Khóa luận Nghiên cứu phân lập nhóm vi khuẩn Lactic từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước ao nuôi cá Tra có đặc tính phân hủy phân tử tín hiệu và đối kháng Edwardsiella ictaluri

. Việc sử dụng thực phẩm vô trùng cho ấu trùng hào vô trùng có thể ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn đường ruột khác, do đó những hiệu quả được ghi nhận có thể qui cho chủng CA2. Tuy nhiên, tác giả không kiểm tra trường hợp cho ấu trùng hàu ăn tảo được bổ sung vi khuẩn chết để có thể khẳng định hiệu quả cải thiện tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống là do probiotic hay do dinh dưỡng. Nấm men được biết đến trong dinh dưỡng động vật bởi vì chúng đóng vai trò như một nguồn sản xuất polyamin, có thể nâng cao khả năng hoạt động của hệ thống ruột trưởng thành (Peulen et al., 2000). Gần đây, một số chủng nấm men rất có hiệu quả khi bổ sung vào khẩu phần ăn của cá đang biến thái. Tovar-Ramirez et al. (2002, 2004) đã nghiên cứu về enzym đường ruột được tiết ra từ cá vượt chẽm bột châu Âu (Dicentrarchus labrax) khi cho ăn khẩu phần gồm hỗn hợp nhiều dòng nấm men khác nhau của Saccharomyces cerevisiae và Debaryomyces hansenii. Sự tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng ăn khẩu phần ăn hỗn hợp này cao hơn so với lô đối chứng. Các tác giả này còn cho là hiệu quả phụ thuộc vào liều lượng của nấm men đối với hành vi ấu trùng, có thể được giải thích là do số lượng polyamine được tiết ra bởi nấm men trong khoang ruột của ấu trùng. Tuy nhiên, họ không chứng minh được hiệu quả probiotic của nấm men là do sự kích thích của enzym tiêu hóa của vật chủ hay hiệu quả kích thích miễn dịch. Tương tự, Wache et al. (2006) đã kiểm tra hiệu quả của hai chủng nấm men S.cerevisiae và một chủng D.hansenii như là nguồn thực phẩm bổ sung cho cá bột hồi cầu vòng (Onchorynchus mykiss). Các chủng S.cerevisiae var.boulardii và D.hansenii dường như kích thích sự trưởng thành của hệ thống tiêu hóa của cá bột hồi cầu vòng thông qua việc gia tăng hàm lượng enzym tiêu hóa theo một cơ chế mà đến nay vẫn chưa được biết đến. Ấu trùng của Artemia vô trùng được nuôi trong dung dịch có chứa mười chủng vi khuẩn (chết hoặc sống) kết hợp với bốn loại thức ăn tự nhiên vô trùng khác nhau (hai dòng nấm men bánh mì S.cerevisiae và hai dòng vi tảo Dunaliella tertiolecta), khác nhau về giá trị dinh dưỡng của chúng (Marques et al, 2005). Khi kết hợp loại thức ăn tự nhiên có chất lượng trung bình hay kém (như nấm men..) và vi khuẩn đã chết, chỉ có 5.9% tổng khối lượng sinh khối được sử dụng gây ảnh hưởng mạnh mẽ lên tỉ lệ sống của Artemia. Những ảnh hưởng này bị giảm thậm chí mất đi khi nguồn thức ăn có chất lượng cao được sử dụng, có thể là nhờ việc cải thiện tình trạng dinh dưỡng và sức khỏe nói chung của Artermia. Thêm vào đó, một vài nghiên cứu trên vi khuẩn probiotic (ví dụ như GR8, dòng vi khuẩn Cytophaga sp.) được bổ sung vào khi còn sống đã cải thiện một cách hiệu quả sự phát triển của Artermia, cao hơn nhiều so với bổ sung khi chết, không phụ thuộc vào loại thức ăn chính. Điều này cho thấy sự tương tác dương tính giữa vật chủ và vi sinh vật không liên quan đến giá trị dinh dưỡng của vi khuẩn hay của các loài ăn lọc như Artemia. Những thí nghiệm đã được miêu tả, đặc biệt là với các động vật vô trùng, cho thấy rằng sự chăm sóc tốt nhất cần phải được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm được bố trí để có thể làm phân biệt hiệu quả dinh dưỡng thuần túy của sinh khối vi khuẩn khi được bổ sung so với mối tương tác dương tính giữa vật chủ và vi sinh vật d. Chức năng kích thích miễn dịch Có rất nhiều báo cáo về ảnh hưởng của probiotic lên hệ miễn dịch của cá. Tuy nhiên, số liệu về ảnh hưởng của probiotic lên hệ miễn dịch của ấu trùng cá thì không đáng kể. Gần đây có hai nghiên cứu về việc dùng men bánh mì (S. cerevisiae) và β-glucan để kích thích hệ miễn dịch của ấu trùng Artemia chống lại Vibrio campbellii (Marques et al, 2006a,c). Hai dòng nấm men thuần chủng đột biến đẳng gen, mnn9, được dùng làm thức ăn cho Artemia vô trùng. Dòng mnn9 mang thể đột biến vô hại đã làm giảm nồng độ mannoprotein gắn trên màng tế bào và làm nâng cao nồng độ của chitin và glucan (Magnelli et al., 2002). Dòng nấm men này có thể giúp Artemia chống lại dòng vi khuẩn cơ hội (Vibrio proteolyticus) và dòng vi khuẩn gây bệnh bắt buộc (V. campbellii). Các nhà khoa học này cho rằng sự thay đổi thành phần màng tế bào (mật độ β-glucan cao) đã giúp Artemia chống lại cả hai chủng Vibrio chứ không phải nhờ giá trị dinh dưỡng tốt hơn của dòng mnn9. Các nghiên cứu theo hướng này có thể bổ sung dữ liệu về miễn dịch để bắt đầu làm rõ các cơ chế có liên quan. e. Cải thiện chất lượng nước ao nuôi Các chế phẩm probiotic cũng có tác dụng cải thiện môi trường nước ao nuôi trồng thủy sản (Verchuere et al., 2000). Trong nhiều nghiên cứu, chất lượng môi trường nước ao nuôi được cải thiện khi bổ sung probiotic, đặc biệt là khi bổ sung chế phẩm có chứa các chủng Bacillus sp. vì Bacillus là vi khuẩn gram dương rất hiệu quả trong việc biến đổi các chất hữu cơ thành CO2 so với vi khuẩn gram âm (Verchuere et al., 2000). Hơn nữa, các chế phẩm probiotic cũng có khả năng tạo nên sự cân bằng giữa NH3/NO2/NO3 trong nước với sự hiện diện của các vi khuẩn nitrate hóa như Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp.. Trong điều kiện môi trường nước ao nuôi có nồng độ NH3 cao, Nitrosomonas sp. sẽ chuyển đổi NH3 thành NO2 , sau đó Nitrobacter sp. sẽ chuyển đổi NO2 thành NO3 , là hợp chất không gây độc cho vật nuôi (Sahu et al., 2008). Các chủng vi khuẩn nitrate hóa sẽ tiết ra polymer cho phép chúng gắn kết trên bề mặt và hình thành nên biofilm. Và chính biofilm này đã làm giảm đến 50% tỷ lệ ammonia và nitrite trong môi trường ao nuôi (Sahu et a.l, 2008). Ngoài các vi khuẩn nitrate hóa, các chủng vi khuẩn phân hủy sulfur, methane cũng xó tác dụng cải thiện môi trường nước ao nuôi trồng thủy sản (Sahu et al., 2008). f. Can thiệp vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh Trong thập kỷ gần đây, cụm từ “quorum sensing”được nhắc đến như một quá trình thông tin giữa tế bào với tế bào vi khuẩn. Các phân tử dấu hiệu quorum sensing như AHL (N-acyl homoserin lactone) có liên quan đến quá trình điều hòa các nhân tố gây độc ở nhiều vi khuẩn gây bệnh. Sự phá vỡ hệ thống quorum sensing được xem là một liệu pháp chống lại sự xâm nhiễm mới trong nuôi trồng thủy sản. Furanone bị halogen hóa được tạo ra bởi tảo biển đỏ Delisea pulchra được xem là một chất ức chế quorum sensing đầy hứa hẹn. Khi bổ sung hợp chất này với nồng độ đầy đủ bảo vệ Branchionus, Artemia không bị ảnh hưởng bởi Vibrio (Tinh et al, 2007). 2.6 Bẻ gãy quá trình quorum sensing – cách tiếp cận mới trong việc kiểm sóat hệ vi sinh trong nuôi trồng thủy sản 2.6.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học. Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệu này. Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phân biệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm sóat việc biểu thị gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào. Quá trình này gọi là “quorum sensing”, cho phép một quần thể vi khuẩn kiểm sóat có phối hợp sự biểu thị gen của cả quần xã. Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm sự cộng sinh, độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học v.v… (Schauder & Bassler, 2001). Trong thế giới vi khuẩn tồn tại cả hai lọai ngôn ngữ quorum sensing, ngôn ngữ phổ biến và ngôn ngữ đặc hiệu, cho phép vi khuẩn giao tiếp trong cùng một lòai và giữa các lòai. Quá trình quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm được điều khiển bởi phân tử tín hiệu N-acyl homoserine lactone (AHL) (Fuqua et al., 2001). Ở vi khuẩn Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide có chiều dài 5 đến 17 amino acid (Meritt et al., 2003). Phân tử AHL đựợc chứng minh có liên quan đến các quá trình quorum sensing ở các vi khuẩn gây bệnh Gram âm ở người và thực vật, ví dụ như Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh et al., 2000), Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens (Whitehead et al., 2001), cũng như ở Vibrio harveyi (Manefield et al., 2000) và những vi khuẩn gây bệnh khác trên cá (Bruhn et al., 2005). 2.6.2 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh Khả năng phân hủy phân tử AHL dường như phân bố rộng rãi trong vương quốc vi khuẩn. Những enzyme có thể ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các lòai vi khuẩn thuộc nhóm ß-Proteobacteria (Zhang et al., 2002), α-Proteobacteria (Uroz et al., 2003) và γ-Proteobacteria (Uroz et al., 2003) cũng như ở một số lòai thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (Dong et al., 2002). Những lòai vi khuẩn này có thể khóa hệ thống quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọn lọc. Ví dụ như, đó là trường hợp của những vi khuẩn sinh sống ở gần các vi khuẩn điều khiển quá trình tiết ra chất kháng sinh thông qua quorum sensing (Pierson et al., 1998). Quá trình ức chế thật sự các hợp chất tín hiệu có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL lactonase và AHL acylase. Bên cạnh đó, enzyme acylase của các sinh vật bậc cao cũng có thể ức chế các phân tử AHL (Xu et al., 2003)(Xu et al., 2003). a. Enzyme AHL lactonase Dong và cộng sự (2000) sàng lọc hơn 500 chủng vi khuẩn thu từ thực địa và phòng thí nghiệm về họat tính ức chế phân tử AHL. Trong số này, 24 chủng cho các họat độ enzyme khác nhau trong việc lọai bỏ phân tử AHL. Enzyme chịu trách nhiệm cho việc ức chế AHL (AiiA) được phân lập từ chủng vi khuẩn có họat tính cao nhất, chủng Bacillus 240B1. Enzyme ở dạng tinh khiết ở nồng độ 50 mg/l, làm giảm nồng độ của N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone từ 20 µM xuống khỏang 5 µM sau 10 phút. Khi chạy quang phổ ion hóa phun điện tử của sản phẩm thủy phân cho thấy enzyme AiiA làm mở vòng lactone để tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine (Dong et al., 2001). Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy các gen mã hóa enzyme lactonase phân bố rộng rãi ở nhiều lòai Bacillus (Dong et al., 2004). Những enzyme đồng dạng này cho thấy 90% tương đồng về trình tự ở mức độ acid amin. Bằng chứng đầu tiên cho thấy sự ức chế bằng enzyme đối với phân tử AHL có thể được sử dụng như một biện pháp kiểm sóat sinh học được báo cáo trong nghiên cứu của Dong và cộng sự (2000). Trong nghiên cứu này, sự thể hiện của enzyme AiiA ở vi khuẩn Erwinia carotovora làm giảm việc tiết ra enzyme phân hủy thành tế bào bởi vi khuẩn gây bệnh xuống chỉ còn 10% và hầu như ức chế được các triệu chứng bệnh thối củ ở những thực vật mẫn cảm. Trong một nghiên cứu in vivo tiếp theo, Molina và cộng sự (2003) thử nghiệm hiệu quả của việc sử dụng một chủng Bacillus phân hủy AHL trong việc kiểm sóat sinh học đối với bệnh ở thực vật. Chủng Bacillus này có thể làm giảm bệnh thối củ gây ra bởi E. carotovora xuống còn 15% và bệnh mụn cây ở cà chua gây ra bởi Agrobacterium tumefaciens xuống còn 10%. Việc phân hủy phân tử AHL bởi chủng Bacillus mang lại một sự bảo vệ hiệu quả tương đương hoặc tốt hơn so với việc sản xuất kháng sinh bởi một chủng kiểm sóat sinh học Pseudomonas chlororaphis. Hơn nữa, việc phân hủy các phân tử AHL không chỉ có tác dụng phòng bệnh mà còn có tác dụng trị bệnh. Gần đây, những kết quả tương tự đã đạt được với chủng Bacillus thuringiensis (Dong et al., 2004). b. Enzyme AHL acylase Cùng một thời điểm khi Dong và cộng sự (2000) phát hiện chủng Bacillus có khả năng phân hủy AHL, Leadbetter và Greenberg (2000) phân lập được một chủng vi khuẩn có thể sử dụng phân tử AHL như là nguồn cacbon và nitơ. Chủng vi khuẩn này có tên là V. paradoxus VAI-C, được nuôi cấy làm giàu trong một môi trường có chứa 500 mg/l N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone như là nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Trong các thí nghiệm sử dụng AHL được dán nhãn phóng xạ, các nhà nghiên cứu đã suy ra rằng V. paradoxus cắt đứt phân tử AHL bằng một enzyme AHL acylase, giải phóng ra homoserine lactone và một acid béo. Sau đó, acid béo được sử dụng như nguồn cacbon thông qua đường dẫn ß-oxidation. Cần có thêm nhiều nghiên cứu trong tương lai để làm sáng tỏ bằng cách nào vi khuẩn đã lấy được nitrogen từ homoserine lactone. Gần đây, Flagan et al. (2003) phân lập một chủng vi khuẩn Arthrobacter sp. VAI-A, có khả năng phân hủy và sử dụng các sản phẩm phân hủy chứa nitrogen của phân tử tín hiệu AHL. Điều đáng quan tâm, là tốc độ tăng trưởng phụ thuộc nồng độ AHL và năng suất của hỗn hợp hai chủng Arthrobacter sp. và V. paradoxus VAI-C thì cao hơn so với các chủng này nuôi riêng lẻ. Điều này cho thấy rằng một cộng đồng nhiều lòai vi khuẩn có thể có một ảnh hưởng hiệp trợ trong quá trình chuyển đổi và khóang hóa tín hiệu quorum sensing. Gần đây, Lin và cộng sự (2003) phân lập một chủng vi khuẩn ức chế AHL, Ralstonia sp. XJI2B từ một màng sinh học đa lòai. Enzyme chịu trách nhiệm trong việc ức chế AHL (AiiD) được tinh chế và sau đó được ủ với phân tử N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone. Việc chạy quang phổ ion hóa phun điện tử đối với sản phẩm thủy phân cho thấy rằng enzyme AiiD thủy phân liên kết amid của phân tử AHL. Sự thể hiện của enzyme AiiD ở vi khuẩn P. aeruginosa tái tổ hợp PAO1 ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm giảm tỉ lệ chết của giun tròn Caenorhabditis elegans xuống còn 15%, so với chủng vi khuẩn không tái tổ hợp. 2.6.3 Những triển vọng của việc bẻ gãy quá trình quorum sensing Những kết quả đạt được bằng cách sử dụng những kỹ thuật bẻ gãy hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh cho thấy rằng đây là một biện pháp đầy hứa hẹn thay thế cho việc sử dụng kháng sinh trong việc chống lại sự nhiễm khuẩn. Cách tiếp cận mới này cũng có thể có giá trị trong nuôi trồng thủy sản, khi mà mối liên hệ giữa quorum sensing và sự thể hiện yếu tố độc lực ở một số vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy sản đã được chứng minh. Tuy nhiên, vẫn còn thiếu những số liệu về ảnh hưởng của quorum sensing đến độc lực của các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản. Nghiên cứu cơ bản trong lĩnh vực quorum sensing chắc chắn sẽ cung cấp những sự hiểu biết chính xác hơn về cơ chế mà sự biểu hiện của các gen điều khiển bởi quorum sensing được kích họat hay bị ức chế. Cho đến hiện nay, đa số các nghiên cứu đã được tiến hành đối với hệ thống quorum sensing do AHL làm trung gian của các vi khuẩn gây bệnh gram âm trên người và thực vật. Tuy vậy, có thể mong đợi những kỹ thuật bẻ gãy hệ thống quorum sensing của những vi khuẩn gây bệnh khác sẽ được phát triển trong tương lai. CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu - Thời gian thực hiện : 05/04/2010 – 28/06/2010. - Địa điểm thu mẫu : Các ao nuôi cá tra giống và thương phẩm thuộc tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long. - Địa điểm nghiên cứu: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Các quần thể vi sinh vật thu nhập được từ hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa của cá tra khỏe mạnh, hệ sinh vật trong môi trường nước và bùn trong ao nuôi cá Tra từ các vùng nuôi: Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang. Hệ vi sinh vật giàu vi khuẩn lactic acid của thực phẩm lên men truyền thống và sữa. Tổng cộng có 50 mẫu nguyên liệu, sau quá trình sàng lọc qua môi trường chuyên biệt cho vi khuẩn lactic, kết quả thu được 64 khuẩn lạc. Bảng 3.2.1.1. Danh sách mẫu dùng phân lập vi khuẩn lactic STT Kí hiệu khuẩn lạc Địa điểm thu mẫu Ghi chú A Hệ tiêu hóa cá thịt (20 khuẩn lạc) 1 T.VL1.1 Ao nuôi cá thịt Vĩnh Long 1 con/mẫu 2 T.VL1.4 1 con/mẫu 3 T.VL1.5 1 con/mẫu 4 T.VL4.1 1 con/mẫu 5 T.VL4.2 1 con/mẫu 6 T.TG1.1 Ao cá thịt Tiền Giang 1 con/mẫu 7 T.TG1.4 1 con/mẫu 8 T.TG1.5 1 con/mẫu 9 T.DT1.3 Ao nuôi cá thịt Đồng Tháp 1 con/mẫu 10 T.DT1.2.1 1 con/mẫu 11 T.DT1.2.2 1 con/mẫu 12 T.DT1.1.1 1 con/mẫu 13 T.DT1.1.2 1 con/mẫu 14 T.DT1.1 1 con/mẫu 15 T.DT1.2 1 con/mẫu 16 T.DT2.1 1 con/mẫu 17 T.DT2.2 1 con/mẫu 18 T.DT3.1 1 con/mẫu 19 T.DT3.2 1 con/mẫu 20 T.DT3.3 1 con/mẫu B Hệ tiêu hóa cá giống (15 khuẩn lạc) 21 G.VL1.5 Ao nuôi cá giống Vĩnh Long 5 con/mẫu 22 G.VL1.7 5 con/mẫu 23 G.VL1.9 5 con/mẫu 24 G.VL1.10.1 5 con/mẫu 25 G.VL1.10.2 5 con/mẫu 26 G.TG1.1 Ao nuôi cá giống Tiền Giang 5 con/mẫu 27 G.TG1.3 5 con/mẫu 28 G.TG1.4 5 con/mẫu 29 G.TG1.5 5 con/mẫu 30 G.DT 1.1 Ao nuôi cá giống Đồng Tháp 5 con/mẫu 31 G.DT1.2 5 con/mẫu 32 G.DT2.2 5 con/mẫu 33 G.DT3.1 5 con/mẫu 34 G.DT3.2 5 con/mẫu 35 G.DT5.1 5 con/mẫu C Nước ao nuôi cá tra (24 khuẩn lạc) 36 N.T1D5 Nước của ao nuôi cá giống Đồng Tháp 1000ml/mẫu 37 N.T1D6 1000ml/mẫu 38 N.T3D1 1000ml/mẫu 39 N.T3D3 1000ml/mẫu 40 N.G.TG1.1 Nước của ao nuôi cá giống Tiền Giang 1000ml/mẫu 41 N.G.TG1.2 1000ml/mẫu 42 N.G.TG1.3 1000ml/mẫu 43 N.G.TG.3.1 1000ml/mẫu 44 N.G.TG3.2 1000ml/mẫu 45 N.G.TG1.1 1000ml/mẫu 46 N.G.TG1.2 1000ml/mẫu 47 N.G.TG2.1 1000ml/mẫu 48 N.G.TG2.2 1000ml/mẫu 49 N.G.TG3.1 1000ml/mẫu 50 N.G.TG3.2 1000ml/mẫu D Thực phẩm lên men truyền thống và sữa tươi (14 khuẩn lạc) 51 YA1 Yoghurt 1ml dịch mẫu 52 CM2 Sữa bò tươi 53 CM3 54 CM1 55 DC3 Dưa cải 56 DC4 57 DC1 58 RG2 Rau giá 59 RG4 60 RG3 61 KF1 kefir 62 CF1 Cà Pháo 63 CF2 64 KC Kim Chi Ghi chú T.VL: cá thịt vĩnh long T.TG: cá thịt tiền giang T.DT: cá thịt đồng tháp G.VL: cá giống vĩnh long G.TG: cá giống tiền giang G.DT: cá giống đồng tháp N.TD: nước ao cá thịt đồng tháp N.G.TG: nước ao cá giống tiền giang YA: yourgut, DC: dưa cải, RG: rau giá CF: cà pháo KC: kim chi Bảng 3.2.1.2. Danh sách các chủng vi khuẩn mua từ ngân hàng vi sinh vật (Trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Viện Vi Sinh và Công Nghệ Sinh Học) STT Tên loài Môi trường nuôi Ký hiệu chủng 1 Bacillus thuringiensis TSA or TSB VTCC-B-804 2 Bacillus megaterium TSA or TSB VTCC-B-614 3 Lactobacillus plantarum MRSB, MRSA VTCC-B-701 4 Lactobacillus acidophilus MRSB, MRSA VTCC-B-871 5 Pediococcus acidilactici MRSB, MRSA VTCC-B-800 6 Saccharomyces cerevisiae TSA or TSB + glucose VTCC-Y-0011 b. Hỗn hợp 2 loại phân tử quorum sensing (AHL) (phân tử tín hiệu quorum sensing ở vi khuẩn Gram âm) + N-butyryl homoserine lactone; + N-hexanoyl homoserine lactone. c. Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên các cá tra do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, môi trường Thiết bị và dụng cụ Tủ cấy vô trùng (Microflow). Tủ ấm lắc (Orbital incubator SI 50). Tủ ấm (Memmert). Máy quang phổ (SmartSpect TM Plus Spectrophotometer). Máy vortex. Cân điện tử SHIMADZU AY220 Máy khuấy từ gia nhiệt. IKA® RH basic KT/C Tủ lạnh sâu -80oC. Tủ lạnh thường. Nồi hấp vô trùng (HIRAYAMA). Máy cất nước hai lần (Hammilton). Các loại micropipet (100 - 1000ml, 10 – 100 ml,500-5000ml). Các loại đầu típ hấp được nhiều lần . Erlen loại 100ml, 250 ml. Ống đong 100ml, 500ml, 1000ml. Đĩa petri. Ống nghiệm. - Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, các loại chai thủy tinh chịu nhiệt (2 lít, 1 lít và 0,5 lít). Môi trường MRSA: Lactobacillus MRS Agar made in India MRS: Lactobacillus MRS Broth made in India BHIA: Brain Heart Infusion Agar BHI: Brain Heart Infusion Broth Bảng 3.2.2.1 Thành phần môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar) STT Thành phần g/l 1 Calf brain, infusion from 200 2 Beef heart, infusion from 250 3 Proteose peptone 10 4 Dextrose 2 5 Sodium chloride 5 6 Disodium phosphate 2.5 7 Agar 15 Bảng 3.2.2.2 Thành phần môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth) STT Đơn vị Thành phần g/l 1 Calf brain, infusion from 200 2 Beef heart, infusion from 250 3 Proteose peptone 10 4 Dextrose 2 5 Sodium chloride 5 6 Disodium phosphate 2.5 Bảng 3.1.2.3 Thành phần môi trường MRSA (Brain Heart Infusion Agar) STT Thành phần g/l 1 Proteose peptone 10 2 Beef extract 10 3 Yeast extract 5 4 Dextrose 20 5 Polysorbate 80 1 6 Amonium citrate 2 7 Sodium Aactate 5 8 Magnesium sulphate 0.1 Bảng 3.2.2.4 Thành phần môi trường MRS (Brain Heart Infusion Broth) STT Thành phần g/l 1 Proteose peptone 10 2 Beef extract 10 3 Yeast extract 5 4 Dextrose 20 5 Polysorbate 80 1 6 Amonium citrate 2 7 Sodium Aactate 5 8 Magnesium sulphate 0.1 9 Mangannese sulphate dipotassium 0.05 10 Phosphate 2 3.2.3 Một số thao tác kỹ thuật vi sinh Cách làm đĩa thạch vô trùng Pha môi trường BHIA (0.52g/ml) Chuẩn bị đĩa petri. Hấp tiệt trùng dụng cụ chứa môi trường và đĩa petri ở 121oC trong 20 phút. Lau cồn quanh mặt trong của tủ cấy vô trùng. Thắp đèn cồn để tránh nhiễm vi khuẩn vào đĩa môi trường. Đợi khi nhiệt độ bình môi trường nguội đến 60oC rồi cho vào tủ cấy vô trùng cùng với đĩa petri để chuẩn bị đổ đĩa. Không đổ đĩa khi môi trường nóng hơn 60oC để tránh hơi nước đọng trên nắp đĩa và mặt thạch. Sát trùng tay bằng cồn trước khi đổ đĩa. Quay tròn bình để trộn đều môi trường, tránh lắc mạnh sinh bọt khí. Thao tác đổ môi trường ra đĩa: Hình 3.2.3.1 Cách đổ đĩa thạch Đổ khoảng 20ml môi trường vào đĩa thạch. Nếu thấy có bọt khí trên mặt thạch thì dùng que cấy nung đỏ trên ngọn lử đèn cồn châm vỡ bọt khí. Thao tác này cần thực hiện khi thạch còn nóng, chưa đông. Để yên cho thạch đông, tránh làm rung đĩa petri để bề mặt thạch được phẳng, đồng đều. Để cho đĩa thạch đông chắc trong đĩa và nguội đến nhiệt độ phòng. Gói giấy báo, ghi tên môi trường và ngày đổ đĩa bên ngoài rồi cho vào tủ lạnh hoặc có thể dùng ngay để cấy vi khuẩn. Cách cấy giống cấp một + Chuẩn bị Giống cần cấy. Đĩa thạch Que cấy. Đèn cồn. Vệ sinh bằng cồn 70o khắp mặt bên trong của tủ cấy. + Thao tác Rửa tay bằng cồn. Lắc đều ống huyền phù. Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ, làm nguội que cấy trong không khí khoảng 15 giây. Mở nắp dụng cụ chứa vi khuẩn cần cấy, đưa nhẹ qua ngọn lửa đèn cồn. Cho que cấy vào ống huyền phù tế bào, chạm đầu que cấy vào thành ống để làm nguội tiếp. Nhúng đầu que cấy vào dịch huyền phù. Tay trái hé mở nắp đĩa thạch. Đặt đầu que cấy vào một góc đĩa thạch chấm nhẹ để loại bớt tế bào một lần nữa. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên mặt thạch theo đường zích zắc dày. Đậy nắp đĩa. Khử trùng đầu que cấy trên đèn cồn và làm nguội đầu que cấy. Hé mở nắp đĩa, đặt đầu que cấy lên phần thạch chưa ria cấy để làm nguội tiếp. Bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ nhất, ria đường zích zắc thứ hai có chiều khác với đường ban đầu. Đậy nắp đĩa lại. Khử trùng que cấy, làm nguội, bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ hai, ria cấy đường zích zắc thứ ba có chiều khác với các đường thứ nhất và thứ hai trên khoảng trống còn lại. Đậy nắp đĩa, khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá. Ngoài kiểu ria cấy tạo thành ba đường zích zắc (hay còn gọi là ria cấy ba pha) có thể ria cấy bốn đường zích zắc (bốn pha) để thu nhận các khuẩn lạc sạch. Hình 3.2.3.2. Các cách ria cấy Hình 3.2.3.4. Các thao tác cấy truyền Cách cấy giống cấp một sang erlen + Chuẩn bị Đĩa giống cần cấy Erlen có pha sẵn môi trường đã được hấp tiệt trùng. Que cấy. Đèn cồn. + Tiến hành Cho các dụng cụ vào tủ cấy Rửa tay bằng cồn Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ. Hé mở nắp đĩa thạch, chạm đầu que cấy vào phần đĩa thạch không có vi khuẩn để làm nguội que cấy. Lấy một khuẩn lạc, nếu khuẩn lạc quá nhỏ thì lấy hai khuẩn lạc. Mở nút bông của erlen, hơ miệng erlen trên ngọn lửa đèn cồn. Cho que cấy vào ngập trong môi trường, chú ý không để đầu que cấy chạm vào vật gì. Lắc nhẹ đầu que cấy để vi khuẩn phân tán vào môi trường. Lấy que cấy ra, hơ miệng erlen trên ngọn lửa đèn cồn, đậy nút bông lại. Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để diệt khuẩn. Các erlen sau khi được cấy vi khuẩn cho vào tủ ấm lắc ở 30oC tốc độ lắc 120 vòng/phút, trong vòng 48 h. Phương pháp pha loãng + Chuẩn bị Erlen chứa mẫu cần pha loãng Ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh lý đã hấp tiệt trùng Máy khuấy ống nghiệm. Đèn cồn Micropiet, Hộp đầu tip đã hấp tiệt trùng, Bút Hình 3.2.3.5. Dụng cụ chuẩn bị trước khi pha loãng và tráng đĩa được đặt trong tủ cấy vô trùng. + Tiến hành: Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy. Cho các dụng cụ trên vào bên trong tủ cấy. Rửa tay bằng cồn. Lắc đều bình chứa mẫu cần pha loãng bằng máy khuấy ống nghiệm trong 1 phút. Mở nút bông bình chứa mẫu, hơ nhanh miệng bình pha loãng trên ngọn đèn cồn. Dùng micropipet hút 100 ml Mở nút bông ống nghiệm nước muối sinh lý, hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn. Cho 100 ml mẫu vào. Hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, đậy nhanh nút bông lại. Sơ đồ pha loãng: Hình 3.2.3.6. Cách pha loãng 100ml 100ml 100ml 10-2 10-6 10-4 Phương pháp tráng đĩa ( cấy trang) + Chuẩn bị Đĩa peptri Que cấy trang Hộp đầu tip Cồn 70o Cốc 450 ml Đèn cồn Máy vertex + Thao tác Lấy ống nghiệm đã pha loãng ở nồng độ 10-4 để tiến hành tráng đĩa. Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy. Cho các dụng cụ trên vào tủ cấy (trừ máy khuấy ống nghiệm). Rửa tay bằng cồn. Lắc kỹ ống nghiệm bằng máy khuấy ống nghiệm trong 1 phút. Mở nút bông đậy ống nghiệm chứa mẫu, hơ nhanh trên ngọn đèn cồn. Dùng micropipet hút 50 ml dung dịch mẫu. Hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn, đậy nút bông lại. Tay trái hé mở nắp đĩa thạch, tay phải cầm micropipet cho vào 50 m mẫu. Dùng que gạt nhúng vào cồn, hơ trên ngọn đè