Khóa luận Nghiên cứu phương pháp chiết xuất dịch từ sinh khối vi khuẩn Lam Spirulina platensis bổ sung vào nước giải khát

rƣờng lỏng chuẩn bị nhƣ trên nhƣng không có thạch. Các ống thạch nghiêng hoặc các bình tam giác chứa môi trƣờng lỏng giữ giống Spirulina có thể cất giữ ở nơi có nhiệt độ mát <150C hoặc ở nhiệt độ 40C nhƣng cƣờng độ ánh sáng phải thấp 300 – 500 lux sau 30 – 40 ngày thì cấy lại. Nhân giống chuẩn bị trồng ngoài trời. Cho môi trƣờng đã chuẩn bị vào bình thuỷ tinh có thể tích từ 2 - 5 lít. Lấy 10 ml dịch Spirulina hay lấy Spirulina từ 2 ống thạch nghiêng thêm vào mỗi bình trên. Giữ các bình này dƣới đèn huỳnh quang và đèn sợi đốt hay ngoài trời đƣợc che bóng có cƣờng độ ánh sáng khoảng 3 – 10 Klux. Các bình trên mỗi ngày lắc vài lần. Sau 8 – 10 ngày là có lƣợng Spirulina để nhân ra bể ngoài trời. + Nuôi trồng Spirulina ra bể: Dùng 20 lít Spirulina nhân giống trong bình để nhân ra bể 20 m3. Các bể mới cấy Spirulina ra có mật độ loãng phải che bớt ánh sáng để ánh sáng còn lại khoảng 5000 lux. Khi Spirulina trong bể đặc thì không cần che nữa. Để không phải che bể lúc mới gieo Spirulina vào thì phải tiến hành cấy với mật độ cao và khuấy sục để môi trƣờng di chuyển với tốc độ 20 cm/giây. Từ bể này lại nhân Spirulina sang bể tiếp theo, cần nhân Spirulina vào bể sau khi mặt trời lặn để Spirulina thích nghi qua đêm trƣớc khi quang hợp của ngày hôm sau. - Thu hoạch Spirulina: Sau khi các bể đã nhân đủ Spirulina thì chúng sẽ sinh trƣởng tăng sinh khối và tăng mật độ. Định kỳ khoảng 2 ngày hoặc hơn tuỳ theo tình trạng của các bể mà thu hoạch bớt và giữ lại mật độ không thấp hơn 0,6 – 0,8 g/l. Mỗi lần thu 16 hoạch cần tiến hành bổ sung chất dinh dƣỡng cho môi trƣờng. Cần bổ sung nƣớc đến độ sâu đã quy định. Sau thời gian sinh trƣởng từ 1 – 2 tháng do môi trƣờng bị thay đổi vì các chất dinh dƣỡng không còn giữ đƣợc cân bằng giữa các yếu tố dinh dƣỡng nhƣ ban đầu, mặt khác Spirulina tiết ra môi trƣờng các chất kích thích sinh trƣởng và các chất kìm hãm sinh trƣởng nên năng suất và phẩm chất của Spirulina giảm dần, lúc đó phải thay môi trƣờng và nhân Spirulina lại từ đầu. Tại hồ Texcoco ở Mêhicô Spirulina trồng diện tích lớn nên thu hoạch theo quy mô công nghiệp, gồm các công đoạn: Làm đặc sơ bộ. Lọc bằng trọng lực và chân không. Làm vỡ tế bào. Sấy khô. Nghiền. Đóng gói. Tại Vĩnh Hảo - Bình Thuận Spirulina sau thu hoạch sẽ đƣợc lọc qua vải sợi bông và rửa sạch bằng máy rồi đem ly tâm tốc độ 800 vòng/phút loại bớt nƣớc để thu sinh khối. Sấy khô: là công đoạn quan trọng và là khâu cuối cùng của quá trình sản xuất Spirulina nói chung. Spirulina có thành tế bào mỏng nên thuận lợi cho việc sấy sẽ nhanh khô. Ấn độ đã tiến hành thử nghiệm nhiều phƣơng pháp sấy khác nhau, trong đó phơi nắng cho thấy sản phẩm sau khi sấy đều tốt và đẹp. Tại Vĩnh Hảo, đã sử dụng phƣơng pháp phơi khô ngoài nắng. Buổi sáng thu hoạch và phơi khô suốt ngày. Trong điều kiện không thuận lợi về thời tiết phải phơi bổ sung ngày hôm sau. Spirulina thu đƣợc theo phƣơng pháp này còn 7 – 8% độ ẩm, sau đó đem nghiền thành bột và cất giữ lâu hàng năm mà vẫn không bị mốc. 17 - Xử lý nƣớc thải sau thu hoạch: Sau mỗi lần lọc để thu hoạch, nƣớc qua lọc cần cho lại vào bể để tiết kiệm môi trƣờng. Lúc thay toàn bộ môi trƣờng và nhân Spirulina lại từ đầu cần tận thu Spirulina còn lại trong môi trƣờng đó. 2.4. Thành phần dinh dƣỡng và công dụng của Spirulina platensis 2.4.1. Thành phần dinh dƣỡng [18,33] Spirulina còn có tên thƣơng mại là Arthrospira platensis mà đƣợc nuôi trồng trên thế giới nhƣ một nguồn thực phẩm, chúng rất giàu dinh dƣỡng. Hiện nay đƣợc phổ biến nhƣ là thực phẩm bổ dƣỡng tại US và Europe. Protein: 55% - 70% Giàu các vitamin: vitamin A, B1, B2, B3, B6, B12, vitamin C, vitamin D, vitamin E, folate, vitamin K, biotin, axit pantothenic, beta carotene - tiền chất của vitamin A, inositol. Giàu các chất khoáng: Canxi, mangan, sắt, chromium, photpho, magiê, selen. Giàu các sắc tố: phycocyanin, chlorophyll, carotenoid và xanthophyll và các sắc tố khác. Các hợp chất hữu cơ: axit gamma linoleic, glycolipid, các polysaccharide. Các axit amin: isoleucine, phenylalanine, leucine, threonine, lysine, tryptophan, methionine, valine, alanine, glycine, arginine, histidine, axit aspartic, proline, cystine, serine, axit glutamic, tyrosine. Đặc biệt chúng chứa nhiều axit amine không thay thế mà động vật không thể tự tổng hợp đƣợc. Vì vậy Spirulina đƣợc nuôi trồng rất phổ biến trên thế giới, đƣợc sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau: Y - Dƣợc, mỹ phẩm, thực phẩm, nông nghiệp, thủy sản và đƣợc coi là thức ăn con ngƣời trong tƣơng lai. 18 2.4.2. Công dụng của vi khuẩn lam Spirulina platensis [34,35,36,37] Protein chất lƣợng cao Spirulina là một loại tảo đơn bào nhỏ dạng xoắn ốc, chứa protein cân bằng, hoàn chỉnh và nhiều chất dinh dƣỡng có giá trị. Spirulina chứa khoảng 70% protein dễ tiêu, lƣợng protein này cao hơn bất kì loại thực phẩm nào khác. Ngoài ra thành phần của tảo Spirulina còn chứa 18/22 axit amin, tất cả những axit amin cần thiết này tạo thành nguồn thực vật duy nhất hoàn chỉnh về protein. Hơn nữa, protein trong Spirulina dễ tiêu hóa hơn so với các nguồn thịt. Thực vậy, protein thịt bò đƣợc ƣớc lƣợng chỉ dễ tiêu 20%, trong khi protein Spirulina là 95%. Spirulina không những là thực phẩm tuyệt vời giúp cơ thể dễ dàng hấp thụ protein chất lƣợng cao mà còn chứa các men tự hỗ trợ quá trình tiêu hóa. Chất giàu dinh dƣỡng tự nhiên Nguồn dinh dƣỡng thực phẩm tự nhiên hoàn chỉnh đƣợc tìm thấy trong thực phẩm này là Spirulina cho ta những điều lợi ích vô tận về sức khỏe, Spirulina có lƣợng beta-carotene cao - tiền chất của vitamin A gấp 25 lần cà rốt, đây là chất chống oxy hóa mạnh, bảo vệ cơ thể khỏi những tổn hại cơ bản. Không giống vitamin A tổng hợp và dầu gan cá, beta-carotene hoàn toàn không độc hại, thậm chí khi sử dụng với số lƣợng lớn. Spirulina giàu vitamin A dễ chuyển hóa, cần thiết cho mắt, làn da, răng, móng, tóc, xƣơng và một hệ thống miễn dịch tốt, bảo vệ cơ thể khỏe mạnh. Spirulina là một nguồn cung cấp vitamin B tuyệt vời, cụ thể là vitamin B12, quan trọng với ngƣời ăn chay, gấp 2 – 6 lần gan bò sống. Thực phẩm dinh dƣỡng này cũng chứa vitamin E, là nguồn sắt cao, chứa 14 chất khoáng tự nhiên và nhiều nguyên tố vi lƣợng. Siêu thực phẩm cho ngƣời ăn kiêng Spirulina là một trong những thực phẩm giàu dinh dƣỡng nhất, chứa ít chất béo và cholesterol. Nhiều ngƣời nhận thấy rằng khi họ dùng Spirulina trƣớc bữa ăn sẽ làm giảm sự thèm ăn của họ, cho phép họ giảm nhu cầu ăn thêm thức ăn 19 nhƣng vẫn không thấy đói, cách này thích hợp cho ngƣời ăn kiêng. Đối với những ngƣời suy dinh dƣỡng, cần tăng trọng cách tốt nhất là bổ sung Spirulina sau mỗi bữa ăn. Chất dinh dƣỡng sẽ đƣợc tích lũy lại, giúp ngƣời suy dinh dƣỡng mau chóng phục hồi. Loại siêu thực phẩm này có thể là một thành phần giá trị của bất kì chƣơng trình tăng hoặc giảm cân sức khỏe nào. Spirulina cũng là nguồn cung cấp carbohydrate phức hợp tuyệt vời, nó chứa glycogen và rhamnose, dễ đƣợc cơ thể hấp thu và biến đổi nhanh chóng thành năng lƣợng. Thực phẩm dinh dƣỡng protein cao, ít calo này cung cấp năng lƣợng chúng ta cần mỗi ngày. Hỗ trợ miễn nhiễm tự nhiên Spirulina chứa đựng nhiều chất dinh dƣỡng cần thiết cho sự miễn nhiễm tối ƣu nhƣ GLA, beta-carotene và các carotenoid khác. Lƣợng dầu chứa GLA gấp 3 lần so với dầu cây anh thảo. Nghiên cứu đã tìm ra GLA giúp làm giảm bệnh huyết áp cao và giảm lƣợng cholesterol trong máu, làm dễ chịu các trƣờng hợp viêm khớp, các cơn đau tiền kinh nguyệt, bệnh chàm và các bệnh khác về da. Spirulina đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhằm công bố đặc tính tăng cƣờng miễn nhiễm, các nghiên cứu cho thấy Spirulina có thể làm tăng mức độ kháng thể và hoạt động đại thực bào, cả hai đều quan trọng đối với một hệ thống miễn nhiễm mạnh mẽ, nó cũng giúp cân bằng hoạt động hệ thống miễn nhiễm của bạn. Lọc và giải độc Còn một lí do khiến Spirulina quan trọng vì chúng chứa diệp lục gấp nhiều lần so với cỏ linh lăng hoặc lúa mì. Chất diệp lục là sắc tố giúp thực vật có màu xanh và rất trong sạch, với nhiệm vụ là làm sạch hệ thống kim loại nặng và các độc tố khác trong cơ thể có hại cho sức khỏe. Những năm qua, nhiều ngƣời mong muốn làm thanh khiết cơ thể đã ăn kiêng định kì bằng Spirulina. 20 2.5. Ứng dụng Spirulina platensis trong thực phẩm, xử lý môi trƣờng y học và mỹ phẩm [37,45] 2.5.1. Ứng dụng trong thực phẩm Từ những năm 1970, ở Nhật Bản và ở Mỹ, tảo Spirulina đã đƣợc xem là một loại siêu thực phẩm. Đến những năm 1990 vấn đề tiêu thụ Spirulina đã phát triển vƣợt bậc tại Trung Quốc, Ấn Độ, Châu Á, Bắc Mỹ làm cho Spirulina ngày càng trở nên phổ biến Hình 2.6. Các sản phẩm có bổ sung tảo [26] Gần đây, trên thị trƣờng Việt Nam xuất hiện nhiều chế phẩm bán ở cửa hàng thực phẩm, siêu thị hoặc cả trong nhà thuốc với thành phần và công dụng rất gần với thực phẩm dinh dƣỡng và thuốc chữa bệnh. Những chế phẩm đó là sản phẩm giao thoa giữa thực phẩm và thuốc - còn gọi là thực dƣợc, dƣỡng dƣợc hay thực phẩm chức năng. Đặc biệt trong những tháng giữa năm 2005 tới nay, các chế phẩm chứa tảo Spirulina đang bán trong nhóm sản phẩm nêu trên đƣợc khá nhiều ngƣời chú ý. Thực phẩm dinh dƣỡng đƣợc dùng ở dạng nƣớc uống, siro, yaourt, bột dinh dƣỡng. Có thể dùng tảo nguyên chất để uống hoặc trộn vào thức ăn nhƣ nấu canh, làm bánh. Một số nƣớc còn có trà Spirulina. Ở Đức, ngƣời ta đã bắt đầu đƣa tảo vào bia, gọi là bia xanh. 1 ngƣời dùng 1 ngày 5g tảo là đủ các chất thiết yếu. Cơ thể có thể hấp thụ mỗi ngày 30 – 45g. Dùng thừa cũng vô hại. Ngƣời bị bệnh nặng không ăn đƣợc có thể bơm tảo thẳng vào dạ dày là đủ các chất dinh dƣỡng. 21 2.5.2. Ứng dụng trong xử lí môi trƣờng Ở Việt Nam hiện nay, quy mô và mức độ ô nhiễm kim loại nặng trong nƣớc thải công nghiệp đang gia tăng với tốc độ đáng lo ngại. Việc áp dụng các biện pháp hóa lý nhƣ đã nêu thƣờng có giá thành cao, khiến nhiều hoạt động công nghiệp vẫn tiếp tục thải nƣớc thải chứa kim loại nặng vào môi trƣờng. Các điều tra cho thấy các nhà máy ô tô, sản xuất pin và ắc qui, nhà máy thuộc da, các xí nghiệp mạ thải nƣớc thải chứa các kim loại nặng nguy hiểm nhƣ Ni, Cr, Fe, Hg, Cu, Pb. Vì vậy nghiên cứu sử dụng vi tảo để loại trừ kim loại nặng trong nƣớc thải công nghiệp ở nƣớc ta là một hƣớng công nghệ đáng đƣợc quan tâm. Tuy nhiên đây là một lĩnh vực còn rất mới mẻ ở Việt Nam. Đã có một vài công trình nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này đạt đƣợc một số kết quả trong việc sử dụng chất hấp thu sinh học để xử lý ô nhiễm Cr, Ni, và Pb trong nƣớc thải công nghiệp. Thử nghiệm cố định tế bào tảo Spirulina platensis trên các chất mang khác, xây dựng đƣợc phƣơng pháp cố định tế bào vi tảo trên các chất mang khác nhau nhƣ polyurethane, agar và carageenan. Tế bào tảo sau khi cố định vẫn có khả năng hoạt động sống bình thƣờng trong một thời gian dài. Sự hấp thu kim loại nặng phụ thuộc trạng thái của tảo khi đói dinh dƣỡng có khả năng hấp thu cao hơn. Nhƣ vậy triển vọng sử dụng sinh khối vi tảo sống hay chết, tự do hay cố định vào việc loại trừ kim loại nặng trong nƣớc thải là to lớn. 22 Trên cơ sở các thông tin đã nêu chúng ta có thể hình dung sơ đồ công nghệ xử lý ô nhiễm kim loại nặng trong nƣớc thải bằng cách sử dụng vi tảo nhƣ sau: Nƣớc thải sinh hoạt sau khi xử lý sinh học đƣợc tách bùn và dùng nhƣ là môi trƣờng để nuôi cấy tảo, sinh khối đƣợc tách ra và đem đi xử lý nhiệt hoặc đem đi cố định trong chất mang, sau đó sinh khối này đƣợc sử dụng nhƣ chất hấp phụ sinh học để thu nhận kim loại nặng. Nƣớc thải công nghiệp nặng có nồng độ kim loại cao và các chất độc sẽ đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp hóa lý trƣớc sau đó hoặc đƣợc trộn với nƣớc thải sinh hoạt đã xử lý và tiến hành nuôi cấy các chủng tảo đã chọn lọc trong hồ nuôi tảo hoặc cho tiếp xúc với chất hấp thụ sinh học làm từ sinh khối vi tảo trong bể hay cột hấp phụ. Sinh khối tảo sau khi thu hồi đƣợc xử lý theo chế độ xử lý bùn: phân giải yếm khí để tạo biogas hoặc làm khô rồi thiêu hủy nhiệt hoặc chôn lấp; còn nƣớc thải sau xử lý sẽ thải vào nguồn tiếp nhận nƣớc. Xử lý nhiệt Nƣớc thải sinh hoạt Xử lý sinh học Tách bùn Môi trƣờng nuôi cấy vi tảo Tách sinh khối Thải vào nguồn tiếp nhận nƣớc Hấp phụ sinh học Nuôi cấy tảo Xử lý bùn Thu hồi sinh khối tảo Phối trộn Xử lý hoá lý Nƣớc thải xử lý Nƣớc thải xử lý Nƣớc thải công nghiệp nặng (Kim loại và chất độc cao) Hấp phụ sinh học Cố định trong chất mang 23 Qua sơ đồ này chúng ta thấy việc sử dụng sinh khối vi tảo đã kết hợp xử lý cả nƣớc thải sinh hoạt và nƣớc thải công nghiệp chứa kim loại nặng. Sử dụng sinh khối vi tảo để loại bỏ kim loại nặng là một hƣớng công nghệ có nhiều tiềm năng. Tuy nhiên còn rất nhiều thách thức phải vƣợt qua để có thể hình thành và làm chủ đƣợc công nghệ này. Cần có nhiều sự quan tâm hơn nữa của các khoa học cũng nhƣ các nhà quản lý đối với lĩnh vực nghiên cứu đang còn mới mẻ này. 2.5.3. Ứng dụng trong y học Các yếu tố cấu tạo nên tảo lam gồm 75% là chất hữu cơ và 25% là khoáng chất. Vì thế tảo chứa các chất căn bản trong việc trị liệu. Hình 2.7. Các sản phẩm từ tảo trong y học [42,43] Các đặc tính trị bệnh của tảo rất nhiều nhƣ tái bổ sung nƣớc, muối khoáng và dinh dƣỡng cho cơ thể. Thời gian ngâm mình trong nƣớc tảo thƣờng kéo dài khoảng 20 phút. Ngoài ra ngƣời ta thƣờng dùng tảo lam dƣới dạng cao dán nóng đắp lên toàn cơ thể hay trên những vùng đặc biệt trong 30 phút. Trong các trƣờng hợp khác, ngƣời ta xoa bóp thân thể với dƣợc liệu là tảo, có tác dụng làm dịu làn da hoặc dùng cả trong việc mát xa mặt. Chất chiết từ tảo lam đƣợc dùng làm chất tá dƣợc bao viên thuốc, thuốc sủi hoặc thuốc viên nang 24 và cả những loại thuốc không tan trong dạ dày, chỉ phóng thích hoạt chất ở ruột non. Ngoài ra tảo lam còn đƣợc nghiên cứu làm thuốc cầm máu và sát trùng. Sau sự kiện này hàng loạt tập đoàn dƣợc phẩm thế giới đã nhảy vào phát triển tảo thành thuốc. Hiện nay loài tảo này đã đƣợc trồng ở nhiều nƣớc nhƣ Mỹ, Nhật, Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp, Nigiêria, Nam Phi, Kênya. 2.5.4. Ứng dụng trong mỹ phẩm Trong mỹ phẩm tảo lam làm phóng thích các hoạt chất tác động hiệu quả trong nƣớc tắm, trong kem xoa mặt và toàn thân nhờ hàm lƣợng magie và kali cao, là thành trì giúp cơ thể chống lại các khối u xơ ở cơ bắp. Chất chiết từ tảo còn đƣợc sử dụng trong một số sản phẩm nhƣ thuốc đắp, thuốc làm mặt nạ, kem hoặc để dùng tắm trong liệu pháp biển. Hình 2.8. Các sản phẩm từ tảo trong mỹ phẩm [39,40] 2.6. Kỹ thuật sản xuất nƣớc giải khát 2.6.1 Khái niệm về nƣớc giải khát: Nƣớc giải khát là nƣớc uống đóng chai hoặc đồ uống đƣợc pha chế từ nƣớc với các chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp. 25 2.6.2 Quy trình sản xuất nƣớc giải khát: 2.6.2.1 Nguyên liệu: Nƣớc: là nguyên liệu chính trong sản xuất nƣớc giải khát, vì vậy các tiêu chuẩn cho nƣớc đƣợc tuân thủ nghiêm ngặt. Đƣờng saccharose hoặc glucose : lựa chọn loại đƣờng khi đƣa vào cơ thể dễ hấp thu, mặt khác dễ hoà tan. Chất bảo quản: Muối benzoat, axit benzoit có tác dụng ức chế hoặc khử hoạt tính của enzym, làm ngừng các quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh. Phá vỡ tế bào Saccharose Nƣớc Axit Citric Nấu syrup Làm nguội Lọc Chất bảo quản, hƣơng liệu chất còn lại Cặn Thu dịch lọc Phối trộn Xử lý hoàn thiện Thanh trùng Sản phẩm Bài khí Rót chai Phá vỡ tế bào Spirulina Ly tâm, lọc 26 Axit citric: dùng để điều chỉnh pH và tạo vị. Ngoài ra còn có tác dụng nhƣ một chất xúc tác cho quá trình nghịch đảo đƣờng tạo đƣờng khử, tăng độ ngọt và chống sự kết tinh. 2.6.2.2 Diễn giải quy trình công nghệ: - Hoà tan đƣờng: Đƣờng trƣớc khi đƣa vào nƣớc uống phải đƣợc hoà tan bằng hệ thống khuấy sục để tạo thành dung dịch syrup, nhiệt độ của dịch syrup từ 50 – 600C nấu trong thời gian 20 – 30 phút nhằm tránh hiện tƣợng lại đƣờng. - Lọc syrup: Sử dụng lọc thô hoặc lọc tinh nhằm tách các tạp chất. - Phá vỡ tế bào Spirulina: Sinh khối Spirulina đƣợc phá vỡ bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (PPVL) hoặc thẩm tích (PPKT) nhằm thu đƣợc lƣợng dịch chứa hàm lƣợng protein tối đa. - Phối trộn: Các thành phần sẽ đƣợc đƣa vào phối trộn và bổ sung chất phụ gia, sử dụng thiết bị phối trộn cơ học, nhiệt độ trong quá trình phối trộn 50 – 60 0 C. - Thanh trùng: Dung dịch đƣợc đƣa vào thanh trùng ở nhiệt độ 500C trong thời gian 30 phút. - Bài khí: Hạn chế ảnh hƣởng xấu đến sản phẩm trong quá trình bảo quản, làm tăng hiệu quả truyền nhiệt. - Rót chai: Sản phẩm sẽ đƣợc đƣa vào máy rót chai, đóng nắp tự động. 27 2.6.3. Kỹ thuật sản xuất nƣớc khoáng Vĩnh Hảo Sơ đồ: Sản xuất nước khoáng Vĩnh Hảo. 2.6.4. Kỹ thuật sản xuất nƣớc tinh khiết Nƣớc tinh khiết đƣợc khai thác từ nguồn nƣớc ngầm, đảm bảo độ tinh khiết nhờ đƣợc xử lý qua hệ thống thẩm thấu ngƣợc và ozon. Thanh trùng bằng tia cực tím. 2.6.5. Kỹ thuật sản xuất rƣợu trái cây Hỗn hợp trái cây đƣợc cho phối trộn với đƣờng và ủ ở nhiệt độ bình thƣờng. Sau 10 – 15 ngày lên men tạo sản phẩm rƣợu. Bơm trực tiếp nƣớc từ nguồn Lọc tinh Chiết rút Chuyển vào nhà máy Lọc thô Chai Khử trùng Súc rửa Sấy Đóng chai Dán nhãn Thành phẩm Kiểm tra chất lƣợng 28 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian: Từ 4/2007 – 8/2007. 3.1.2. Địa điểm: Chi cục Đo lƣờng Tiêu chuẩn Chất lƣợng tỉnh Bình Thuận, đƣờng Nguyễn Hội, Tp.Phan Thiết 3.2. Nguồn cung cấp nguyên liệu Nguồn sinh khối vi khuẩn lam Spirulina platensis đƣợc sản xuất bởi sản phẩm thƣơng mại của Công ty Vĩnh Hảo. 3.3. Đối tƣợng nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu: Vi khuẩn lam Spirulina Platensis. - Đối tƣợng thử nghiệm: Nƣớc khoáng, nƣớc tinh khiết - Aquafina, rƣợu trái cây. 3.4. Vật liệu 3.4.1. Thiết bị - Máy cất đạm. - Ống chuẩn độ. - Lò nung. - Lò siêu âm. - Tủ hút. - Tủ sấy. - Nồi hấp khử trùng. - Máy đo OD. - Cân điện tử. - Máy lắc. 29 3.4.2. Hoá chất - Axit H2SO4 đậm đặc, axit ascorbic, axit nitric. - Muối Na2CO3, CuSO4. - Hỗn hợp thuốc thử methyl đỏ và xanh. - Hỗn hợp xúc tác CuSO4/K2SO4, nƣớc cất, NaOH, thuốc thử Folin. 3.5. Các phƣơng pháp phân tích [1,2,3,4,5,6,7,8,9] 3.5.1. Phƣơng pháp xác định protein bằng phƣơng pháp Kjeldahl 3.5.1.1. Nguyên tắc Dƣới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất chứa nitơ bị phân huỷ và bị oxi hoá đến CO2 và H2O, còn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat. Quá trình đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau Bƣớc 1: Vô cơ hoá nguyên liệu t o R – CH – COOH + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 Chất xúc tác NH2 Bƣớc 2: Cất đạm Phản ứng xảy ra trong máy cất đạm (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O Phản ứng xảy ra trong bình hứng NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 + H2SO4dƣ Bƣớc 3: Chuẩn độ lƣợng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH. 30 3.5.1.2. Quá trình thực hiện Hình 3.8. Máy cất đạm (A): Bình phát hơi nƣớc, (B): Hệ thống hút chất thử từ bình C sau khi đã cất xong thải ra ngoài, (C): Bình chứa chất thử đã vô cơ hóa (bình phản ứng), (D): Phễu cho chất thử đã vô cơ hóa và chất NaOH vào bình (C), (E): Ống sinh hàn, (F): Bình chuẩn độ, bình hứng NH3, (P2): Khóa dẫn nƣớc từ phễu D xuống bình C, (P1): Khóa dẫn nƣớc từ bình B thải ra ngoài. Quá trình thực hiện theo các bƣớc: Bƣớc 1: Vô cơ hoá nguyên liệu quá trình đƣợc tiến hành trong tủ hút để tránh khí độc SO2, CO2. Nếu mẫu ở dạng bột khô: Cân chính xác 0,2g nguyên liệu, dùng một ống giấy cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào vài giọt nƣớc cất vô đạm. Tiếp tục cho 0,2g hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 và 5 ml H2SO4 đặc. Tiếp tục cho 0,2g hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 và 5 ml H2SO4 đặc. Để nghiêng bình Kjeldahl trên bếp đặt trong tủ hút và đun từ khoảng 2 – 3 giờ. cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt. Để 31 nguội. Chuyển dịch sang bình định mức 100 ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nƣớc cất vô đạm đến vạch định mức. Bƣớc 2: Cất đạm Rửa máy: Đun sôi bình A và mở nƣớc vào ống làm lạnh lúc khoá P1 và P2 đều đóng, sau đó cho vào phễu trong một ít nƣớc cất (khoảng 10 ml) và cho chảy xuống bình C bằng kẹp P2. Hơi nƣớc của bình A, sẽ từ từ qua erlen F, cứ để nhƣ vậy cho đến khi ở F có khoảng 5 ml nƣớc. Lấy đèn khỏi bình A, hơi nƣớc trong máy sẽ nguội lại, làm giảm áp suất ở A và B, do đó nƣớc trong bình C sẽ rút qua B. Khi nƣớc rút hết, thêm nƣớc vào phễu D và mở kẹp P2 cho nƣớc chảy vào C, kế đó nƣớc sẽ rút qua B. Ta có thể làm nhƣ vậy vài lần. Nếu nƣớc ở bình B đầy, mở kẹp P1 cho nƣớc rút đi. Khoá kẹp P1 và P2 đẩy bếp vào dƣới bình A. Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3 (bình F): cho vào bình hứng F (erlen 250 ml) 10 – 20 ml H2SO4 N/100 và ba giọt thuốc thử hỗn hợp thuốc thử methyl đỏ - methyl xanh, dung dịch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu mút của ống sinh hàn E ngập trong dung dịch H2SO4 N/100 của bình hứng. Quá trình lôi cuốn bằng hơi nƣớc: Lúc này bình A đang đƣợc đun sôi, kẹp P1 và P2 đóng. Đổ vào phễu D 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng, mở kẹp P2 để dung dịch này chảy từ từ xuống C, đóng P2 lại. Đổ nƣớc tráng vào bình D và cũng mở kẹp P2 thật nhẹ nhàng để nƣớc chảy từ từ xuống C từng giọt cho đến khi mực nƣớc trong D xuống gần sát đến kẹp P2 thì khoá P2 lại. Sau đó tráng D với một ít nƣớc cất và cũng mở kẹp P2 thật nhẹ nhàng để nƣớc chảy từ từ xuống C từng giọt cho đến khi mực nƣớc trong D xuống gần sát tới kẹp P2 thì khoá P2 lại. Rửa một lần nữa với thao tác tƣơng tự nhƣ trên. Thêm vào phễu D 10 ml NaOH đậm đặc. Mở khoá P2 từ từ để cho NaOH chảy xuống C từng giọt một. Nếu nƣớc trong C chảy mạnh quá thì khoá P2 lại, rồi tiếp tục cho chảy từ từ cho đến khi NaOH chảy gần hết xuống C. Tráng phễu D hai lần với một ít nƣớc cất. Nên nhớ chỉ cho nƣớc chảy xuống gần sát tới kẹp P2 mà thôi. 32 Tiếp tục lôi cuốn trong 5 phút, hạ erlen F xuống sao cho đầu mút của ống sinh hàn nằm trong không khí, đun tiếp 3 phút. Rửa đầu nhọn của ống làm lạnh E bằng một tia nƣớc của bình sịt. Lấy erlen F ra để định phân lƣợng thừa H2SO4. Đem đèn ra khỏi bình A, rửa sạch C (rửa máy) vài lần nhƣ đã hƣớng dẫn ở phần trên. Thực hiện hai lần thử không 3 lần thử thật Bƣớc 3: Chuẩn độ Lƣợng H2SO4 N/100 còn thừa trong bình F đƣợc chuẩn độ bằng NaOH N/100. Quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ tím đỏ sang xanh lá mạ. Xác định hệ số hiệu chỉnh k: lấy hai erlen, cho vào mỗi erlen 20 ml H2SO4 N/100 và vài giọt methyl đỏ - methyl xanh. Sau đó chuẩn độ bởi NaOH N/100 lấy giá trị trung bình của hai lần chuẩn độ. Hệ số hiệu chỉnh K sẽ đƣợc tính theo công thức: 20mlH2SO4 N/100 K = (1) VNaOH N/100 Tính kết quả Gọi Vo là trị số trung bình của 2 lần thử không Vt là trị số trung bình của 3 lần thử thật. Vậy ∆V = Vo – Vt là lƣợng NaOH tƣơng ứng với NH3 phóng thích bởi 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng là: ∆V x K = ∆V x K x 10-5 (mol) (2) 100 x 1000 Số gram đạm có trong 10 ml dung dịch đạm đã vô cơ hoá và pha loãng là: 14 x ∆V x K x 10-5 (g) 33 Số gram đạm có trong 100 ml dung dịch đạm vô cơ hoá là: 14 x ∆V x K x 10-5 x 100 = 14 x ∆V x K x 10-4 (g) (3) 10 Vậy: 14 x ∆V x K x 10-4 x 100 A = (4) m Trong đó: A: hàm lƣợng nitơ tổng số. m: lƣợng mẫu đem xác định protein Suy ra lƣợng protein (P) = A x 6,25 (5) 3.5.2 Phƣơng pháp xác định protein bằng phƣơng pháp Lowry 3.5.2.1. Nguyên tắc: Dựa vào cƣờng độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphocolphramat để xác định protein. Phức chất màu xanh có độ hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 750nm. Phƣơng pháp Lowry sử dụng phối hợp phản ứng Biure (tác dụng lên liên kết peptid) và phản ứng với thuốc thử folin để tạo phức màu đặc trƣng. Ngoài ra, cƣờng độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trƣờng phản ứng có chứa muối amon, phenol, vòng imizadol pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc cƣờng độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có mặt etanol, aceton, TCA, axit pecloric. Vì vậy, để đạt cƣờng độ chính xác của dung dịch protein với thuốc thử folin đòi hỏi protein phải đƣợc tinh sạch. Phƣơng pháp Lowry có độ nhạy tƣơng đối cao, cho phép xác định dung dịch mẫu chứa vài chục gam protein. Tuy nhiên phƣơng pháp này không dùng để định lƣợng các protein không chứa các axit amin vòng thơm nhƣ gelatin. 34 3.5.2.2. Thực hành Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch mẫu thí nghiệm, tính toán sao cho khối lƣợng protein có trong dung dịch khoảng 0,02 – 0,2 mg/ml (20 µg – 200 µg) protein. Thêm vào ống nghiệm 4 ml dung dịch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 0,5 ml thuốc thử folin, lắc đều, để yên từ 30 – 90 phút, màu của phản ứng sẽ chuyển từ màu vàng sang màu xanh so màu trên máy quang phổ hoặc máy so màu ở bƣớc sóng 750 nm. Xác định trị s