợp tử, phôi hợp tử thành lập do sự phối hợp giữa giao tử đực và giao tử cái, khởi đầu đƣợc thành lập có cấu trúc đơn cực nối liền với các mô mạch của mô sẹo. Con phôi soma thành lập từ mô tế bào , có cấu trúc lƣỡng cực và không có mạch nối liền với mô sẹo. Năm 1958, khi những tế bào phôi thực vật đầu tiên đƣợc thu nhận từ mô dinh dƣỡng của cây cà rốt (Daucus carota). Sau đó, hàng loạt các mô thực vật khác sử dụng để nuôi cấy tạo phôi (Triticum aestivum và Glycine max) Giai đoạn trƣớc khi hình thành tế bào soma gọi là tiền phôi (PEDC- preembryogenic determined cell) (Sharp và csv, 1980). Vì tế bào tiền phôi có thể phân chia để hình thành tế bào phôi trực tiếp, gọi là phát sinh phôi trực tiếp. Bảng 2.1: Sự phát triển của mô trên môi trƣờng nuôi cấy 18 Tuy có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần các chất kích thích sinh trƣởng nhƣ tế bào cây cà rốt, đậu ván… nhƣng cũng có nhiều tế bào lại cần auxin để phân bào trƣớc khi phát sinh tế bào phôi (IEDC- induced embryonic determined cell) (Sharp và scv, 1980). Và có nhiều tế bào hình thành phôi từ mô sẹo, sự phát sinh phôi tiến hành gián tiếp. Ngoài ra, còn sử dụng tế bào phôi hợp tử để tạo phôi, ngoại trừ hạt đƣợc tạo trong quá trình thụ phấn mà kiểu di truyền không xác định. 2.3.3.2 Cơ chế phát sinh phôi soma Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2 và 3, đƣợc nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979). Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trƣờng có auxin. Trong suốt giai đoạn này, những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trƣờng nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1. Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi trƣờng không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dƣờng nhƣ không biệt hóa. Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào, dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này đƣợc gọi là pha 2. Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua phôi hình tim và phôi hình thủy lôi. 19 Hình 2-3: Các giai đoạn phát sinh phôi soma 2.3.3.3 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate Có rất nhiều tác nhân tạo gel đƣợc sử dụng làm vỏ bọc cho phôi. Đó có thể là agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite (Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi đƣợc cho vào môi trƣờng có chất điện phân thích hợp nhƣ đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên kết ion. Phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993). Alginate đƣợc sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi nhƣ tính dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dƣỡng, có các đặc tính tƣơng hợp sinh học, khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để đƣợc lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ đƣợc phôi khỏi những tổn thƣơng bên ngoài. 20 Hình 2-4: Công thức hoá học của alginate Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nƣớc, muối của acid alginic, là một polyuronic bao gồm -D-mannuronate (M) và mảnh bên C5 -L-guluronate (G) (Aoyagi và csv, 1998). Nguyên tắc chính trong quá trình tạo vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl2.2H2O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na + có trong hỗn hợp sodium alginate với Ca2+ có trong hỗn hợp CaCl2.2H2O. Vỏ bọc cứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào số lƣợng ion Na+ trao đổi với ion Ca2+. Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ƣu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng thích hợp nhất. Không nhƣ phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dƣỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh dƣỡng, chất điều hòa tăng trƣởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối đa cho tăng trƣởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991; Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nƣớc, hay các tổn thƣơng cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi ngƣời ta có thể thêm vào chất nền gel chất kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật. Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dƣỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao (Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng 21 cao khả năng sống sót, phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cƣờng khả năng hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dƣỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi. 2.3.3.4 Quy trình tạo hạt nhân tạo Hình cầu Hình tim Hình thuỷ lôi Hình lá mầm Hình 2-5: Các dạng phôi soma Bƣớc 1: Dùng dao cắt chồi (shootbud) có kích thƣớc 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro. Sau đó, dùng dao tách rời các phôi hình tim. Bƣớc 2: Dùng pipette hay ống tiêm hút dung dịch sodium alginate rồi cho nhỏ từng giọt rơi xuống. Bƣớc 3: Dùng pince gắp chồi hay phôi đƣa vào trong giọt alginate đƣợc nhỏ xuống dung dịch CaCl2.2H2O 100 mM trong 15 phút. Bƣớc 4: Dùng pince gắp hạt cho vào nƣớc cất vô trùng trong 5 phút để làm sạch lƣợng CaCl2.2H2O còn sót lại. 22 Hình 2-6: Quy trình tạo hạt nhân tạo 2.4 Nấm rễ cộng sinh- mycorrhiza 2.4.1 Khái niệm Các loài thực vật khai thác từ đất trồng từ sự giúp ích của vi sinh vật có lợi đƣợc gọi là mycorrhiza (nấm vùng rễ). Các sợi nấm len lõi giữa các hạt đất, phát triển bên trong chất hữu cơ, thậm chí chúng còn xâm nhập vào vỏ côn trùng chết, từ đó sử dụng các dƣỡng chất hữu cơ và photphorus, sau đó trả lại cho cây trồng. Nhƣ vậy, có sự kết hợp cao độ giữa nấm đất và rễ cây trồng trong đó các nấm tạo nên mycorrhiza thƣờng là một số nấm Basidiomycetes, Ascomycetes, và Zygomycetes (theo Harley & Smith 1983, Kendrrick 1992, Brundrett 1992) Nấm rễ là một thuật ngữ đƣợc Frank sử dụng lần đầu vào năm 1885 khi phát hiện mối liên hệ giữa sợi nấm và rễ trên cây thông và một số cây lá rộng, đƣợc lấy từ chữ Hy Lạp “Mykes” và “Rhiza”. Sau đó ghép từ tiếng Anh “Myco” vào thành từ “Mycorrhiza” Ngƣời ta dự đoán, trên thế giới ngày nay có 1000 chi 200 họ thực vật có nấm rễ. Theo thống kê của Trappe năm 1962 có 535 loài nấm thuộc 81 chi 30 họ 10 bộ nấm có thể cộng sinh với trên 1500 loài cây gỗ khác nhau. Dung dịch sodium alginate Đƣa phôi/chồi vào giọt sodium alginate Rửa hạt trong nƣớc cất 5 phút để sạch CaCl2.2H2O Ngâm trong dung dịch CaCl2.7H2O 100 mM trong 15 phút 23 2.4.2 Các dạng mycorrhiza 2.4.2.1 Ectomycorrhiza Đƣợc hình thành chủ yếu trên cây rừng do nhiều loài nấm đảm và một vài loài nấm túi. Hầu hết bào tử của Ectomycorrhiza đƣợc sinh ra trên mặt đất và đƣợc phát tán nhờ gió. Sợi nấm của Ectomycorrhiza thƣờng sinh ra một lớp nấm phủ chung quanh phía ngoài của các rễ dinh dƣỡng. Các nấm này cũng đi vào bên trong rễ nhƣng chỉ phát triển xung quanh các tế bào vỏ rễ thay thế một phần phiến mỏng và hình thành cái gọi là mạng lƣới Hartig (Hartig net). Tuỳ thuộc vào màu sắc của nấm phát triển trên rễ mà Ectomycorrhiza có màu vàng, nâu, trắng, đen. 2.4.2.2 Endomycorrhiza Đƣợc hình thành trên hầu nhƣ tất cả cây trồng và trên một số cây rừng bởi các nấm tiếp hợp, chủ yếu là giống Glomus và một số nấm khác nhƣ Acaulospora. Endomycorrhiza cũng đƣợc hình thành bởi một vài nấm đảm, rễ cây có Endomycorrhiza bên ngoài giống với rễ không có mycorrhiza về hình dạng và màu sắc (Agrios, 1997) a)Vesicular –arrbuscular mycorrhiza (=arrgbusular mycorrhiza, VAM hoặc AM) Đây là nhóm phổ biến, hiện diện trên cả cây thân gỗ, là nhóm mycorrhiza quan trọng nhất trong Endomycorrhiza. Các sợi nấm mọc bên trong tế bào vỏ của rễ dinh dƣỡng hình thành vòi hút gọi là bụi (arbuscules) hoặc hình thành các u sƣng lớn dự trữ thức ăn gọi là túi nang (vesicules). Bào tử đƣợc hình thành trong đất. b)Erioid mycorrhiza Sợi nấm xoắn cuộn bên trong tế bào lông rễ của cây thuộc bộ Ericales. Sợi nấm mọc thƣa không lan rộng vào môi trƣờng đất, chúng có thể mọc từ bào tử nhƣng ít có khả năng tái sinh. c)Orchid mycorrhiza Sợi nấm xoắn cuộn bên trong rễ hoặc thân của các cây thuộc họ lan. Những cây lan nhỏ và một số cây trƣởng thành không có diệp lục tố (chlorophyll) đều cần cho sự sinh tồn của chúng. 24 2.4.3 Tác động có ích của mycorrhiza Mối quan hệ giữa lan và nấm là mối quan hệ mật thiết, trên 80% loài lan đều có mối quan hệ với nấm. Theo Currah et al (1997), nhóm nấm chính ở rễ lan là Basidiomycetes mặc dù cũng có Ascomycetes, tuy nhiên Ba sidiomycetes cũng là tác nhân gây bệnh trên những cây khác nhƣ nấm Rhizoctonia solani (theo Harley, 1982). Thậm chí, nấm cộng sinh trên loài lan này là tác nhân gây bệnh cho loài lan khác, và lan có khả năng điều tiết sự xâm nhiễm và phát triển của nấm cộng sinh. 2.4.3.1 Mở rộng diện tích hấp thu của rễ cây Sợi nấm cộng sinh là cơ quan hấp thu chủ yếu của rễ nấm, sợi nấm có thể kéo dài ra xung quanh rễ làm tăng tốc độ hút P lên gấp 6 lần. Tuổi thọ của thể sợi nấm cũng vƣợt xa lông hút. 2.4.3.2 Sự trao đổi dinh dƣỡng Do hạt lan không dự trữ chất dinh dƣỡng nên sự nẩy mầm của hạt phụ thuộc vào mycorrhiza. Mycorrhiza ở lan khác với loại mycorrhiza khác về bản chất trao đổi dinh dƣỡng. Sau khi hình thành mycorrhiza, cacbon hữu cơ và những chất dinh dƣỡng đi vào hạt. Bởi vì sự nẩy mầm của hạt lan khi không có sự cộng sinh với nấm đòi hỏi phải có các chất đƣờng, acid amin và vitamin nên ngƣời ta giả định rằng hạt lan nhận đƣợc các chất này từ nấm để nẩy mầm. Sau đó, nấm tiếp tục cung cấp nguồn năng lƣợng cho cây lan. Còn đối với các cây trong đất, do lƣợng P cố định, thƣờng các gốc phosphat kết hợp với Fe, Na, Al khó di động. Do đó, nấm rễ ngoại cộng sinh làm nhiệm vụ sản sinh enzyme phosphorase chuyển P không tan thành P hòa tan, tăng khả năng hấp thụ của rễ, cung cấp cho cây trồng. 2.4.3.3 Sự hình thành chất kích thích sinh trƣởng mycorrhiza Trong quá trình cộng sinh với rễ cây, nấm hình thành nhiều chất kích thích sinh trƣởng nhƣ auxin, cytokinin, gibberellin, vitamin B1, indole-3acetic acid (IAA). 25 2.4.3.4 Nâng cao sức chống chịu của cây Nhiều nghiên cứu đều chứng minh, sau khi nhiễm nấm cho cây, cây chủ có khả năng chống khô hạn, chống chịu mặn, nhiệt độ, độ ẩm và pH cực đoan, kim loại nặng. 2.4.3.5 Tăng khả năng kháng bệnh của cây trồng Năm 1942, Davis phát hiện nấm rễ cộng sinh có thể làm giảm bớt bệnh hại rễ. Năm 1968, 1982, 1994 nhiều tác giả đều đề cập đến nấm cộng sinh có thể giảm bệnh thối rễ thông xuống 25%, còn làm giảm bệnh do tuyến trùng, bệnh mốc sƣơng, bệnh bƣớu rễ (Trần Văn Mão, 1999) 2.4.4 Sự xâm nhập của mycorrhiza Nấm có thể xâm nhập qua hạt, rễ, hoặc thân. Đối với hạt, nấm mọc xuyên qua hạt vào bên trong lông biểu bì. Còn ở rễ, nấm thƣờng mọc xuyên qua vỏ rễ nơi gần đầu rễ lối vào là một tế bào “cửa” của ngoại bì. Nấm nhanh chóng lan rộng khắp vỏ. Trong mỗi tế bào vỏ rễ, sợi nấm xoắn cuộn dày đặc, đƣợc gọi là “ peleton” (Harley, 1982) 26 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng thí nghiệm Cả hai nội dung đều làm thí nghiệm trên cây lan 3.2 Thời gian thực hiện Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng nuôi cấy mô_ Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và phòng thực tập bệnh cây _ khoa Nông Học_ trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Phôi soma đem bọc vỏ hạt ở các nồng độ alginate khác nhau xác định ảnh hƣởng lên tính chất vỏ hạt nhân tạo. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Sử dụng môi trƣờng MS có nồng độ khoáng đa lƣợng khác nhau  xác định tỷ lệ sống của hạt nhân tạo. Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo. Hạt nhân tạo sau khi tạo xong đem lƣu trữ ở các môi trƣờng khác nhau  Xác định điều kiện môi trƣờng bảo quản tối ƣu. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Hạt nhân tạo cho nẩy mầm trên các giá thể khác nhau  xác định tỷ lệ nẩy mầm của hạt nhân tạo. 27 Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của mycorrhiza trên một số giống lan Lấy mẫu rễ lan Dendrobium lai, Dendrobium rừng, Catleya, Ngọc Điểm đem nhuộm quan sát hình dạng và sự có mặt của mycorrhiza trên các giống lan. 3.4 Vật liệu nghiên cứu 3.4.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu Thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autolave), máy đo pH, cân điện tử, đèn neon.... Dụng cụ: Pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, đĩa petri, đèn cồn, ống đong, pipet... 3.4.2 Mẫu sử dụng và điều kiện nuôi cấy Mẫu: Dùng phôi vô tính hay chồi cây lan. Điều kiện phòng nuôi cấy: Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux Nhiệt độ 26 ± 20C Ẩm độ 60-80% Thời gian chiếu sáng:16 giờ/ngày 3.4.3 Môi trƣờng sử dụng Môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm: Môi trƣờng MS (Murashige và Skoog 1962) Thành phần Dang sử dụng nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng (Macro MS) NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4.7H2O 370 CaCl2.2H2O 440 Khoáng vi lƣợng H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 28 (Micro MS) CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 ZnSO4.4H2O 8,6 Na2MoO4.2H2O 0,25 KI 0,83 Fe_EDTA FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA.2H2O 37,3 Vitamine Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Thiamine-HCl (B1) 0,1 Glycine 2 Pyridoxine-HCl (B6) 0,5 Các chất khác: Nƣớc cất Đƣờng: 30 g/l Agar: 8 g/l pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8 Ngoài ra còn sử dụng thêm môi trƣờng MS có bổ sung thêm sodium alginate và CaCl2.2H2O 7mM để bọc vỏ nhân tạo Nhuộm rễ: Nƣớc cất, Alkaline H2O2, HCl 1%, Acid Glycerol, Trypan blue. 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.5.1 Chuẩn bị môi trƣờng Tất cả môi trƣờng đều phải đƣợc khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở 1210C trong 25 phút, kể cả CaCl2.2H2O 29 3.5.2 Bố trí thí nghiệm Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan Vanda Các thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, lập lại 3 lần. Hạt nhân tạo sau khi bọc vỏ xong cho nẩy mầm trên môi trƣờng MS không có chất kích thích sinh trƣởng. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến sự hình thành hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ alginate 1 MS 10 g/l 2 MS 20 g/l 3 MS 30 g/l 4 MS 40 g/l 5 MS 50 g/l Ghi chú: Số nghiệm thức: 5 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 15 Tổng số hạt: 150 hạt Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tính chất vỏ hạt, tỷ lệ sống của phôi sau khi bọc vỏ hạt Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng tạo hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng Nồng độ alginate 1 MS 30 g/l 2 ½ MS 30 g/l 3 ¼ MS 30 g/l 4 1/8MS 30 g/l 30 Ghi chú Số nghiệm thức: 4 Số bình mỗi nghiệm thức:1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 12 Tổng số hạt: 120 Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi tỷ lệ sống của hạt nhân tạo trên môi trƣờng MS Thí nghiệm 3: Khảo sát môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo Nghiệm thức Môi trƣờng tao hạt Nồng độ alginate Môi trƣờng bảo quản 1 ½ MS 30 g/l Không có dinh dƣỡng 2 ½ MS 30 g/l Nƣớc cất 3 ½ MS 30 g/l Nƣớc đƣờng 4 ½ MS 30 g/l Agar 5 ½ MS 30 g/l Agar có đƣờng 6 ½ MS 30 g/l MS Ghi chú: Số nghiệm thức:6 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình: 10 Tổng số bình: 18 Tổng số hạt: 180 Các dạng môi trƣờng bảo quản hạt nhân tạo: Môi trƣờng không dinh dƣỡng: Bình nƣớc biển không, đem hấp khử trùng sau đó cho hạt nhân tạo vào. Môi trƣờng nƣớc cất: Nƣớc cất cho vào mỗi bình 150 ml đem hấp khử trùng Môi trƣờng nƣớc đƣờng: Nƣớc cất bổ sung 30 g/l đƣờng sucrose, cho vào mỗi bình 150 ml đem hấp khử trùng cho hạt nhân tạo vào. Môi trƣờng agar: Nƣớc cất cho vào 8,6 g/l agar, cho vào mỗi bình 70- 80ml đem hấp khử trùng. 31 Môi trƣờng agar đƣờng: Nƣớc cất có 8,6 g/l agar và bổ sung thêm 30 g/l đƣờng cho vào mỗi bình 70-80 ml đem hấp khử trùng. Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi màu sắc của phôi khi bảo quản, tỷ lệ sống của hạt nhân tạo khi bảo quản và khi cho nảy mầm trên môi trƣờng MS Thí nghiệm 4: Khảo sát sự nẩy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Nghiệm thức Môi trƣờng tạo hạt Nồng độ alginate Điều kiện nẩy mầm 1 ½ MS 30 g/l MS 2 ½ MS 30 g/l Cầu giấy 3 ½ MS 30 g/l Bông gòn Ghi chú: Số nghiệm thức: 3 Số bình mỗi nghiệm thức: 1 Số hạt mỗi bình:10 Tổng số bình: 9 Tổng số hạt: 90 Phƣơng pháp tạo giá thể cầu giấy, bông gòn Cầu giấy: Giấy thấm xếp thành 4 lớp cho vào bình đem hấp khử trùng, sau đó cho vào thêm 40 ml nƣớc cất đã hấp tiệt trùng, cho hạt nhân tạo nằm trên bề mặt giấy. Bông gòn: Bông gòn cắt lớp dày 2 cm cho vào bình đem hấp khử trùng, sau đó cho 40 ml nƣớc cất đã tiệt trùng , cho bông gòn thấm ƣớt rồi bỏ hạt nhân tạo lên bề mặt bông gòn Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hạt nhân tạo nẩy mầm trên các giá thể Nội dung 2: Khảo sát sự hiện diện của Mycorrhiza trên một số giống lan Lấy mẫu rễ lan Dendrobium lai, Dendrobium rừng, Cattleya, Ngọc Điểm bảo quản trong túi nylon. Mỗi giống lan thu 15 mẫu rễ. Rễ sau khi lấy xong phải cắt mỏng rồi đem nhuộm theo quy trình sau: Rửa sạch rễ thấm khô hấp trong nồi autoclave ở 1210 C-3’ Rửa rễ làm nhiều lần trong nƣớc cất 32 Ngâm rễ trong dung dịch Alkaline H2O2 từ 10’ – 30’ (tuỳ theo màu nâu của rễ ) Rửa rễ nhiều lần Ngâm rễ trong dung dịch HCl 1% trong 1-2 giờ. Khi ngâm trong hoá chất cần phải làm ngập mẫu rễ và lƣợng hoá chất gấp 20 thể tích rễ. Nhuộm rễ trong Acid Glycerol/Trypan Blue 30’ tại 900C trong tủ sấy. Tồn trữ mẫu trong Acidic Glycerol Quan sát hình thái và đánh giá tỷ lệ hiện diện của mycorrhiza trên các giống lan. 3.6 Xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm STATGRAPHIS 7.0 và phần mềm Excel 33 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phôi cây lan A: Phôi hình tim B: Phôi hình cầu C: Phôi hình lá D: Phôi hình thuỷ lôi Hình 4-2: Các dạng phôi vô tính Phôi soma là cấu trúc lƣỡng cực với cả đỉnh ngọn và vùng mô phân sinh cơ bản, mà khả năng tái sinh hình thành cành non và rễ. Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào đẳng kính, nhân to, tế bào chất đậm đặc và nhiều hạt tinh bột (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Những tế bào này có hàm lƣợng protein và RNA cao và trải qua các bƣớc: -Sự biệt hoá các tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi. -Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành thông qua các giai đoạn sau Phôi hình cầu Phôi hình thuỷ lôi Phôi hình tim Phôi hình lá Sau 4 tuần nuôi cấy, bắt đầu xuất hiện những tế bào có cấu trúc giống phôi, phôi hình cầu có cấu tạo non hơn, có màu xanh lá ít hơn so với những dạng phôi khác. 34 A: Phôi hình cầu B: Phôi hình tim C: Phôi hình thuỷ lôi D: Phôi hình lá Hình 4.2: Cấu trúc của phôi vô tính A: Nƣớc cất B: CaCl2.2H2O C: Sod