Khóa luận Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri của vật liệu cellulose được tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trường

i lại thấp khiến hiệu quả điều trị bị giảm. Ngoài ra, trong thời gian sử dụng thuốc xuất hiện các tác dụng phụ nhƣ: phát ban, sốt, đau đầu, buồn nôn, tiêu chảy, sƣng mặt, môi, lƣỡi, khó thở, Cellulose vi khuẩn (CVK) đƣợc tạo ra bởi vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus có cấu trúc hóa học rất giống cellulose của thực 2 vật. CVK đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều l nh vực công nghệ do màng có các tính chất hóa lý đặc biệt nhƣ đƣờng kính sợi nhỏ (cỡ nanomet), độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, độ bền cơ học và khả năng thấm hút nƣớc cao, Trong l nh vực y học, CVK đã đƣợc nghiên cứu dùng làm tá dƣợc, mặt nạ chăm sóc da, mạch máu nhân tạo, màng sinh học trị bỏng và đặc biệt sử dụng làm hệ vận tải và phân phối thuốc. Kết quả nghiên cứu khác cho thấy CVK đƣợc lên men từ môi trƣờng chuẩn có tiềm năng làm hệ vận tải và phân phối thuốc qua đƣờng uống [12]. Nhằm khắc phục những hạn chế của thuốc và tăng khả năng hấp thụ của thuốc qua màng sinh học, qua đó nâng cao hiệu quả điều trị bệnh viêm loét dạ dày nên tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus nuôi cấy trong một số môi trường”. 2. Mục đ ch nghiên cứu So sánh khả năng hấp thụ omeprazole natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus trong một số môi trƣờng nuôi cấy, từ đó ứng dụng vào trong y học nhằm tăng khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri, tăng hiệu quả chữa bệnh. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo màng CVK từ 3 môi tƣờng chuẩn (MTC), nƣớc dừa già (MTD) và (MTG) nƣớc vo gạo. - Xử lí màng trƣớc khi hấp thụ thuốc. - Xác định lƣợng CVK tạo thành. - Hấp thụ thuốc omeprazole natri qua 3 loại màng chuẩn, màng dừa và màng gạo. - So sánh khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus trong MTC, MTD, MTG. 3 4. ngh a khoa học và th c tiễn 4.1. n o - Trau dồi tri thức khoa học thông qua tiến trình làm thí nghiệm và kết quả thu đƣợc. - Cơ sở để nghiên cứu những đề tài khoa học có liên quan, qua đó nâng cao tính ứng dụng của đề tài vào thực tiễn. 4.2. n t t n Kết quả nghiên cứu đề tài là cở sở để nghiên cứu chuyên sâu hơn nhằm hƣớng tới việc áp dụng vào thực tế sản xuất. Tìm ra màng hấp thụ thuốc tốt nhất nhằm tăng hiệu quả chữa bệnh. 5. T nh mới của đ tài Cung cấp các dữ liệu khoa học về khả năng hấp thụ thuốc omeprazole natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong một số môi trƣờng. 4 PHẦN 2. NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus 1.1.1. P ân loạ và đặ đ ểm của Gluconacetobacter Xylinus Phân loại: Cellulose vi khuẩn là sản phẩm của một số loài vi khuẩn nhƣ: Acetobacter, Achromobacter, Agrobecterium, Gluconacetobacter. Trong đó Gluconacetobacter xylinus cho năng suất cellulose vi khuẩn cao vì thế đƣợc nghiên cứu rộng. Cấu trúc cellulose vi khuẩn phù hợp cho nhiều ứng dụng trong các l nh vực khác nhau [6] Gluconacetobacter xylinus có thể đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau nhƣ từ nƣớc quả, hay từ một số loài thực vật nhƣ lá của cây cọ, từ giấm, từ thạch dừa, từ nấm Kombucha, trà,... Gluconacetobacter Xylinus thụộc nhóm Acetic, chi Acetobacter. Theo khóa phân loại của Bergey, G. xylinus thuộc: Lớp: Schizomycetes Bộ: Pseudomonadales Bộ phụ: Pseudomonadieae Họ: Pseudomonadaceae Đặc điểm của G. xylinus: Có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc ngang khoảng 0,6 - 0,8 µm, dài khoảng 2-3 µm. Vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào [6]. Lƣu ý: Tế bào có thể bị biến đổi hình dạng khi tế bào già hay do điều kiện môi trƣờng nuôi cấy: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [6]. Đặc điểm sinh lý của G. xylinus (Jonas et al., 1998): 5 + Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O. + Phản ứng catalase dƣơng tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men. + Chuyển hóa glucose thành acid gluconic. + Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton. + Không sinh sắc tố nâu. + Tổng hợp cellulose,... Đặc điểm sinh trưởng của G. xylinus: Nhiệt độ tối ƣu để G. xylinus phát triển là từ 250C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3. Theo Hestrin (1947) thì pH tối ƣu để G. xylinus phát triển là 5,5. nhiệt độ 370C và môi trƣờng dinh dƣỡng tối ƣu thì G. xylinus cũng không phát triển. Theo Maccormide et al. (1996) cho rằng G. xylinus có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ 120C đến 350C và có thể phát triển trong môi trƣờng có nồng độ ethanol lên tới 10%. 1.1.2. Cấu trú củ màn ellulose vi khuẩn tạo ra từ Gluconacetobacter Xylinus CVK là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là Gluconacetobacter xylinus. Những chuỗi polyme β-1,4-glucopyranose mạch thẳng tham gia cấu tạo CVK. Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của CVK giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể[10]. Theo AJ. Brown (1886), cấu trúc của CVK là tập hợp nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose có đƣờng kính 1,5 nm kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100 nm, rộng khoảng 3 – 8 nm [6]. 6 Hình 1.1. Cấu trúc của màng cellulose vi khuẩn 1.1.3. Tín ất củ màn ellulose tạo ra từ Gloconacetobacter Xylinus Vật liệu CVK có các tính chất độc đáo nhƣ: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn, khả năng thấm hút nƣớc cao, có thể bị thủy phân bởi enzyme,... Do đó, CVK đƣợc ứng dụng trong rất nhiều l nh vực công nghệ khác nhau nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin, đặc biệt trong l nh vực y học. Trong y học, vật liệu CVK thu đƣợc từ quá trình nuôi cấy t nh đƣợc nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo. Brazil, màng CVK ƣớt tinh sạch đƣợc sản xuất và bán ra thị trƣờng nhƣ một loại da nhân tạo dùng đắp vết thƣơng[19]. Trƣờng Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng đƣợc thực nghiệm ở thỏ. Kết quả cho thấy rằng màng CVK giúp vết thƣơng mau lành và ngăn không cho vết thƣơng nhiễm trùng [6]. Ngoài ra, sản phẩm CVK còn đƣợc ứng dụng làm màng băng vết thƣơng, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [8]. Sau khoảng từ 3 - 7 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng rắn, chúng phát triển dần, lúc này chúng có dạng nhỏ, nhày, có màu kem, hơi trong nhƣng đến khoảng một tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần. Trên môi trƣờng lỏng sau khoảng 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng dày đục, sau khoảng 36- 38 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày lên. 7 1.1.4. Chất í t í s n trưởng trong tạo màn Các vitamin cần thiết cho sự tăng trƣởng tế bào và tổng hợp màng cellulose. Vi khuẩn cần chất dinh dƣỡng và chất kích tố tăng trƣởng để sinh trƣởng và phát triển. Nƣớc dừa già và nƣớc vo gạo đáp ứng yêu cầu này. Trong nƣớc dừa già và nƣớc vo gạo có chất dinh dƣỡng và chất kích tố tăng trƣởng nhƣ: sorbitol, myoinositol, vitamin B1, B3, nhóm khoáng chất nhƣ sắt, đồng, kẽm và các acid amin. 1.1.4.1. Cao nấm men Cao nấm men là một sản phẩm đƣợc dùng trong nuôi cấy vi khuẩn. Đây là sản phẩm đã qua chế biến. Cao nấm men bao gồm các thành phần hòa tan của tế bào nấm men và đƣợc sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm nhƣ là hƣơng liệu thực phẩm, chất phụ gia và vitamin bổ sung cũng nhƣ nguồn dinh dƣỡng cho môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn sử dụng trong vi sinh học và công nghệ sinh học. Bảng 1.1. Thành phần cao nấm men Giá trị dinh dưỡng 100g Calo 185kcal Lipid 0,9g Cholesterol 0g Natri 2,962mg Kali 2,100mg Cacbohydrat 20g Chất xơ 7g Đƣờng 1,6g Protein 24g 8 Giá trị dinh dưỡng 100g Vitamin A 0IU Vitamin C 0mg Canxi 67mg Sắt 4mg Vitamin D 0IU Vitamin B6 0mg Vitamin B12 0,5µg Magie 180mg 1.1.4.2. Nước dừa già Đối với nƣớc dừa nếu sử dụng quá 3 ngày thì chất dinh dƣỡng sẽ giảm. Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già Nƣớc (%) 94,99 Đồng (mg/100g) 0,04 Protein (%) 0,72 Mangan (mg/100g) 0,142 Chất béo toàn phần (%) 0,2 Selen (µg/100g) 1 Cacbohydrat (%) 3,17 Vitamin C (mg/100g) 2,4 Đƣờng (%) 2,16 Vitamin B1 (mg/100g) 0,03 Canxi (mg/100g) 24 Vitamin B2 (mg/100g) 0,057 9 Magie (mg/100g) 25 Vitamin B3 (mg/100g) 0,08 Sắt (mg/100g) 0,29 Vitamin B5 (mg/100g) 0,043 Photpho (mg/100g) 20 Vitamin B6 (mg/100g) 0,032 Kali (mg/100g) 250 Kẽm (mg/1 00g) 0,1 1.1.4.3. Nước vo gạo Đối với nƣớc vo gạo nếu sử dụng quá 3h dẫn đến nƣớc bị chua làm giảm đƣờng và các chất dinh dƣỡng khiến hiệu suất kém. Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo Thành phần Hàm lƣợng Vitamin nhóm B (B1, B2, B5, B6) 30-60% Protein 15,7% Đƣờng 2% Khoáng chất Fe (7 - 8%), Zn (12 – 13%) Acid amin Leucine, valine, lysine 1.1.5. Ứng dụng củ màn ellulose v uẩn Trên thế giới, màng CVK đã đƣợc ứng dụng nhiều trong các l nh vực công nghệ khác nhau: Dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc và nhiều ứng dụng khác [20]. Trong l nh vực y học, màng CVK đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị các 10 bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời [20]. Amin et al. [14] đã báo cáo việc sử dụng màng CVK làm màng bọc cho paracetamol bằng cách sử dụng k thuật phun phủ. 1.2. Thuốc omeprazole natri 1.2.1. Côn t ức cấu tạo Công thức phân tử: C17H19N3O3S Phân tử lƣợng: 345,4 đvC Hình 1.2. Công thức cấu tạo thuốc Omeprazole Tên khoa học: 5 - methoxy-2-[[(4 - methoxy - 3,5 - dimethyl – 2 - pyridinyl) methyl] sulfinyl] - 1H - benzimidazole. 1.2.2. Lý tín Omeprazole natri dƣới dạng bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà. Nóng chảy ở khoảng 1550C kèm theo sự phân huỷ, khó tan trong nƣớc, khó tan trong aceton và isopropanol, tan trong dicloromethan, methanol và ethanol [11, 18]. 1.2.3. Hoá tín Omeprazole natri vừa có tính acid, vừa có tính base, hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại. Các tính chất này đƣợc ứng dụng trong định tính, định lƣợng và trong bào chế omeprazole natri. Độ ổn định của omeprazole natri phụ vào pH. Trong môi trƣờng acid, omeprazole natri nhanh chóng bị phân huỷ, trong môi trƣờng kiềm omeprazole natri khá bền vững [11]. 1.2.4. Dượ lý và ơ ế tá dụng 11 Omeprazole natri là một dẫn xuất của benzimidazole không có hoạt tính ức chế enzym ở môi trƣờng trung tính, nhƣng ở pH = 5 omeprazole natri đƣợc proton hoá thành 2 dạng acid sulphenic và sulphenamic. Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfohydryl của enzym H+ - K+ - ATPase ở tế bào thành nên ức chế bài tiết acid trên 48 giờ. Do vậy, omeprazole natri đƣợc dùng điều trị trong các trƣờng hợp : trào ngƣợc dạ dày thực quản, loét dạ dày tá tràng, hội chứng Zollinger- Ellison [1]. Dược động học [1]: Omeprazole natri là một chất ức chế bài tiết dịch vị dạ dày do ức chế bơm proton ở các tế bào thành dạ dày. Thuốc có tác dụng nhanh, kéo dài. Omeprazole natri đƣợc hấp thu tốt ở ruột non sau khi uống khoảng 3 – 6 giờ. Khi uống liều đầu tiên thì sinh khả dụng đạt khoảng 35% và đạt tới trên 60% sau khi dùng vài liều. Sự hấp thu của thuốc phụ thuộc vào liều dùng, không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn. Thuốc liên kết cao với protein huyết tƣơng (khoảng 95%) và đƣợc phân bố vào các mô đặc biệt ở các tế bào thành dạ dày. Thời gian bán thải của thuốc ngắn (khoảng 40 phút), nhƣng tác dụng ức chế bài tiết kéo dài, nên có thể chỉ cần dùng một liều mỗi ngày. Omeprazole natri hầu nhƣ chuyển hoá hoàn toàn tại gan, đào thải nhanh chóng, chủ yếu qua nƣớc tiểu (80%), phần còn lại theo phân. Các chất chuyển hoá không có hoạt tính, nhƣng lại tƣơng tác với nhiều thuốc khác do tác dụng ức chế các enzym CYT.P450 của tế bào gan. Dƣợc động học của thuốc thay đổi không có ý ngh a ở ngƣời già hay ngƣời có chức năng thận suy giảm. Với những ngƣời suy giảm chức năng gan, sinh khả dụng của thuốc tăng và độ thanh thải giảm, nhƣng không có biểu hiện tích luỹ thuốc trong cơ thể. Chỉ định: Trào ngƣợc dạ dày - thực quản; Loét dạ dày – tá tràng; hội chứng Zollinger – Ellison. Chống chỉ định: Mẫn cảm với thuốc. Phản ứng bất lợi: Khi dùng thuốc omeprazole natri để điều trị bệnh thƣờng gặp một số phản ứng nhƣ: Rối loạn tiêu hoá, buồn nôn và nôn, đau bụng, trƣớng bụng. Các phản ứng ít gặp nhƣ mất ngủ, chóng mặt, mày đay, ra mồ hôi... 12 Liều dùng và cách dùng: Liều thƣờng dùng cho ngƣời lớn là 20 – 40 mg/lần/ngày, thời gian điều trị từ 4 – 8 tuần. Công ty Astra là công ty đầu tiên (nay là AstraZeneca) nghiên cứu viên nang omeprazole natri sử dụng làm thuốc điều trị và đăng ký lƣu hành từ năm 1988 với tên biệt dƣợc Losec (đƣợc công nhận là thuốc phát minh, Innovator), với doanh số khoảng 8 tỷ dola mỗi năm. Tuy nhiên, khi chƣa hết hạn bản quyền (1997), AstraZeneca đã xin rút đăng ký sản phẩm này ở một số nƣớc thành viên chính của EU, và cho ra đời viên nén và viên nang Losec MUPs (omeprazole natri + magnesi). Mặc dù chế phẩm mới đã đƣợc đánh giá TĐSH với chế phẩm Losec gốc nhƣng nhiều nƣớc không coi Losec MUPs là chế phẩm innovator. Từ đó, trên thị trƣờng hầu nhƣ chỉ còn lƣu hành chế phẩm generic của omeprazole natri đã đƣợc đánh giá TĐSH với Losec hoặc chế phẩm đƣợc cấp phép ở các nƣớc Losec không đƣợc đăng ký bản quyền, nhƣ Apo – omeprazole natri, (Apotex - Canada), Probitor (Biochemie - o). 1.3. Tình hình nghiên cứu trên th giới và Việt Nam 1.3.1. Trên t ế giới Màng CVK: Những nghiên cứu về màng CVK đƣợc thế giới rất quan tâm. Có rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng màng CVK trong nhiều các l nh vực khác nhau. Có thể kể đến l nh vực thực phẩm: màng bảo quản trái cây, chất ổn định thực phẩm,; l nh vực y học: tạo ruột giả, màng trị bỏng, mạch máu nhân tạo trong điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dƣỡng da,. Trong y học, nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo từ màng CVK thu đƣợc trong quá trình nuôi cấy t nh. Brazil, sản xuất và bán màng CVK ƣớt tinh sạch ra thị trƣờng nhƣ một loại da nhân tạo dùng đắp vết thƣơng, Brown (1989) và cộng sự, dùng màng nhƣ là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (1989), đã dùng CVK làm vải đặc biệt, để sản xuất giấy chất lƣợng cao, làm cơ chất để cố định protein hay cho sắc kí. 13 Tuy nhiên, những ứng dụng thƣờng thấy trên thế giới của màng CVK là dùng trong ngành dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Harmlyn và cộng sự (1997), Cienchanska (2004), Legara và cộng sự (2004), Wan và Millonn (2005), Czaja và cộng sự (2006) đã dùng màng CVK làm da nhân tạo, làm mặt nạ dƣỡng da cho phụ nữ. Thuốc omeprazole natri: Nhiều đề tài hƣớng tới tăng khả năng hấp thụ thuốc, phát huy ƣu điểm của thuốc nhằm tăng hiệu quả chữa trị bệnh. 1.3.2. Ở Việt Nam Màng CVK: Những đề tài liên quan đến màng CVK đang rất đƣợc quan tâm. Trƣờng Đại học Y dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng đƣợc thực nghiệm ở thỏ. Thuốc omeprazole: Đã có đề tài nghiên cứu liên quan đến thuốc omeprazole natri. Omeprazole natri đƣợc sử dụng nhiều trong chữa trị các bệnh nhƣ: trào ngƣợc dịch dạ dày - thực quản, loét dạ dày - tá tràng, hội chứng Zollinger - Ellison nhƣng không có nhiều nghiên cứu nhằm hạn chế các tác dụng phụ, do đó, đề tài mở ra một hƣớng mới nhằm tăng sinh khả dụng của omeprazole natri đồng thời hạn chế tác dụng phụ của thuốc. 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 2.1.1. tượn n ên ứu Khả năng hấp thụ thuốc của màng CVK đƣợc nuôi cấy tại Phòng sạch Vi sinh – Động vật, Viện nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 2.1.2. N uyên l ệu và ó ất - Nguyên liệu: nƣớc dừa già, nƣớc vo gạo, nƣớc cất, cao nấm men. - Hóa chất: + Thuốc omeprazole natri dƣới dạng bột kết tinh trắng hoặc trắng ngà ( nguồn gốc ở Trung Quốc). + Dịch giống. + Đƣờng glucose, acid acetic, acid citric, peptone, Diamoni photphat, amoni sunfat, NaOH. 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản) - Cân phân tích, cân kỹ thuật (Sartorius – Thụy Sỹ) - Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIRAIAMA - Buồng cấy vô trùng (Haraeus) - Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức) - Bể ổn nhiệt 1013 - Máy khuấy từ gia nhiệt CC162 (IKA- Đức) - Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu - Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump – Anh) 15 - Và các dụng cụ hóa sinh thông dụng khác: Hộp nhựa, bình thủy tinh, ống nghiệm, đũa thủy tinh, giấy lọc, lọ thủy tinh loại nhỏ, cuvet, pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml, . 2.2. Phạm vi nghiên cứu, địa điểm và thời gian 2.2.1. P ạm v n ên ứu Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc Omeprazole natri của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus trong một số môi trƣờng nuôi cấy tại phòng sạch của Viện Ngiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội 2. 2.2.2. ị đ ểm và t n n ên ứu Địa điểm: Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng,Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. Thời gian: 15 tuần (1/12/2018 đến 21/3/2019) 2.3. Phư ng pháp nghiên cứu  Phƣơng pháp tạo màng CVK từ một số môi trƣờng.  Phƣơng pháp xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ.  Phƣơng pháp xác định khối lƣợng CVK tạo thành.  Phƣơng pháp sử dụng đƣờng chuẩn xác định khối lƣợng thuốc hấp thụ qua màng CVK.  Phƣơng pháp xử lý thống kê.  Phƣơng pháp so sánh. 2.3.1. P ươn p áp ế tạo v t l ệu C 2.3.1.1. Môi trường lên men thu vật liệu CVK Tạo màng CVK từ 3 môi trƣờng: môi trƣờng nƣớc vo gạo (MTG), môi trƣờng chuẩn (MTC), môi trƣờng nƣớc dừa già (MTD). ướ Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng 2.1. 16 Vật liệu CVK đƣợc tạo ra từ 3 môi trƣờng khác nhau ở bảng 1: môi trƣờng nƣớc vo gạo (MTG), môi trƣờng chuẩn (MTC), môi trƣờng nƣớc dừa già (MTD) [..]. ước 2: Hấp khử trùng các môi trƣờng ở 1130C trong 15 phút. ước 3: Lấy các môi trƣờng ra khử trùng bằng tia UV trong 15 phút rồi để nguội môi trƣờng. ước 4: Thêm 10% dịch giống, lắc đều tay để giống phân bố đều trong dung dịch. ước 5: Đổ dịch sang các khay nhựa, dùng gạc vô trùng bịt miệng các khay nhựa, đặt t nh trong khoảng 4 – 14 ngày ở 280C. ước 6: Thu vật liệu CVK thô và tiến hành xử lí vật liệu CVK trƣớc khi hấp thụ thuốc. Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo vật liệu CVK Thành phần Môi trường MTC MTD MTG Glucose 20g 30g 30g Pepton 5g 10g 10g Diamoni photphat 2,7g 0,3g 0,3g Amoni sulfat 0,5g 0,5g Cao nấm men 5g Acid citric 1,5g Acid acetic 2% 2% 2% Nƣớc dừa già 1000ml Nƣớc vo gạo 1000ml Nƣớc cất 2 lần 1000ml Dịch giống 10% 10% 10% 17 Thêm dịch giống vào từng môi trƣờng với lƣợng nhƣ nhau và tối thiểu bằng 10% thể tích môi trƣờng; pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh = 4-6 [10, 19], pH thấp sẽ tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác [10]. 2.3.1.2. Xử lý vật liệu CVK trước khi hấp thụ thuốc Mục đ ch: Trong môi trƣờng nuôi cấy có chứa các tạp chất nên cần xử lí để loại bỏ chúng, đồng thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn. Phư ng pháp: Trong nuôi cấy t nh, màng CVK hình thành trên bề mặt môi trƣờng nuôi cấy, lấy màng ra khỏi môi trƣờng sau khi màng đã đáp ứng tiêu chuẩn trong nghiên cứu. + Trong vật liệu chứa một lƣợng lớn vi khuẩn, vì vậy, hấp vật liệu trong NaOH nóng 3%, nhiệt độ 1130C trong thời gian 15 phút bằng nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn trong thời gian 1giờ. + Tiến hành ngâm màng trong NaOH, sau đó lấy màng đặt dƣới vòi nƣớc chảy đến khi màng trắng trong. Dùng quỳ tím để kiểm tra môi trƣờng bề mặt màng cần đạt là trung tính, cuối cùng thu đƣợc màng tinh khiết [3], [16]. 2.3.1.3. Đánh giá độ tinh khiết của vật liệu CVK Mục đ ch: Nhằm đảm bảo màng sau khi xử lý đã loại đƣợc các tạp chất có thể gây độc hại bằng cách kiểm tra sự hiện diện của đƣờng glucose và protein của vi khuẩn. * Tìm s hiện diện của glucose trong v t liệu CVK tinh chế Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện diện của đƣờng D – glucose: nếu có sẽ xuất hiện kết tủa nâu đỏ [5]. Ti n hành: + Dịch thử của màng CVK các loại sau khi đã xử lý hóa học. + Mẫu đối chứng: nƣớc cất và dung dịch D – glucose. + Cho vào các ống nghiệm chứa mẫu thử mỗi ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling rồi ngâm trong cốc nƣớc nóng. + Quan sát màu sắc kết tủa xuất hiện trong ống nghiệm. 18 *Tìm s hiện diện của protein trong v t liệu CVK tinh chế Nguyên tắc: Dùng phản ứng tạo kết tủa của protein với acid triclor acetic để định tính protein còn lại trong vật liệu. Ti n hành: Cắt nhỏ vật liệu CVK tinh chế, cho vào 50ml nƣớc cất, lắc kỹ với máy rung siêu âm trong 10 phút. Dùng phản ứng tạo kết tủa của protein với acid triclor acetic để định tính protein còn lại trong vật liệu. Nƣớc cất (mẫu chứng âm) và dung dịch pepton 1% - pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn (mẫu chứng dƣơng). Phản ứng dƣơng tính khi cho kết tủa. So sánh với mẫu chứng âm không chứa protein [5]. Vật liệu CVK tinh chế dùng để tạo vật liệu nạp thuốc omeprazol natri phải đạt đƣợc những tính chất sau: dẻo dai, mềm mại, mỏng, màu trắng, có khả năng áp sát vào da, có tính che phủ tốt. + Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nƣớc và dịch mô [13]. 2.3.2. P ươn p áp d n đư ng chuẩn của thu c Omeprazole natri Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến UV-Vis (phƣơng pháp quang phổ hấp thụ điện tử) phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện tử. Chúng tôi sử dụng máy đo quang phổ UV- 2450 (Shimadru - Nhật Bản) để đo phổ vùng tử ngoại và khả kiến. Máy bao gồm hệ thống quang học có khả năng cung cấp ánh sáng đơn sắc trong dải từ 200 – 800nm. Chúng tôi sử dụng hai cuvet đo dùng cho dung dịch thử và dung dịch đối chiếu đƣợc làm từ chất liệu thạch anh, dung sai về độ dài quang trình của cốc đo là ± 0,005cm. Các cuvet đo đƣợc làm sạch và thao tác thận trọng [2]. Nồng độ sau khi khảo sát đã tìm đƣợc là 30mg/ml Tiến hành thí nghiệm: + Cân 0,6g thuốc omeprazole natri bằng cân phân tích + Đổ vào bình thủy tinh 100ml + Cho 20ml dung dịch NaOH cho vào bình thủy tinh đã có thuốc 19 + Lấy màng dừa, gạo, chuẩn có đƣờng kính là 1,5 cm và độ dày lần lƣợt là 0,5 và 1 đem cân. Sau đó, chia vào các bình có chứa dung dịch đã pha. + Đem dung siêu âm trong giời gian 15 phút với nhiệt độ là 40oC + Sau khi dung siêu âm xong cho sang máy lắc ở 100v/p trong thời gian là 2h. + Lấy màng ra khỏi dung dịch, hút dung dịch và dùng dịch này để đo UV -2450 với OD là 275nm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. + Tiến hành tƣơng tự ở chế độ lắc 120 vòng/phút và 50 độ. Pha các dung dịch omeprazole natri trong NaOH 0,1N ở các nồng độ lần lƣợt: 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% mg/ml. Đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 275nm của các dung dịch chuẩn bị theo dãy trên với dung dịch NaOH 0,1N là mẫu trắng. Và xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn mối tƣơng quan giữa độ hấp thụ và nồng độ omeprazole natri. Đo mật độ quang phổ tử ngoại (OD) của các dung dịch trên tại bƣớc sóng 275nm bằng máy UV – 2450. Lấy giá trị trung bình quang phổ của thuốc omeprazole natri sau 3 lần đo để xây dựng đƣờng chuẩn của thuốc. Phƣơng trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ omeprazole natri và độ hấp thụ. Phư ng trình biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ có dạng: y = ax + b với R2 là hệ số tƣơng quan Trong đó: y là độ hấp thu của dung dịch tại λmax x là nồng độ của dung dịch omeprazole natri 2.3.3. P ươn p áp xá địn lượng thu c omeprazole natri hấp thụ vào màn ellulose Màng cellulose sau khi đƣợc sản xuất và làm sạch, sẽ đem đi hấp thụ thuốc omeprazole natri. Tạo màng chuẩn, màng gạo, màng dừa có đƣờng kính 1,5 cm, độ dày lần lƣợt 1 cm và 0,5 cm. 20 Tham khảo các nghiên cứu trƣớc đó, xác định đƣợc chế độ lắc, nhiệt độ tốt nhất cho màng hấp thụ thuốc omeprazole natri. Bảng 2.2. Các th nghiệm cần làm để tìm ra đi u kiện tốt nhất STT Đường k nh (cm) Độ dày màng (cm) Ch độ lắc (Vòng/phút) Nhiệt độ ( o C) 1 d=1,5 1 100 40 2 50 3 120 40 4 50 5 0,5 100 40 6 50 7 120 40 8 50 Sau khi đã xác định đƣợc mẫu màng hấp thụ thuốc omeprazole natri ở nhiệt độ, chế độ lắc tốt nhất. Sau khoảng thời gian hấp thụ xác định, lấy dung dịch omeprazole natri chứa vật liệu cellulose nêu trên đo quang phổ bằng máy UV – 2450 . Từ đó, xác định đƣợc nồng độ thuốc, khối lƣợng thuốc còn trong dung dịch. Công thức t nh lượng thuốc hấp thụ vào màng cellulose: mht=m1-m2 (mg) Trong đó: mht là khối lƣợng thuốc đã hấp thụ