Khóa luận Nghiên cứu quy trình sản xuất sữa chua đậu nành tảo Spirulina

g trong 10g % Spirulina Phycocyanin Xanh da trời 1400 µg 14 % Chlorophyll Xanh lá cây 100 µg 1,0 % Carotenoids Màu vàng cam 47 µg 0,47% 2.2.3.4.Tình hình sản xuất, tiêu thụ và ứng dụng của tảo spirulina Spirulina được coi là nguồn thức ăn của con người trong nhiều thế kỷ. Spirulina sp. là giống được biết đến nhiều nhất vì giá trị dinh dưỡng của nó. Sinh khối tảo được sử dụng chủ yếu như nguồn cung cấp protein cho người và gia súc. Ở Nhật Bản, người ta sản xuất sinh khối tảo có nhãn hiệu Linablue A, ở Mỹ có Phycobiliprotein. Bảng 2.9: Tình hình sản xuất Spirulina trên thế giới [ 2] Công ty Địa điểm Diện tích (ha) Sản lượng (tấn khô) Giá thành (USD/kg) Sosa-Texcoco Mehico 12 300 Earthrise Hoa Kì 5,5 340 Cyanotech Hoa Kì 2 170 Siam Algae Thái Lan 3,8 480 Blue Continent Đài Loan - 480 Nippon Spirulina Nhật Bản 1,5 40 Bình Thuận Việt Nam 0,5 8 Nhiều công ty Trung Quốc 200 2798 Nhiều công ty Ấn Độ 12,2 260 Nhiều công ty Cu Ba - 40 5 - 18 17 Ứng dụng của tảo spirulina: 3Spirulina được sử dụng như một nguồn thực phẩm từ hàng ngàn năm nay để cung cấp dinh dưỡng và cải thiện sức khỏe cho con người vì Spirulina chứa nhiều chất dinh dưỡng như protein, acid amin, acid béo cần thiết, vitamin, chất khoáng [ 20] 3 Năm 1970-1980, nhiều nghiên cứu sử dụng Spirulina để phòng và trị bệnh suy dinh dưỡng trẻ em đã được tiến hành ở Mehico, Pháp, Roumani, Nhật Bản, Hoa Kỳ, Peru… [ 3] 3Bột khô Spirulina được dùng như một thức ăn cao cấp giàu protein, acid amin và nhiều vi lượng bổ dưỡng khác. Nếu xét về chất lượng protein, chỉ cần lượng 30 - 40g Spirulina/ngày/người là đủ nhu cầu acid amin. Spirulina dạng tươi tốt hơn Spirulina khô do còn nguyên vẹn các dưỡng chất, các enzyme đang hoạt động giúp ích cho cơ thể như superoxydedismutase, protease, lipase,…và việc sử dụng Spirulina dạng tươi còn mang lợi ích kinh tế vì không phải sấy khô, bảo quản, thích hợp với mô hình nuôi Spirulina hộ gia đình hoặc liên kết với xí nghiệp, sản xuất với trường học, nhà trẻ, khoa dinh dưỡng của bệnh viện [ 3] 3Theo Gloria và cộng sự (2004), khi bổ sung thêm sinh khối tảo S. platensis dạng khô với hàm lượng (6 mg/ml) vào sữa sẽ kích thích sự phát triển của Lactococcus lactis lên 27%, do đó bổ sung Spirulina để thúc đẩy quá trình lên men lactic [ 16] 3Chế phẩm Enalac (bột dinh dưỡng bổ sung 5% Spirulina) là một chế phẩm do Trung tâm Dinh dưỡng trẻ em Tp.HCM sản xuất. Enalac chứa 16,5% protein; 7% lipid; 74% glucide, vitamin…với sự phối chế của 5% bột Spirulina. Khi sử dụng, chế phẩm được pha loãng trong nước ấm (50-60oC) được sử dụng để ăn trực tiếp hoặc nuôi qua sonde. Kết quả nghiên cứu cho thấy chế phẩm có tác dụng tốt cho bệnh nhân suy dinh dưỡng ở mọi lứa tuổi [ 3] 3 Một số nghiên cứu cho thấy Spirulina có tác dụng tốt trong điều trị bệnh béo phì, bệnh tiểu đường, bệnh thiếu máu, bệnh loét dạ dày tá tràng, viêm tụy, bệnh đục thủy tinh thể và suy giảm thị lực, bệnh rụng tóc. Trong điều trị bệnh béo phì, chế phẩm Spirulina được chỉ định uống vào trước các bữa ăn khoảng 1 giờ vì Spirulina có chứa những chất vi lượng tác dụng điều hòa nội tiết tố (hormon), giúp duy trì lượng glucose trong máu ở mức cần thiết, giúp cơ thể vẫn khỏe mạnh và không có cảm giác thèm ăn [ 3] 18 2.3. Tổng quan về vi sinh vật 2.3.1. Probiotic [ 14] “Probiotics” là thuật ngữ này đã xuất hiện trong nhiều thập kỉ qua và đang trở nên quen thuộc với con người. Probiotic là các vi khuẩn sống khi được cung cấp với liều lượng thích hợp sẽ đem lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ (theo định nghĩa của FAO và WHO 2001). Vai trò của probiotic 3Tăng “ thành bảo vệ” miễn dịch, một số có khả năng kích thích cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu. 3Ngăn cản sự phát triển của các tác nhân gây bệnh trong đường ruột như: Staphylococcus, Salmonella, Yersinia, Clostridia. 3Có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột. 3Có khả năng chịu được acid dạ dày, chịu được muối mật. 3Phòng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày… 3Hạn chế sự hình thành các khối u. Enzym được tiết ra bởi các vi khuẩn có hại sẽ góp phần tạo ra các chất gây ung thư. Probiotic có khả năng làm giảm tới mức tối thiểu hoạt động của các enzym này và giảm nguy cơ ung thư ruột. 3Một số cơ thể không sử dụng được lactose do không có enzym lactase hoặc lactase hoạt động không tốt, điều này dẫn tới sự khó tiêu khi dùng các sản phẩm sữa. Probiotic có khả năng sản xuất ra enzym lactase giúp tiêu hoá lactose dễ dàng. 3Việc sử dụng nhiều thuốc kháng sinh là nguyên nhân gây ra các bệnh tiêu chảy, nhiễm Candida do hệ vi sinh vật có ích trong đường ruột bị tiêu diệt. Probiotic giúp tái thiết lập hệ vi sinh vật có ích nhanh chóng sau khi dùng kháng sinh. 2.3.2. Vi khuẩn lên men sữa chua Vi khuẩn lên men sữa chua là vi khuẩn lactic điển hình, thường là các loài Lactobacillus bulgaricus , Lac. Acidophilus, Streptococcus lactis, streptococcus cremosus …Những vi sinh vật này khi lên men sữa tạo ra sản phẩm sữa chua có lợi cho sức khỏe của con người, đó là những Probiotics. 19 2.3.2.1. Lactobacillus acidophilus [ 22] L. acidophilus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, dài, mảnh có kích thước từ 0,6-0,9 x 1,5-6 µm, thường xếp theo cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn. Khuẩn lạc trên môi trường thạch có kích thước 2-5 mm, lồi, đục, đều và không sinh chất tạo màu. Đặc điểm chung của họ vi khuẩn lactic là không sinh bào tử. L. acidophilus là loài ít có khả năng di động, không phân giải protein, phản ứng catalase và chuyển hóa nitrat thành nitrit âm tính. L. acidophilus lên men đường lactose, và các loại đường glucose, saccharose, maltose, mannose. L. acidophilus là loài vi khuẩn vi hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu là 370C. pH tối ưu cho sự tăng trưởng dao động trong khoảng 5,5 – 6. Nhu cầu dinh dưỡng của L. acidophilus phản ánh bản chất rất khó nuôi cấy của vi khuẩn này. Môi trường nuôi cấy chuẩn thường phải rất giàu acit amin và vitamin như peptone, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleate (tween 80), sodium acetate và muối magne kích thích sự tăng trưởng. Môi trường nuôi cấy hay được sử dụng là MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) lỏng hay agar. 2.3.2.2. Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus bulgaricus là trực khuẩn gram dương, hình que, dài, mảnh, thường xếp thành đôi hay chuỗi dài từ 5- 20 µm, không có khả năng di động, có thể tạo ra 2,7% acid lactic. Khuẩn lạc của Lactobacillus bulgaricus phẳng, hơi vàng, đường kính 2- 3mm. Khuẩn lạc càng già thì ở giữa càng trở nên sậm màu. Trên môi trường thạch- huyết thanh sữa cho khuẩn lạc hình tròn dạng sợi bông rối. Lactobacillus bulgaricus không dịch hóa gelatin, làm đông tụ sữa ở 37OC. Chúng lên men được đường glucose, lactose và galactose. Hàm lượng acid do vi khuẩn này tạo ra trong môi trường sữa rất cao (3-3,5%, tương ứng 30-45OT). Nó thuộc loại kị khí không bắt buộc. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng là 40-48OC , pH thích hợp ở 5,4. Khi lên men chúng không có khả năng sử dụng đường maltose và tạo một lượng nhỏ acid bay hơi và aldehyde, tạo cho sản phẩm có mùi vị đặc trưng, thường dùng để sản xuất sữa chua đông mịn. 20 2.4. Tổng quan về sữa và chất ổn định 2.4.1. Sữa [ 8] Sữa là một loại thực phẩm rất giàu chất dinh dưỡng. Vì vậy nó là loại thực phẩm quý, đặc biệt đối với người già và trẻ em. Trong sữa có khoảng 90% là nước và có đủ các chất dinh dưỡng như protein, chất béo, đường lactoza, các vitamin như A, D, E, B1, B6, B12, và các chất khoáng. Trong sữa chưa đun còn có một số enzym giúp cho việc tiêu hóa được dễ dàng. Hiện nay sản phẩm sữa chủ yếu là sữa bò với các loại đa dạng như sữa tươi, sữa hấp, sữa hấp pastuer, sữa đặc, kem, bơ, phomat, sữa chua, sữa bột. 2.4.2. Chất ổn định [ 4] Các chất ổn định thường dùng: gelatin, pectin, tinh bột, agar-agar. Chúng liên kết với nước, tăng độ nhớt, ngăn sự tách nhũ thanh. Yoghurt bình thường không cần thêm chất ổn định. Yoghurt trái cây có thể thêm chất ổn định ở mức 0,1-0,5%. 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [ 11] Trong công nghiệp sản xuất sữa chua, các giai đoạn xử lí sản phẩm sau quá trình lên men thường đơn giản. Sản phẩm cuối cùng bao gồm cả sinh khối vi sinh vật, các sản phẩm trao đổi ngoại bào do vi sinh vật tiết ra và cơ chất sót. Thành phần và hàm lượng từng chất sẽ góp phần hình thành nên hương vị cho sản phẩm. Do đó, để sản xuất được sữa chua với chất lượng mong muốn, chúng ta cần phải: - Chọn giống vi khuẩn thích hợp. - Sử dụng môi trường lên men với thành phần cơ chất đầy đủ theo tỉ lệ tối ưu. - Lên men trong điều kiện thích hợp như: lượng giống cấy, nhiệt độ và thời gian lên men. Ngoài ra, ta còn phải quan tâm đến những vấn đề khác như việc cung cấp oxy, sự khuấy trộn… 21 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học trường Cao Đẳng Kinh Tế Công Nghệ số 547/M8 Nguyễn Tri Phương, Phường 14, Quận 10, Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03 đến tháng 07 năm 2009. 2.2. Nguyên liệu Hạt đậu nành được chọn từ đậu nành Phương Lâm. Nguyên liệu được chọn mua siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM. Sữa được chọn mua là sữa tiệt trùng không đường của Vinamilk, mua ở siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM Tảo spirulina được chọn là bột tảo thương mại có nguồn gốc Nhật Bản, được đóng gói tại công ty Châu Đại Dương ( 79/3X Phan Tây Hồ, Phường 7, Quận Phú Nhuận, Tp.HCM), loại hộp 50g. Đường được chọn mua là đương cát trắng tinh luyện, mua ở siêu thị Nguyễn Văn Cừ, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, Tp.HCM. Giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus của viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. 2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng Dụng cụ Thiết bị Hóa chất 3Nhiệt kế 3Nồi nấu 3Bếp đun 3Vải lọc 3Ray 3Que cấy trải 3Khúc xạ kế ATAGO 0 – 32oBx 3Tủ sấy 3Cân điện tử 3Cân đồng hồ 3Máy xay sinh tố 3Môi trường MRS agar ( phụ lục) 3Môi trường MRS broth (Phụ lục) 3Cồn 3Paraffin của công ty AR 22 3Đĩa Petri 3Bình tam giác có chia vạch 3Đũa thủy tinh 3Micropipette, đầu tip 3Buret 3Ống nghiệm 3Máy đồng hóa 3Tủ giữ lạnh của công ty Toshiba – Nhật Bản 3Tủ ấm( có thể chỉnh nhiệt độ thành tủ sấy) của công ty Membert- Đức. 3Nồi autoclave SA – 252F của công ty Sturdy – Đài Loan 3Tủ cấy của công ty Huy Hoàng – Việt Nam 3Máy đo pH pH211 của công ty Hanna – Italia – Trung Quốc 3Phenoltalein 1% 3Dung dịch NaOH 0,1N 2.4.Quy trình chế biến sữa chua đậu nành tảo Spirulina 2.4.1.Quy trình Đồng hóa Xử lý Dịch tảo Phối trộn Dịch sữa Xử lý Sữa UHT không đường Đường Lựa chọn Đậu nành Bột tảo 23 Cấy giống Nhân giống Thanh trùng Vi khuẩn lactic Rót hủ Bảo quản Sản phẩm Ủ 2.4.2.Giải thích quy trình Lựa chọn đâụ nành: đậu được chọn thường là đậu già, ruột vàng, vỏ mỏng, da láng. Loại bỏ những hạt hư hỏng ( sâu, mọt, mối...), hạt kém phẩm chất ( hạt non, hạt không bình thường về màu sắc và hình dạng...) do những hạt này sẽ làm cho sản phẩm có mùi vị rất kém. Xử lý: Xử lý đậu nành để tạo ra dịch sữa bao gồm các công đoạn sau 3Ngâm: trong giai đoại ngâm, hạt sẽ hút nước và trương lên, khi đó các phân tử nước có tính lưỡng cực sẽ tác động lên các cấu phần ưa nước trong hạt. Kết thúc giai đoạn ngâm là thời điểm độ ẩm hạt đạt 55 -60% là tốt nhất(Nguyễn Đức Lượng ,1996). Thời gian ngâm đậu được chọn là 4 giờ. Giai đoạn ngâm còn giúp cho công đoạn loại bỏ vỏ trong điều kiện không có máy tách vỏ một cách dễ dàng hơn. 3Bóc vỏ: bóc vỏ bằng cách đãi thủ công trong nước. Bóc vỏ nhằm mục đích làm cho quá trình chần hiệu quả hơn và sữa đậu nành thu dược trắng hơn. 3Chần: chần nóng hạt đậu trong dung dịch Natribicarbonat nhằm loại bỏ yếu tố LOX ( lipoxigenase, là nguyên nhân gây ra mùi khó chịu), hổ trợ quá trình trương nở, ly trích protein, ức chế chất kháng dinh dưỡng. Chần dung dịch đậu trong dung 24 dịch NaHCO3 0,2% ở nhiệt độ 80OC trong vòng 5 phút. Tỉ lệ dung dịch/ đậu là 5/1. Sau khi chần, đậu được rửa lại bằng nước nóng 80OC. 3Xay và lọc: xay ướt đậu là quá trình phá vỡ tế bào giải phóng protein, lipit, gluxit v.v...đồng thời dùng nước hòa tan các chất và chuyển chúng sang dạng huyêng phù. Sau đó lọc huyền phù gồm dung dịch keo và chất rắn không tan thu dịch sữa. Xay đậu trong nước lạnh trong thời gian 1 phút 30 giây với tỉ lệ nước/đậu khi xay là 6/1. Sau khi xay đậu được lọc qua vải lọc. 3Xử lý nhiệt: được tiến hành ngay sau khi lọc hạn chế ảnh hưởng của sự tiếp xúc oxi không khí, ẩm, vi sinh vật.Gia nhiệt sữa đậu nành có các yêu cầu sau cần đạt: tiêu diệt vi sinh vật, diệt enzyme, diệt chất kháng dinh dưỡng, độc tố, khử mùi tanh đậu nành sống. Xử lý nhiệt ở 95OC trong vòng 15 phút. Xử lý bột tảo: Bột tảo được cân và pha vào nước theo tỉ lệ 3g tảo / 50 ml nước cất ấm ( khoảng 40- 50OC), lọc lấy dung dịch tảo bổ sung vào dịch sữa. Phối trộn: Phối trộn sữa đậu nành, sữa tươi, dịch tảo, đường saccharose theo những tỉ lệ nhất định. Trong quá trình thí nghiệm, tỷ lệ phối trộn giữa các thành phần như sau: dịch sữa là sự phối trộn giữa sữa đậu nành và sữa tươi với tỉ lệ 1:1, lượng dịch tảo bổ sung là 6% (v/v), lượng đường saccharose bổ sung là 6% (w/v), ngoài ra bổ sung thêm 5% gelatin dạng bột ( w/v). Đồng hóa: nhằm tạo nên một hỗn hợp đồng nhất, đồng hóa ở tốc độ 4 trong vòng 5 phút. Thanh trùng:thanh trùng ở 80OC trong vòng 15 phút. Nhân giống vi khuẩn: Trước khi nhân giống ta phải làm thuần và giữ giống vi khuẩn. 3Làm thuần giống là công việc tách rời một loại tế bào từ quần thể sinh vật đã được phân lập, cấy chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc (hoặc trộn thạch vào trước khi đông rồi đỗ ra đĩa Petri). Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp, các tế bào sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy vào ống môi trường giữ giống và ủ ở các điều kiện như trên để chúng phát triển thành một quần thể mới.Quần thể tế bào trong ống nghiệm này được gọi là một chủng hoặc ống giống. 25 Làm thuần và giữ giống được tiến hành như sau: Vi khuẩn trong ống giống mua từ viện Pastuer được cấy ria trên môi trường MRS agar,ủ ở 37oC trong tủ ấm 2 ngày cho đến khi thuần chủng, tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng hoặc thạch sâu. 3Nhân giống: Cấy giống: Cho vào dịch sữa men cái với tỉ lệ 10% ( Tỷ lệ giữa men L. acidophilus và L. Bugaricus là 1:1) Ủ: Sữa được ủ ở 43OC trong thời gian khoảng 4- 8 giờ. Bảo quản: Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4OC. 2.5. Phương pháp thí nghiệm Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu quy trình chế biến sữa chua đậu nành tảo Sprirulina với tóm lược phương pháp nghiên cứu theo sơ đồ sau: Nhân giống cấp 2 ( 1 sữa đậu nành + 1 sữa UHT không đường) 10% giống, ủ 43oC, 6 giờ Men cái Nhân giống cấp 1 (MRS lỏng) ở 37oC, 15 giờ Giống vi khuẩn đã được làm thuần Cho giống vi khuẩn làm quen môi trường sữa 26 Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường MRS Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong dịch sữa ( sữa tươi UHT và sữa đậu nành). Làm men cái Khảo sát quá trình lên men Khảo sát hàm lượng tảo bổ sung Xác định các chỉ tiêu vi sinh và hóa học Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm Khảo sát thời gian lên men Khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung Khảo sát tỉ lệ giống cấy Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa tươi UHT và sữa đậu nành 2.5.1.Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS. a/ Mục đích Xác định thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu được số lượng vi khuẩn nhiều nhất. b/ Bố trí thí nghiệm 27 0 5 10 15 20 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Vi khuẩn Thời gian (giờ) c/Chỉ tiêu theo dõi Số lượng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi trong môi trường MRS lỏng. d/ Phương pháp thực hiện - Giống vi khuẩn trong môi trường MRS agar cấy chuyền qua môi trường MRS lỏng, ủ ở 37OC trong các khoảng thời gian bố trí như trên. -Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đổ đĩa.( Phụ lục 1.1) 2.5.2.Xây dựng đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1) a/ Mục đích Khảo sát số lượng vi khuẩn còn sống trong môi trường sữa sau các khoảng thời gian nuôi cấy, từ đó chọn ra khoảng thời gian nuôi cấy tốt nhất để thu được số lượng vi khuẩn cao nhất. b/ Bố trí thí nghiệm 0 5 10 15 20 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Vi khuẩn Thời gian (giờ) c/Chỉ tiêu theo dõi Số lượng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi trong môi trường sữa đậu nành và sữa tươi với tỷ lệ 1:1. 28 d/ Phương pháp thực hiện - Giống vi khuẩn trong môi trường MRS agar cấy chuyền qua môi trường MRS lỏng, ủ ở 37OC trong thời gian tối ưu.( ứng dụng kết quả thí nghiệm 2.5.1). -Lấy vi khuẩn trong môi trường MRS lỏng cho vào môi trường sữa tươi không đường, ủ ở 37OC trong 4h. -Vi khuẩn từ môi trường sữa tươi được cấy vào môi trường sữa tươi và sữa tiệt trùng phối trộn với tỷ lệ 1:1, ủ ở 37OC qua các khoảng thời gian và xác định số lượng vi khuẩn. -Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đổ đĩa. 2.5.3.Làm men cái. a/ Mục đích Tạo ra hủ men đạt yêu cầu về số lượng vi khuẩn và giá trị cảm quan. b/ Bố trí thí nghiệm Xác định giá trị pH và đánh giá cảm quan sản phẩm qua bảng sau: 0 2 4 6 8 Lactobacillus bulgaricus Lactobacillusacidophilus Men cái vi khuẩn Thời gian (giờ) c/ Chỉ tiêu theo dõi -giá trị pH -Đánh giá cảm quan sản phẩm về màu sắc, mùi vị, cấu trúc. d/ Phương pháp thực hiện -Vi khuẩn từ trong môi trường MRS lỏng được cấy chuyền qua môi trường sữa tươi UHT và ủ ở 43OC trong 4 giờ. -Tiếp tục cấy chuyền vi khuẩn từ môi trường sữa tươi sang dịch sữa (sữa đậu nành và sữa tươi UHT với tỉ lệ 1:1), ủ ở 43OC trong các khoảng thời gian bố trí như trên. -Khảo sát cảm quan sản phẩm theo thời gian. 29 2.5.4. Khảo sát quá trình lên men. 2.5.4.1. Khảo sát thời gian lên men. Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên Theo dõi pH, đặc điểm sản phẩm theo thời gian và kết hợp với đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong sữa đậu nành, từ đó chọn thời gian lên men thích hợp sao cho sản phẩm đảm bảo lượng vi khuẩn cần thiết để nó đóng vai trò như là probiotic 2.5.4.2. Khảo sát tỷ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi tiệt trùng không đường. a/ Mục đích Phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi nhằm tạo ra dịch sữa tăng hàm lượng protein và làm cho sản phẩm sữa chua tạo ra có mùi thơm hơn, vị béo hơn. b/ Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiệm thức Yếu tố thí nghiệm là tỉ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi UHT như sau : 4:6, 5:5, 6:4. Số lần lặp lại: 3 lần c/ Chỉ tiêu theo dõi -pH của sản phẩm. -Kết quả đánh giá cảm quan về cấu trúc, mùi và vị sản phẩm theo phương pháp so hàng. d/ Phương pháp thực hiện Mỗi thí nghiệm thực hiện theo quy trình đã nêu. Nhưng tỉ lệ phối chế giữa sữa đậu nành và sữa tươi UHT thay đổi theo các thông số đã nêu như trên. 2.5.4.3. Khảo sát hàm lượng đường saccharose bổ sung. Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên Lần lượt bổ sung đường saccharose vào sữa theo các tỉ lệ khảo sát khác nhau 6%, 8%, 10%(w/v) Theo dõi pH và đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp so hàng. Từ đó chọn hàm lượng đường thích hợp bổ sung vào sữa. 30 2.5.4.4.Khảo sát tỉ lệ giống cấy. Chuẩn bị sữa đậu nành giống mục 2.4.2 và ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên Thay đổi tỉ lệ giống cấy tỉ lệ giữa Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus thay đổi như sau 6:4, 5:5, 4:6 (v/v). Theo dõi pH và đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp so hàng. Từ đó chọn tỉ lệ giống cấy thích hợp bổ sung vào sữa để lên men. 2.5.5. Khảo sát tỉ lệ phối chế giữa dịch sữa ( sữa tươi UHT + sữa đậu nành) với dịch tảo spirulina. a/ Mục đích Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tảo phối chế hưởng lớn đến màu, mùi và vị sản phẩm. b/ Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiệm thức Yếu tố thí nghiệm là tỉ lệ phối chế giữa dịch tảo spirulina và dịch sữa (sữa đậu nành + sữa tươi UHT) với các tỉ lệ như sau:6%, 8%, 10%(v/v) Số lần lặp lại: 3 lần c/ Chỉ tiêu theo dõi. -Kết quả đánh giá cảm quan về cấu trúc, màu, mùi và vị sản phẩm. d/ Phương pháp thực hiện Mỗi thí nghiệm thực hiện theo quy trình đã nêu. Nhưng tỉ lệ phối chế giữa dịch tảo và dịch sữa (sữa đậu nành + sữa tươi UHT) thay đổi theo các thông số đã nêu như trên. Ứng dụng kết quả các thí nghiệm trên. 2.5.6. Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt độ 4OC Theo dõi PH, độ acid và số lượng vi khuẩn lactic trong sản phẩm theo các ngày bảo quản để chọn ra được thời gian bảo quản tối ưu cho sản phẩm ( sản phẩm vừa đạt về giá trị cảm quan vừa đạt được giá trị dinh dưỡng về probiotic). Sau thời gian bảo quản tối ưu, tiến hành đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp cho điểm thị hiếu nhằm xác định mức độ chấp nhận sản phẩm của người tiêu dùng. 31 2.6. Phương Pháp Phân Tích Các Chỉ Tiêu 2.6.1. Mật độ tế bào vi sinh vật: Được xác định theo công thức sau: Trong đó: C (CFU/g) là số tế bào vi khuẩn trong 1g mẫu n1xV1xf1 +…+ n1xV1xf1 N C (CFU/g) = N ( CFU) là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ni là số đĩa cấy ở nồng độ thứ i Vi (ml) là thể tích mẫu cấy trong mỗi đĩa fi là độ pha loãng thứ i 2.6.2. Xác định pH của sản phẩm: Đo bằng máy đo pH Hanna 210. 2.6.3. Phương pháp chuẩn độ acid Cho 10ml sữa vào bình tam giác 100ml, sau đó cho vào khoảng 3 giọt phenoltalein 1%. Dùng NaOH 0,1N chuẩn độ ( dung dịch xuất hiện màu hồng phấn trong 10 giây). % acid= n. 0,09 n: số ml NaOH 0,1N 2.6.4. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm 3Phương pháp so hàng. ( phụ lục 1.3.1 ) 3Phương pháp cho điểm. (phụ lục 1.3.2 ) 2.6.5. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý kết quả 3Bố trí thí nghiệm 1 yếu tố. 3Kết quả thu được xử lý bằng phần mềm statgraphic7.0. 32 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS broth 4.1.1. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường MRS agar Hình 4.1: L. acidophilus Hình 4.2: L. bulgaricus Khuẩn lạc L. acidophilus trên môi trường MRS agar có dạng hình tròn, kích thước 2 - 5 mm, lồi,màu trắng đục, đều và không sinh chất tạo màu. Khuẩn lạc L. bulgaricus trên môi trường MRS agar phẳng, hơi vàng, đường kính 2 - 3mm. 4.1.2. Đường cong tăng trưởng của Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS broth Chúng tôi tiến hành dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus trên môi trường MRS broth, nhằm mục đích nghiên cứu định tính vi sinh vật theo thời gian và xác định thời điểm mật độ tế bào đạt cực đại để từ đó tiếp tục tăng sinh trong môi trường sữa đậu nành. Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường MRS ở nhiệt độ 370C, pH = 5,7. Giống được cấy trực tiếp từ ống giữ giống thạch nghiêng. 33 Bảng 4.1: Kết quả tăng trưởng của vi khuẩn L. acidophilus theo thời gian nuôi cấy trong môi trường MRS Thời gian (giờ) Mật độ vi khuẩn L. acidophilus Log (CFU/ml) Mật độ vi khuẩn L. bulgaricus Log (CFU/ml) 0 1,89 5 3 2,33 5,3 6 4,81 6 9 6,08 6,95 12 7,3 7,08 15 8,33 7,15 18 8,37 8,2 21 8,34 8,08 24 8,3 8,18 27 8,28 8 30 8,22 7,7 33 7,8 6,96 36 7,31 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 10 20 30 4 Thời gian( giờ) Lo g( C FU /m l) 0 Hình 4.3: Đường cong sinh trưởng của L. acidophilus trong môi trường MRS broth. 34 Nhận xét: Từ đường cong sinh trưởng của vi khuẩn L. acidophilus chúng tôi nhận thấy: pha tiềm phát kéo dài trong khoảng 2 - 3 giờ đầu do số lượng tế bào vi khuẩn tăng lên không đáng kể. Độ dài pha tiềm phát tương đối ngắn chứng tỏ các tế bào vi khuẩn còn trẻ, nhanh chóng thích nghi với môi trường MRS broth. Từ 3 - 15 giờ, vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa, vi khuẩn sinh sản mạnh, sinh khối tăng nhanh, đây là pha cấp số của vi khuẩn. Số lượng tế bào vi khuẩn đạt cực đại ở 15 giờ, là thời điểm bắt đầu pha cân bằng. Pha cân bằng kéo dài từ 18 - 30 giờ, trong pha này sự sinh sản vẫn tiếp tục diễn ra ở một số tế bào trong môi trường nuôi cấy, tổng số tế bào mới được sinh ra bằng với tổng số tế bào chết bị mất đi, các chất d