Khóa luận Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

nghiên cứu sử dụng nấm ĐTHT để điều trị thành công khá chứng bệnh như rối loạn máu, viêm phế quản mãn và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục. Viện nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc) cũng đã dùng nấm ĐTHT để điều trị cho các bệnh nhân bị liệt dương, kết quả đạt được khá tốt. Như vậy, có thể thấy rằng nấm ĐTHT là một trong những vị thuốc đông y có khả năng cải thiện đời sống tình dục trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tác dụng nâng đỡ bồi bổ cơ thể. Điều này đã được các nhà y học cổ truyền biết đến từ rất sớm. Theo các cuốn sách cổ xưa, nấm ĐTHT có vị ngọt, tính ấm vào hai kinh thận và phế, có công năng dưỡng phế, bổ thận, ích tinh được dùng để trị phế hư khái xuyễn, thận suy dương nuy (liệt dương), di tinh, lưng đau gối mỏi. Khó có thể kể hết các phương thuốc đông y có sử dụng ĐTHT, nhưng để cải thiện và phòng chống các bệnh rối loạn tình dục. Các nhà y học cổ truyền ở Trung Quốc, đã nghiên cứu dùng nấm ĐTHT điều trị thành công khá nhiều bệnh như: Rối loạn lipid máu (hiệu quả đạt 76,2%), viêm phế quản mạn tính và hen phế quản, viêm thận mạn tính và suy thận (đạt hiệu quả từ 44,7-70%), rối loạn nhịp tim (đạt hiệu quả 74,5%), tăng huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính (đạt hiệu quả 70%), ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục (đạt hiệu quả từ 31,57-64,15%) [11,12,13]. 4.1. Cải thiện chức năng gan: Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu thực hiện trên 70 bệnh nhân viêm gan B mãn tính và  xơ gan,  khi sử dụng nấm ĐTHT hoặc là hỗn hợp thảo dược với thành phần chính là nấm linh chi,  kết quả cho thấy có 68 % người bệnh có phản ứng lâm sàng tốt (với nhóm sử dụng ĐTHT) và chỉ có 57 % phản ứng tốt (với nhóm hổn hợp thảo dược chứa  nấm Linh chi). Điều này cho thấy nấm Đông trùng hạ thảo tốt hơn nấm linh chi trong việc điều trị bệnh gan hay xơ gan cho người [14]. Thí nghiệm khác cũng được thực hiện trên 22 bệnh nhân xơ gan ở liều lượng 6 g/ngày cũng cho kết quả rất khả quan khi thử nghiệm các chức năng gan sau thời gian điều trị bằng Đông trùng hạ thảo [10]. 4.2. Giải độc cho thận: Bác sĩ y học cổ truyền cho rằng nấm ĐTHT có tác dụng làm tăng chức năng thận. Rất nhiều công trình y học hiện đại xác nhân là nhờ nấm có khả năng làm tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục tiết. Thực hiện trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận mãn tính, theo liệu trình điều trị từ 3-5 g  ĐTHT/ ngày, kết quả cho thấy chức năng thận được cải thiện đáng kể. Mặt khác chức năng của hệ miễn dịch cũng được nâng cao hơn so với nhóm đối chứng. Một nghiên cứu khác trên 57 bệnh nhân bị hỏng thận do sử dụng gentamixin , người ta quan sát thấy bệnh nhân có sử dụng nấm ĐTHT với lượng 4.5 g/ ngày thì thận được bảo vệ tốt hơn, 89 % chức năng thận được hồi phục, giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chứng khi dùng giả dược hay sử dụng liệu pháp khác chỉ cho kết quả 45 %. Nghiên cứu ở 51 bệnh nhân bị suy thận có dùng nấm đông trùng hạ thảo với lượng 3-5 g/ngày thì nhận thấy chức năng thận và hệ miễn dịch được cải thiện. Thử nghiệm trên 69 bệnh nhân ghép thận, kết quả là nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps đã làm giảm độc tính của Cyclosporine trên thận [9,10]. 4.3. Hiệu quả giảm đường huyết:   Nấm ĐTHT có hiệu quả với hệ thống chuyển hóa glucose máu. Các nhà khoa học nghiên cứu ngẫu nhiên có đến 95 % bệnh nhân được cải thiện chỉ số đường huyết khi sử dụng 3 g nấm/ ngày. Hiệu quả này đạt được là do tác dụng của nấm ĐTHT trong việc tăng độ nhạy của chất insulin, và các emzyme chuyển hóa glucose gan, glucokinase và hexokinasse. Kết quả này khẳng định rằng việc sử dụng nấm ĐTHT trong việc kiểm soát chỉ số đường huyết mà không gây ra các phản ứng phụ [11] 4.4. Bệnh phổi: Tác dụng điều trị bệnh về đường hô hấp của nấm ĐTHT đã được Y văn cổ ghi nhận từ hàng nghìn năm nay bao gồm các bệnh hen, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính ( COPD ) và bệnh viêm phế quản. Nghiên cứu về lâm sàng tại trường Đại học Y Bắc Kinh trên 50 bệnh nhân hen suyễn khi được điều trị bằng nấm ĐTHT nhận thấy tình trạng bệnh nhân đã được cải thiện có khoảng 81,3 % số bệnh nhân sau khi sử dụng nấm 5 ngày so với nhóm điều trị bằng các thuốc kháng histamine thông thường [13]. 4.5. Bệnh tim mạch: Nấm ĐTHT thường dùng để điều trị rối loạn nhịp tim, ngoài ra nấm còn được sử dụng để điều trị bệnh tim, hay hồi phục sau khi đột quỵ. Với các bệnh nhân suy tim mãn tính thì việc sử dụng nấm ĐTHT  dài ngày và điều trị thông thường với các loại thuốc như Dioxin, hydrochlorothiazide, Dopamine, và Dobutamine sẽ thúc đẩy việc cải thiện  chất lượng cuộc sống nói chung, bao gồm cả thể chất lẫn tinh thần, sinh lý và chức năng tim mạch. Nấm ĐTHT còn là loại nấm có khả năng làm giảm cholesterol, gia tăng tỷ số HDL / LDL Cholesterol và giảm Triglyceride. 4.6. Nâng cao khả năng miễn dịch: Thí nghiệm ở 61 bệnh nhân bị bệnh lupus trong 5 năm kết quả cho thấy việc dùng nấm §ông trùng hạ thảo với liều 3 g/ngày và chất Artesmisinine với lượng 0,6 g/ngày đã làm giảm căn bệnh trên [9]. 4.7. Hỗ trợ điều trị ung thư: Nhiều nghiên cứu lâm sàng được tiến hành tại Trung Quèc và Nhật Bản trên những bệnh nhân bị ung thư cho kết quả khả quan. Nghiên cứu trên 50 bệnh nhân ung thư phổi đã được uống 6 g nấm ĐTHT/ ngày, cùng với liệu pháp vật lý trị liệu thì khối u đã giảm đi ở 23 bệnh nhân chiếm 46 %. Nghiên cứu trên một số các bệnh nhân bị các dạng ung thư khác nhau, khi sử dụng nấm ĐTHT trong 2 tháng với liều lượng là 6 g/ ngày, kết quả cho thấy có cải thiện về triệu chứng trên đa số bệnh nhân. Số lượng tế bào máu trắng bằng hoặc cao hơn 3000 mm3; ngay cả khi sử dụng liệu pháp chiếu xạ hay hóa chất thì các tham số miễn dịch cơ thể đã không bị thay đổi đáng kể trong khi kích thước khối u giảm đi nhiều trên một nửa bệnh nhân. Như vậy việc kết hợp sử dụng nấm ĐTHT với  các liệu pháp hóa trị cho kết quả khả quan giảm tác dụng phụ của các liệu pháp trên [11,12]. 4.8. Chống rối loạn tình dục: Nấm ĐTHT  dùng để điều trị rối loạn tình dục ở cả nam giới và nữ giới bao gồm giảm ham muốn, lãnh cảm hoặc liệt dương. Nghiên cứu được tiến hành tại Trung Quốc với 756 bệnh nhân bị suy giảm ham muốn, sau 40 ngày sử dụng 3 g ĐTHT/ ngày, thì có 64.8 % bệnh nhân đã cải thiện được tình trạng tình dục. Công trình nghiên cứu khác trên các đối tượng người cao tuổi, cả nam và nữ đều có triệu chứng giảm ham muốn, liệt dương và các bệnh suy giảm sinh l‎ý khác, sử dụng 3 g/ngày trong vòng 40 ngày, các chỉ số đo được như thời gian sống của tinh trùng, số lượng tinh trùng đã tăng lên, còn tỷ lệ khiếm khuyết của tinh trùng giảm xuống đối với đa số các đói tượng, hơn gấp đôi số người bị liệt dương cũng được ghi nhận có cải thiện về tình trạng tình dục. Đối với nữ giới, chứng đa khí hư, tình trạng rối loạn kinh nguyệt, ham muốn tình dục cũng được cải thiện. 4.9. Tăng sức bền, chống mệt mỏi: Theo báo điện tử thì khi sử dụng mỗi ngày liều 3 g nấm Đông trùng hạ thảo thì kết quả làm gia tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mãn tính. Năm 2004, tại Mỹ các nhà khoa học đã thí nghiệm cho người 40 - 70 tuổi, nếu dùng nấm Đông trùng hạ thảo trong 12 tuần thì có sự gia tăng sức bền thể lực. Sự gia tăng sức mạnh được thể hiện ở cả  hai yếu tố đó là gia tăng  Adenosine Triphophate ( ATP ) và giải phóng năng lượng trong ty lạp thể của tế bào cũng như hệ số sử dụng hiệu quả oxy của tế bào trong quá trình giải phóng năng lượng [9]. 4.10. Chống lão hóa: Nấm ĐTHT chứa nhiều chất SOD (Superoxide  Dismutase ) là chất chống oxy hóa cao, nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể. V. Công nghệ sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo và sản phẩm sử dụng: HiÖn nay nấm §THT đã ®­îc rÊt nhiÒu n­íc trªn thÕ giíi s¶n xuÊt thành viên dược liệu thực phẩm chức năng cho người trªn quy m« c«ng nghiÖp nh­ Trung Quèc, Hµn Quèc, NhËt Bản, Mü vµ Malaysia. NÊm §THT được s¶n xuất trªn m«i tr­êng nh©n t¹o tèt h¬n nhiÒu so víi §THT thu ®­îc ë ngoµi tù nhiªn. Cã rÊt nhiÒu s¶n phÈm ®­îc s¶n xuÊt tõ nấm §THT vµ ®­îc b¸n kh¾p mäi n¬i trªn thÕ giíi. 5.1. Sản phẩm CORDY-CGB: Dạng đóng gói: 90 viên nang/ hộp gồm 500 mg Đông trùng hạ thảo. Tổng cộng có 45 gam Đông trùng hạ thảo / hộp. Bột §ông trùng hạ thảo có chất lượng cao với hàm lượng Adenosine > 0.25 %, Mannitol > 7 % và Polysacchyride > 10 %. Mỗi ngày sử dụng khoảng 4-6 viên, trường hợp hỗ trợ điều trị xơ gan, suy thận, suy gan hay ung thư thì dùng liều lượng gấp 2 lần [11]. 5.2. S¶n phÈm CODYCAP – Đông trùng Hạ thảo Tenamyd: CODYCAP được sản xuất hoàn toàn từ Cordyceps Cephalosporium Mycelia nguyên chất, nguồn nguyên liệu tốt nhất từ nhà cung cấp nguyên liệu Đông trùng hạ thảo. Đặc điểm vượt trội của CODYCAP là hàm lượng rất cao Adenosine trong thành phần (5,088.90 mcg/g) (Tài liệu nghiên cứu thực tế bởi BIOFACT LIFE; Analytica Chimica Acta 567 (2006) 218-228) giúp cơ thể luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu quả và nhanh chóng xoá đi các triệu chứng mệt mỏi. Sản phẩm CODYCAP được chỉ định trong mọi trường hợp, dùng 2 viên/ngày/2 lần [10, 11]. VI. Nghiên cứu nấm Cordyceps militaris ở Việt Nam Hiện nay ở nước ta nghiên cứu về nấm Cordyceps đang trong giai đoạn mới đạt được một số kết quả. Việc nghiên cứu mới chỉ mang tính chất điều tra, phát hiện và thu thập chúng trong điều kiện Việt Nam. Năm 2009, Viện Khoa Học Lâm Nghiệp Việt Nam và trường Đại học Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm ĐTHT (Cordyceps nutans) tại khu bảo tồn Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang. Tác giả Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện được loài nấm Đông trùng hạ thảo và được giám định là loài Cordyceps nutans. Đây là loài nấm đầu tiên được mô tả và ghi nhận có phân bố tại Việt Nam [1]. Tại vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc Phạm Quang Thu đã phát hiện nấm ĐTHT Cordyceps Gunnii [2]. Tại vườn Quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nấm ĐTHT Cordyceps militari (NÊm nhéng trïng th¶o) [3]. Năm 2009, Phạm Thị Thùy đã thu thập ở vườn Quốc gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình nguồn nấm Cordyceps [6]. Về nấm Nhộng trùng thảo Cordyceps militaris lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam [1,2]. Loài nấm này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900 m đến 2.100 m so với mực nước biển. Ký chủ của loài này là nhộng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 – 6,5 cm, hình chuỳ, phần thân và cuống nhỏ, phần đầu( phần sinh sản) phình to có chiều rộng đến 0,6 cm. Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và nhiều mụn nhỏ. Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản. Túi bào tử có kích thước 300 – 510 µ x 3,5 – 5µ, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,5 – 5 µ [3]. Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm và nghiên cøu nấm Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những khu rừng nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 800 m đến 2000 m. Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militarris PGS.TS Phạm Thị Thuỳ, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người. Kết quả đã nghiên cứu và xác định được 3 loài nấm Đông trùng hạ thảo đó là: Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh. Cordycep sp1 ở Sơn Động, Bắc Giang. Tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris gồm chất Cordycepin, HEAA, một số vitamin và một số nguyên tố vi lượng. Trên đây là một số kết quả bước đầu về việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps ở Việt Nam. Vì vậy việc nghiên cứu nấm này cần thiết được tiếp tục để đi sâu và phát triển những nấm Cordyceps để làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người [5]. Như vây nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam là hoàn toàn cần thiết, đáp ứng nhu cầu đòi hỏi là bảo vệ sức khoẻ con người ở Việt Nam. PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Viện Bảo vệ thực vật - Đông Ngạc - Từ Liêm - Hà Nội 2. Thời gian nghiên cứu. Đề tài được thực hiện từ tháng 1/2010 đến hết tháng 5/2010 II. Vật liệu nghiên cứu 1. Đối tượng nghiên cứu. Chủng nấm Cordyceps militaris do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ - Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. 2. Vật liệu nghiên cứu. a. Một số hoá chất: + Agar + Pepton + Maltoza + Cao nấm men b. Muối khoáng: + KH2PO4 + MgSO4.7H2O + Chất bám dính, Tween 80 (Mỹ), Agral (Nhật) c. Dụng cụ và thiết bị cơ bản: Kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, nồi khử trùng, tủ sấy, tủ định ôn, tủ lạnh, buồng cấy, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, lọ thuỷ tinh, ống đong, phễu đong,… III. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1. Nội dung: 1.1 Nghiên cứu một số môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác định môi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris phát triển. 1.2 Nghiên cứu ¶nh h­ëng của thời gian đến sự phát triển của nÊm Cordyceps militaris. 1.3 Xác định giá trị dược liệu, thµnh phÇn hoá học của nấm Cordyceps militaris 2. Phương pháp nghiên cứu. 2.1. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác đinh môi trường tối ưu a. Một số môi trường sử dụng: + Môi trường Czapek – Dox: - Agar: 20 g - Saccaroza: 30 g - NaNO3: 2 g - K2HPO4: 1 g - MgSO4.7H2O: 0.5 g - KCl: 0.5 g - H2O: 1000 ml + Môi trường PDA: - Agar: 20 g - Saccaroza: 30 g - Khoai Tây: 300 g - H2O: 1000 ml + Môi trường MYPS: - Agar: 20 g - Đường kính: 10 g - Maltoza: 4 g - Pepton: 6 g - Cao nấm men: 4 g - H2O: 1000 ml b. Phương pháp tiÕn hµnh: Thí nghiệm 1: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 3 môi trường Czapek-Dox, PDA, MYPS trong tháng 2 để xác định môi trường tối ưu Bước 1: Cân số lượng từng thành phần của 3 môi trường. B­íc 2: Nấu từng loại m«i tr­êng cho tan các thành phần nguyên liệu, đo độ pH = 6 B­íc 3: §æ 1/2 phần m«i tr­êng vµo èng nghiÖm( 1/4 ®Õn 1/3 èng ) và để nguội, rồi gói lại. Phần môi trường còn lại đổ vào bình tam giác, mang tất cả đi khử trùng trong thời gian 60 phút, 1210C (với áp suất 1at) Bước 4: - Cho ra và nghiªng m«i tr­êng ở ống nghiÖm trong buồng cấy - Rót môi trưòng trong bình tam giác ra đĩa petri trong buồng cấy, để nguội. - Sau đó để nguội và khử trùng buồng cấy bằng tia UV ( 30 phút đến 60 phút ). B­íc 5: TiÕn hµnh cÊy chÊm ®iÓm trên đĩa petri và cấy rÝch r¾c trên từng ống nghiệm. B­íc 6: Gói ống nghiệm và đĩa petri cấy nấm, nu«i trong tñ định ôn, theo dâi hµng ngµy sự phát triển của nấm. Thí nghiệm 2: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 2 môi trường PDA và MYPS trong tháng 3 Phương pháp như thí nghiệm 1 Thí nghiệm 3: Tiến hành nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên 2 môi trường PDA và MYPS trong tháng 4 – 5 Phương pháp như thí nghiệm 1 c. Theo dõi sự phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris về hình thái, sinh trưởng và phát triển + Chỉ tiêu theo dõi hàng ngày: - Quan sát hình thái nấm bằng mắt thường: Quan sát màu sắc sự phát triển của sợi nấm cả mặt trước và mặt sau của khuẩn lạc để xác định sắc tố. Mô tả quá trình phát triển nấm. - Theo dõi và ghi chép nhiệt độ và ẩm độ trong phòng nuôi cấy. - Đo đưòng kính khuẩn lạc: Kể từ khi nấm hình thành khuẩn lạc sau 5,10,15,,20,25 ngày (dùng thước đo cm kẻ rõ) để đo đường kính, đo cả mặt trước và mặt sau của đĩa theo hai đường vuông góc, sau đó tính trị số trung bình theo công thức: D1 + D2 D = ------------- 2 Trong đó: D: đường kính trung bình của khuẩn lạc D1, D2: đường kính khuẩn lạc của hai đường vuông góc - Chụp ảnh sự phát triển của nấm theo thời gian phát triển 2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên môi trường tối ưu nhất - Nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên môi trường tối ưu nhất trong ba khoảng thời gian khác nhau (tháng 2, 3, 4). - Theo dõi hàng ngày và đo đường kính khuẩn trung bình của khuẩn lạc nấm ở các khoảng thời gian trên, nhận xét và mô tả sự phát triển. - Sau ba đợt thí nghiệm so sánh đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm và rút ra kết luận trong khoảng thời gian, nhiệt độ, ẩm độ nào nấm phát triển mạnh nhất. - Chụp ảnh sự phát triển của nấm (thông qua mô tả sự phát triển). 2.3. Xác định giá trị dược liệu và thành phần hoá học của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris a. Phương pháp tiến hành: - Nguồn nấm Cordyceps militaris làm khô trong không khí ở 400C và dùng máy nghiền thành bột - Lấy 0,1 g bột trên chiết 3 lần với nước sôi (3 x 10 ml). Lọc qua phễu và làm khô lạnh để thu chất chiết suất - Sau khi làm khô lạnh, phần còn lại được hoàn nguyên trong 10 ml methanol và lọc qua màng 0,22 µm. Trước khi phân tích tiếp HPLC, các mẫu được hoà tan trong 10 ml các dung dịch thích hợp - HPLC: Thể tích mẫu 5 µl; dung dịch rửa giải methanol: 20 mM phosphoric acid = tỷ lệ 15 : 85 trong 20 phút, phát hiện tại bước sóng 260 nm b. Định lượng chuẩn: Xác định Cordycepin hoặc Cordycepic Acid hoặc đường cụ thể bằng hợp chất N6 -(2- hydroxyethyl) – Adenosine, đây là chất chỉ thị để phát hiện trong các mẫu Cordyceps và không được tìm thấy trong các sinh vật. Hợp chất này và chất Adenosine và 3’ deoxyadenosine ( Cordycepin ) được sử dụng làm chất chỉ thị chất lượng để so sánh các chủng khác nhau của nấm Cordyceps c. Xác định một số vitamin và nguyên tố vi lượng theo phương pháp chung của phân tích hóa học Phần xác định giá trị dược liệu do Công ty cổ phần dược liệu Trung ương II thực hiện PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Như chúng ta biết, để nghiên cứu được môi trường nuôi cấy tối ưu nhất cho các loài nấm phát triển thì yếu tố quan trọng nhất quyết định là chủng giống. Trên cơ sở có chủng giống do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ cung cấp, chúng tôi đã nuôi cấy và đánh giá được khả năng phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên ba môi trường Czapek-Dox, PDA, MYPS. Từ đó xác định được môi trường tối ưu nhất cho nấm Cordyceps militaris phát triển. I. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps militaris để xác định môi trường tối ưu Môi trường nuôi cấy là yếu tố có tính chất quyết định đến sự phát triển và hình thành bào tử nấm. Môi trường thích hợp nhất là môi trường ở đó nấm phát triển mạnh, thể hiện ở đường kính khuẩn lạc lớn nhất và tạo ra số lượng bào tử nhiều nhất. Để xác định môi trường tối ưu cho sự phát triển của nấm Cordyceps militais, như phần vật liệu và phương pháp đã trình bày, chúng tôi tiến hành nuôi cấy nấm trên ba loại môi trường: Czapek-Dox, PDA và MYPS. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi được trình bày ở bảng 1 Bảng 1: Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Cordyceps militaris Môi trường Khả năng phát triển Nhiệt độ trung bình ( 0C) Ẩm độ trung bình (% ) Czapek-Dox + 23,1 85 PDA ++ MYPS +++ Ghi chú: + yếu ++ bình +++ tốt Qua kết quả ở bảng 1 cho thấy: trong ba môi trường nghiên cứu trên thì nấm Cordyceps militaris phát triển có khác nhau trên từng môi trường. So sánh sự phát triển của nấm trên các môi trường nuôi cấy chúng tôi nhận thấy: - Trên môi trường Czapek-Dox, nấm Cordyceps militaris phát triển yếu, gần như là không phát triển. Sau 5 ngày nuôi cấy 10 đĩa thạch của môi trường này thì nấm mới bắt đầu mọc ở 1 đĩa và chỉ có 1 chấm trắng nhỏ. Theo thời gian nuôi cấy, sau 10 ngày nấm không phát triển, đến ngày 25 nấm cũng không phát triển. Như vậy môi trường Czapek-Dox là không thích hợp để nuôi cấy nấm Cordyceps militaris. - Trên môi trường PDA, chỉ sau 3 ngày nuôi cấy, nấm Cordyceps militaris đã bắt đầu hình thành khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc tăng dần theo thời gian. Quan sát thấy bề mặt khuẩn lạc phồng xốp, nấm chưa ăn sâu vào môi trường, mặt sau khuẩn lạc phẳng, có màu trắng. Sau 10 ngày nuôi cấy thì đường kính khuẩn lạc phát triển nhanh đến ngày thứ 25, bề mặt khuẩn lạc lõm xuống, mặt sau khuẩn lạc môi trường có sắc tố màu vàng trắng ngà với nhiều múi khía. - Trên môi trường MYPS thì nấm Cordyceps militaris phát triển mạnh nhất, theo chúng tôi môi trường này có đủ thành phần dinh dưỡng giống như trong nhộng và sâu sống trong đất. Qua quan sát thấy bề mặt thạch ở mặt trước của đĩa petri, chúng tôi thấy sợi nấm ban đầu màu trắng xám, sau đó chuyển sang màu trắng xám vàng, sợi bông xốp, hơi ngắn, mọc chằng chịt và bám chặt vào mặt thạch. Quan sát mặt sau thấy sắc tố của nấm có màu vàng sáng, có múi khía màu vàng đậm. Để dễ dàng quan sát, trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi đã chụp được hình ảnh về sự phát triển trên ba môi trường của nấm Cordyceps militaris, kết quả thể hiện ở hình 2a va hình 2b Hình 2a: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trên ba loại môi trường sau 20 ngày nuôi cấy Hình 2b: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordyceps militaris trên ba loại môi trường sau 20 ngày nuôi cấy Qua bảng 1 và hình 2a, 2b chúng tôi khẳng định môi trường MYPS là môi trường cho nấm Cordyceps militaris phát triển tốt nhất, thứ 2 là môi trường PDA, nấm không phát triển trên môi trường Czapek-Dox. II. So sánh khả năng phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS Qua thí nghiệm 1, chúng tôi rút ra được kết luận môi trường MYPS là môi trường tốt nhất cho nấm Cordyceps militaris phát triển. Nhưng vì chưa có số liệu cụ thể, nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm 2 là so sánh khả năng phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS để đưa ra kết quả chính xác về môi trường tối ưu cho nấm Cordyceps militaris phát triển. Kết quả nghiên cứu thu được trình bày ở bảng 2 Bảng 2: Sự phát triển của khuẩn lạc nấm Cordycep militaris nuôi cấy trên hai môi trường PDA, MYPS Môi trường nuôi cấy Đường kính KL nấm (mm) qua các ngày nuôi cấy Nhiệt độ trung bình (0C) Ẩm độ trung bình (%) 5 10 15 20 25 PDA 10,5 17,0 23,0 28,5 33,5 24,7 84,2 MYPS 13,5 22,0 30,5 36,0 42,0 Kết quả ở bảng 2 chúng tôi nhận thấy trong điều kiện nhiệt độ trung bình là 24,70C và độ ẩm trung bình là 84,2% thì nấm Cordyceps militaris phát triển như sau: - Trên môi trường PDA: + Sau 5 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính trung bình là 10,5 mm. + Sau 10 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 17 mm + Sau 15 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 23 mm + Sau 20 ngày nuôi cấy, đưòng kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 28,5 mm + Sau 25 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc đạt 33,5 mm. + Ngày thứ 26 khuẩn lạc nấm bắt đầu phát triển chậm và gần như không phát triển nữa. - Trên môi trường MYPS nấm Cordyceps militaris phát triển nhanh hơn hẳn so trên môi trường PDA. Khuẩn lạc nấm phát triển mạnh trong 25 ngày đầu tiên. Cứ sau 5 ngày nuôi cấy đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm ở môi trường MYPS tăng lên trung bình từ 3-5 mm so với môi trường PDA, cụ thể: + Sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 13,5 mm. + Sau 10 ngày nuôi cấy, đường kình trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 22 mm. + Sau 15 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 30,5 mm + Sau 20 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 36 mm. + Sau 25 ngày nuôi cấy, đường kính trung bình của khuẩn lạc nấm đạt 42 mm. + Sau 26 ngày thì khuẩn lạc nấm phát triển chậm dần. Như vậy qua số liệu cụ thể cho thấy nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường MYPS là mạnh nhất. Vì thế chúng tôi đi sâu vào nghiên cứu môi trường này. Để dễ theo dõi, chúng tôi minh hoạ kết quả bảng 2 qua hình 3 và hình 4 Hình 2: Sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS sau 20 ngày nuôi cấy Đường kính trung bình của khuẩn lạc (mm) Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình 3: Sự phát triển của nấm Cordyceps militaris trên hai môi trường PDA và MYPS III. Mô tả một số đặc điểm của nấm Cordyceps militaris phát triển trên môi trường MYPS Sau khi đã lựa chọn được môi trường tối ưu nhất cho sự phát triển và hình thành bào tử nấm Cordycpes militaris đó là môi trường MYPS. Dựa trên chủng nấm do PGS.TS Phạm Thị Thuỳ cung cấp, chúng tôi đã sử dụng môi trường này để nuôi cấy nấm Cordyceps militaris. Bằng phương pháp quan sát bằng mắt thường về sự phát triển của nấm, chúng tôi nhận thấy lúc đầu sợi nấm có màu trắng, xốp, sau chuyển sang màu trắng ngà, rồi vàng, nấm ăn sâu vào môi trường, mặt sau khuẩn lạc nấm có những khía màu vàng tạo thành nhiều múi. Kết quả quan sát về hình thái nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris chúng tôi trình bày lên bảng 3. Bảng 3: Mô tả một số đặc điểm hình thái của nấm Cordycpes militaris phát triển trên môi trường MYPS đến 25 ngày nuôi cấy Tốc độ phát triển của khuẩn lạc Quan sát màu sắc bề mặt khuẩn lạc Quan sát sắc tố của khuẩn lạc Sau 2 ngày ở điều kiện nhiệt độ 24,50C, độ ẩm 82% thấy khuẩn lạc bắt đầu hình thành và chúng phát triển mạnh từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 25. - Khuẩn lạc có hình tròn. - Lúc đầu khuẩn lạc có màu trắng xám, đến ngày