Khóa luận Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium Anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA-ITS

chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) -Tách đoạn DNA 940C 1 phút -Ủ bắt cặp 560C 1 phút - Kéo dài 720C 2 phút Kéo dài 720C 6 phút Ủ 40C 10 phút 20 Sau khi có đƣợc sản phẩm của phản ứng PCR lần một, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR lần hai với cặp primer METPR2/METPR5. Trình tự cặp primer METPR2/METPR5. - METPR2: 5’AGG TAG GCA GCC AGA CCG GC 3’ - METPR5 : 5’TGC CAC TAT TGG CCG GCG CG 3’ (Nguồn : Leger St., 1992) Bảng 3.3: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với căp̣ primer METPR2/METPR5 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 5X 5 l 1X MgCl2 25 mM 2.5 l 2.5 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0.2 M METPR 2 10 pM 1 l 10 pM METPR 5 10 pM 1 l 10 pM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng Nƣớc 14.1 l Tổng thể tích 25 l Quy trình PCR Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Tách đoạn DNA 940C 4 phút Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) -Tách đoạn DNA 940C 1 phút -Ủ bắt cặp 560C 1 phút - Kéo dài 720C 2 phút Kéo dài 720C 6 phút Ủ 40C 10 phút 21 3.4.3. Khuếch đại vùng ITS Primer đƣợc sử dụng để khuếch đại vùng ITS có trình tự nhƣ sau: - ITS 4: 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’ - ITS 5 : 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’ Hình 3.2: Sơ đồ primer đƣơc̣ sƣ̉ duṇg khuếch đaị vùng ITS Bảng 3.4: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đaị vùng rDNA-ITS Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 5X 10 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 1.5 mM dNTP 25 mM 0.4 l 0.2 M ITS 4 10 pM 1 l 10 pM ITS 5 10 pM 1 l 10 pM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 33.4 l Tổng thể tích 50 l 22 Quy trình PCR Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Tách đoạn DNA 950C 3 phút Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) - Tách đoạn DNA 950C 1 phút - Ủ bắt cặp 580C 45 giây - Kéo dài 720C 1 phút Kéo dài 720C 5 phút Ủ 40C 10 phút 3.5. Tiến hành giải trình tự gen gây độc Pr1 và vùng ITS trên nấm Metarhizium anisopliae Sau khi chạy PCR chúng tôi tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vừa khuếch đại để xác định chính xác đây là đoạn gen gây độc Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nhằm xác định trình tự nucleotide của đoạn gen độc này, từ đó so sánh với nhƣ̃ng trình tƣ ̣trên Genbank . Đầu tiên để đạt đƣợc kết quả cao nên phải tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để việc đọc trình tự đạt kết quả cao. 3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR 1.Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc đã khử trùng sạch (số lƣợng GFX tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch). Cho vào GFX 500µl capture buffer. 2.Cho 100 µl sản phẩm PCR vào GFX. 3.Trộn đều lên xuống bằng pipette khoảng 4-6 lần. 4.Ly tâm với tốc độ khoảng 12000 vòng trong 30 giây ở 40C. 5.Loại bỏ dung dịch trong ống thu dịch lọc, sau đó đặt lại GFX vào ống thu dịch lọc. 6.Thêm 500 µl wash buffer vào cột GFX. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng khoảng 30 giây ở 40C. 7.Loại bỏ ống thu dịch lọc và chuyển GFX sang effpendorf mới. 23 8.Thêm 50 µl elution buffer trực tiếp vào giữa cột GFX. 9.Giữ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. 10.Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút ở 40C. Sản phẩm tinh sạch đƣợc bảo quản ở- 40C Thành phần của phản ứng đọc trình tự Buffer đƣợc sử dụng ở nồng độ 5X nhƣng nồng độ cuối cùng phải đạt là 1X. Bảng 3.5: Thành phần phản ứng đọc trình tự Thành phần Nồng độ Thể tích(µl) - BDT mix 2,5 X 4 µl - Buffer 5 X 2 µl - Primer 3.2 pmol 1 µl - DNA khuôn 10-40 ng 1 µl - Nƣớc cho đến 10 µl  Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự. Đối với gene Pr1 1. Đặt tube vào máy PCR và chỉnh đúng các thông số. 2. Biến tính hoàn toàn: 960C trong 1 phút. 3. Lặp lại 25 chu kỳ: 960C trong 10 giây. 50 0C trong 5 giây. 60 0 C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. Đối với vùng ITS 1. Đặt tube vào máy và chỉnh đúng các thông số. 2. Biến tính hoàn toàn: 950C trong 5 phút. 3 .Lặp lại 25 chu kỳ: 950C trong 30 giây. 50 0C trong 10 giây. 60 0C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. 24 3.7. Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự Sản phẩm đọc trình tự đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp EDTA . - Cho 5 µl EDTA vào mỗi eppendorf. - Thêm vào 60 µl ethanol 100% mỗi eppendorf. - Trộn đều lên xuống hỗn hợp vài lần. - Đem ủ mẩu ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút. - Ly tâm tốc độ 12000 vòng trong 30 phút. - Loại bỏ phần dịch bên trên, thêm vào 60µl ethanol 70%. - Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C. - Lọai bỏ dịch, thu DNA, làm khô ở nhiệt độ phòng. - Làm tan DNA bằng cách cho vào 2 µl hidiformamide, biến tính 950C trong 3 phút. Chạy điện di và ghi nhận tính hiệu trên máy sequencer ABI PRISM 3100. 3.8. Phƣơng pháp phân tích trình tự Hình 3.3: Sơ đồ những phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong phân tích trình tự 25 Trình tự Sắp gióng cột bằng chƣơng trình ClustalX Gói phần mềm Phylip Seqboot DNApars Consense Chọn ra cây phân loài tốt nhất Hình 3.4: Sơ đồ phân tích trình tƣ ̣có đô ̣tƣơng đồng cao 26 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kiểm tra DNA tổng số của các mẫu nấm Metarhizium anisopliae đƣợc sử dụng trong nghiên cứu DNA tổng số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 tạp nhiễm Tạt Hình 4.1: DNA tổng số của nấm Metarhizium anisopliae Ghi chú: 1.BDTN 6.BDBD7 2.SCLLLA 7.BXDTV 3.RNBT 8.BDTV5 4.RNLA 9.BDQ96 5.BXDTG 10.RBC96 Kết quả điêṇ di cho thấy DNA tổng số của tất cả các dòng nấm dùng trong nghiên cƣ́u đ ƣợc ly trích khá tốt , không xuất hiêṇ hiêṇ tƣơṇg DNA bi ̣ gaỹ hoăc̣ bi ̣ smear. Tuy nhiên vâñ còn xuất hiêṇ tap̣ trong quá trình ly trích . Tạp nhiễm sẽ ảnh hƣởng không tốt tới kết quả của phản ƣ́ng PCR vì se ̃ƣ́c chế phản ứng. Chính vì lý do 27 đó chúng tôi đa ̃tiến hành tinh sac̣h DNA tổng số . Quy trình tinh sac̣h đƣơc̣ thể hiêṇ ở hình 4.2 50 µl DNA +150 µl H2O cất Thêm 120 µl Choloroform :Isoamylalcohol (24:1) Ly tâm 5-10 phút/9000-9800 rpm Thu dic̣h nổi Thêm 120 µl Choloroform :Isoamylalcohol (24:1) Ly tâm 5-10 phút/9000-9800 rpm Thu dic̣h nổi Điêṇ di kiểm tra kết quả Cho 0.6 V isopropanol Cho TE 1X Ủ ở -20oC trong 30 phút Phơi khô mâũ Ly tâm 20 phút/5000 rpm Ly tâm bỏ dic̣h nổi Bỏ dịch nổi Ethanol 70% Ethanol 70% Ly tâm bỏ dic̣h nổi Hình 4.2: Sơ đồ tinh sac̣h DNA tổng số của các mâũ nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong nghiên cƣ́u 28 4.2. Kết quả tinh sac̣h DNA tổng số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 4.3: DNA tổng số của nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ tinh sac̣h Ghi chú: 1.BDTN 6.BDBD7 2.SCLLLA 7.BXDTV 3.RNBT 8.BDTV5 4.RNLA 9.BDQ96 5.BXDTG 10.RBC96 DNA tổng số sau khi đƣơc̣ tinh sac̣h đƣơc̣ kiểm tra bằng điêṇ d i trên gel 1% ở hiêụ điêṇ thế 100V trong 20 phút. Kết quả tinh sac̣h cho thấy không còn xuất hiêṇ tap̣ . Chúng tôi quyết định chọn những mẫu DNA tổng số sau khi đã tinh sạch để thực hiện nhƣ̃ng nghiên cƣ́u tiếp theo. 4.3. Kết quả khếch đại vùng rDNA-ITS 1 2 3 4 5 L 6 7 8 9 10 Hình 4.4: Khuếch đại vùng rDNA-ITS 29 Ghi chú: 1.BDTN 4.BDBD7 2.SCLLLA 5.BXDTV 3.RNBT 6.BDTV5 4.RNLA 7.BDQ96 8.BXDTG 9.RBC96 10.BDBD7 L. Ladder Tất cả các nguồn nấm Metarhizium anisopliae phân lập từ những địa phƣơng khác nhau và trên các đối tƣợng ký chủ khác nhau đều cho sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc giống nhau. Kích thƣớc của sản phẩm khuếch đại là 590 bp. 4.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS1-5.8S - ITS2 Sản phẩm khếch đại đƣợc tinh sạch và đọc trình tự bằng máy ABI PRISM 3100. Nhận xét kết quả: Trình tự của 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣợc đọc bằng cả hai primer ITS4 và ITS5 đều cho kết quả rõ ràng và ổn định.Tuy nhiên trình tự của mỗi dòng nấm khi đƣợc đọc bằng một primer là không hoàn chỉnh (mất một số nucleotide ở vị trí kết thúc quá trình giải trình tự ). Vì thế chúng tôi đã tiến hành đọc bằng cả hai primer và chọn ra vùng đáng tin cậy nhất để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo. Để đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền giữa những dòng Metarhizium anisopliae ở trong nƣớc so với trên thế giới, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự của các dòng trong nƣớc với những trình tự thu thập đƣợc trên genbank trong NCBI. Những dòng nấm đƣợc sử dụng trong so sánh đƣợc trình bày trong bảng 4.1 30 Bảng 4.1: Các nguồn nấm Metarhizum anisopliae trên genbank đƣợc dùng để so sánh trình tự vùng rDNA-ITS Trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 đọc đƣợc là 473 nu. Vùng gen 5,8 S có kích thƣớc 158 nu nằm ở vị trí từ nu thứ 138 đến nu thứ 296. Kích thƣớc vùng ITS1 và ITS2 lần lƣợt là 138 nu và 177 nu. Kích thƣớc này giống với kích thƣớc vùng ITS của những nấm gây bệnh trên côn trùng khác đã đƣợc báo cáo nhƣ Beauveria bassiana và Paecilomyces fumosoroseus (Driver và Milner, 1998).Tỷ lệ G+C của vùng ITS1 là 43,2 %, của vùng ITS2 là 59,3 %, của vùng 5,8 S là 45,9 %. Tỷ lệ G+C trên toàn vùng trình tự đọc đƣợc là 51,2 %. Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc đƣơc̣ tạo bởi chƣơng trình Phylip Distance Matrix trong phần mềm ClustalX Ký hiệu Dòng phân lập Nơi phân lập Tác giả Ngày công bố AB071712 AB071714 AF136376 AF137064 AF137065 AF137066 AF516320 AF516324 AY635454 DQ177432 DQ679899 EF051717 EF051721 EF113338 EF113341 M.a.var.anisopliae M.a.var.anisopliae M.a.var.anisopliae M.a.var.acridum M.a.var.lepidiotum M.a.var.lepidiotum M.a.var.anisopliae M.a.var.acridum M.a.var.anisopliae M.a.var.lepidiotum M.a.var.anisopliae M.a.var.anisopliae M.a.var.anisopliae M.a.var.acridum M.a.var.anisopliae Japan Japan Australia Australia Australia Australia Greece Greece Canada China USA Brazil Brazil China China Yazawa,C. và Shimizu,S Yazawa,C. và Shimizu,S Driver và ctv Driver,F. và Milner,R.J Driver,F. and Milner,R.J Driver và ctv Pantou và ctv Pantou và ctv Small,C.-L.N. và ctv Huang,B và ctv Flor,L.B Arruda,W. và ctv Arruda,W. và ctv Guo,L. và Huang,J Guo,L. và Huang,J 18-9-2001 18-9-2001 19-3-1999 25-3-1999 25-3-1999 25-3-1999 29-3-2002 29-3-2002 25-3-2004 23-8-2005 07-6-2006 09-10-2006 09-10-2006 10-10-2006 10-10-2006 31 Bảng 4.2: Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc khi so sánh trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS BDQ96 BXDTV BDTN BDTV5 SCLLLA RNBT RNLA BDBD7 BXDTG RBCQ9 BDQ96 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BXDTV 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BDTN 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BDTV5 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 SCLLLA 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 RNBT 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 RNLA 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BDBD7 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BXDTG 99 99 99 99 99 99 99 99 100 100 RBCQ9 99 99 99 99 99 99 99 99 100 100 Kết quả so sánh cho thấy sự giống nhau cao về trình tƣ ̣nucleotide trong vùng rDNA-ITS (99-100%) giƣ̃a các dòng nấm . Nhƣ vây có sƣ ̣tƣơng đồng cao về mặt di truyền giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae. Tuy nhiên có sự khác biệt giữa dòng BXDTG và RBCQ9 với những dòng còn lại. Sự khác biệt giữa BXDTG và RBCQ9 với những dòng còn lại là 1%. Chúng tôi đã phát hiện đƣợc 4 vị trí đột biến ở hai dòng BXDTG và RBCQ9 so với những dòng còn lại. Đó là đột biến thay thế T bằng C ở vị trí Nu thứ 32 , đột biến thêm T ở vị trí nu thứ 109 và 122, đột biến còn lại là thêm một A ở vị trí nu thứ 133. Những đột biến này rất có ý nghĩa trong việc chọn lọc những dòng nấm có hoạt tính mạnh trong việc tiêu diệt côn trùng có hại. Sự tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các dòng BDTN, BDTV5, BDBD7 và BDQ96, giữa RNLA và RNBT là 100% . Những dòng nấm này gây bệnh trên cùng một ký chủ là bọ dừa và rầy nâu nhƣng lại có sự khác biệt về vị trí địa lý nhƣ Bình Định, Trà Vinh, Tây Ninh, Bến Tre và Quận 9-Thành phố Hồ chí minh. Điều này cho thấy sự khác biệt về vị trí địa lý không ảnh hƣởng tới sự đa dạng về mật di truyền giữa những dòng nấm với nhau. 32 Mặt khác kết quả so sánh cũng cho thấy sự khác biệt giữa RNLA và SCLLLA là 0%. Những dòng nấm này có cùng nơi phân bố là Long An nhƣng lại gây bệnh trên các ký chủ khác nhau là rầy nâu và sâu cuốn lá. Nhƣ vậy sự khác biệt về ký chủ không là yếu tố ảnh hƣởng tới sự khác biệt về mặt di truyền giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc. Sử dụng ph ƣơng pháp Bootstrap Maximum Parsimony trong gói phần mềm Phylip chúng tôi xác định đƣợc cây phân nhánh di truyền tốt nhất giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae với 100 lần lăp̣ laị. Đơn vi ̣ di truyền 0.1 Hình 4.5: Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS Có sự phân nhánh giữa các dòng nấm trong nƣớc với nhau: Nhóm I gồm các dòng : RNBT, BXDTV, SCLLLA, RNLA, BDTV5, BDTN, BDBD7 và BDQ96. Các dòng này không có sự khác biệt về trình tự trong vùng rDNA - ITS. Nhóm II gồm các dòng :BXDTG và RBCQ9 với 1% sƣ ̣khác biêṭ so với nhƣ̃ng dòng còn lại. Vùng ITS1-5.8S-ITS2 của nấm bao gồm vùng bảo tồn 5.8S nên không có ý nghĩa nhiều trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền và 2 vùng biến động là ITS1 và 33 ITS2. Kết quả so sánh ở trên cho thấy toàn bộ những điểm đột biến đều nằm trong vùng ITS1 và không có sự khác biệt trong vùng ITS2. Nhƣ vậy so với vùng ITS2, vùng ITS1 có sự biến động hơn so với vùng ITS1. Kết quả này cũng phù hơp̣ với nghiên cƣ́u của Hershkovitz và Lewis ,1996; Kuninaga và ctv , 1997 và Zare và ctv , 1999. Do đó chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng ITS1. Tỉ lệ đột biến trong vùng ITS1 là 2.9% (4/139 nu), đó đều là những điểm đột biến xảy ra ở 2 dòng BXDTG và RBCQ9. Do sƣ ̣tƣơng đồng về trình tƣ ̣giƣ̃a các dòng RNBT, BXDTV, SCLLLA, RNLA, BDTV5, BDTN, BDBD7 và BDQ 96 là 100% nên chúng tôi tiến hành choṇ ra môṭ dòng đại diện để tiến hành so sánh với các dòng nấm Metarhizium anisopliae có trên genbank. Ma trận khoảng cách giữa các dòng nấm đƣơc̣ thiết lâp̣ dựa vào chƣơng trình Draw N-J trong phần mềm ClustalX. Bảng 4.3: Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS 34 Có sự tƣơng đồng cao về mặt di truyền giữa các dòng trong nƣớc với những dòng trên thế giới, tỉ lệ thấp nhất là 92% và cao nhất là 100%.Chúng tôi nhận thấy toàn bộ những dòng nấm trong nƣớc có sự tƣơng đồng cao về mặt di truyền (99%-100%) so với dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae đƣợc phân lập tại nhiều quốc gia khác nhau, trên những ký chủ khác nhau. Nhƣ vậy chúng tôi khẳng định những dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣợc sử dụng trong đề tài là dòng Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Cây phân loài đƣợc dựng bằng chƣơng trình Draw N-J Tree trong phần mềm ClustalX Đơn vị di truyền là 0.01 Hình 4.6: So sánh quan hê ̣giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tự vùng rDNA-ITS Những dòng nấm đƣợc chia thành 3 nhóm: Nhóm I : Dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Những dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣợc sử dụng trong đề tài đều thuộc nhóm này. 35 Nhóm II: Dòng nấm Metarhizium anisopliae var. acridum. Nhóm II: Dòng nấm Metarhizium anisopliae var. lepidiotum. Hầu hết nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong đề tài có quan hê ̣gần với dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae đƣơc̣ phân lâp̣ tƣ̀ Trung Quốc . Viêṭ Nam và Trung Quốc có khoảng cách điạ lý gần nhau do đó không có sƣ ̣khác biêṭ lớn về trình tƣ ̣nucleotide trong vùng rDNA -ITS. Tuy nhiên 2 dòng BXDTG và RBCQ 9 lại có độ tƣơng đồng cao với dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae có nguồn gốc từ Australia . Nhƣ vâỵ có thể 2 dòng nấm này của Việt Nam có quan hệ gần với những dòng phụ Metarhizium anisopliae var anisopliae có nguồn gốc tƣ̀ Australia. Sau khi xác định đƣợc các dòng nấm dùng trong đề tài thuộc dòng phụ Metarhizium anisopliae var. anisopliae, chúng tôi tiến hành so sánh với những dòng Metarhizium anisopliae var anisopliae trên thế giới nhằm tìm hiểu xem có xảy ra sự đột biến giữa các dòng nấm của Việt Nam so với các dòng trên thế giới hay không. Kết quả so sánh đƣợc trình bày trong phần phụ lục 1. Chúng tôi đã tìm thấy có 4 vị trí có sự khác biệt về trình tự nucleotide giữa nhƣ̃ng dòng nấm của Việt Nam (đƣợc sử dụng trong đề tài) so với thế giới. Nhƣ̃ng đôṭ biến đầu tiên xảy ra đối với dòng BXDTG và RBCQ9 gồm thêm 1 nu T tại vị trí nu thứ thứ 100 và 173 và thêm môṭ nu A xảy ra tại vị trí nu thứ 174 so với trình tƣ ̣của các dòng khác Và vị trí đột biến quan troṇg là đột biến thay thế A bằng G ở vị trí nu thứ 417. Bởi vì đột biến này xảy ra trên tất cả những dòng nấm của Việt Nam và đaị diêṇ cho sƣ ̣khác biêṭ về trình tƣ ̣nucleotide giƣ̃a dòng nấm Metarhizium anisopliae của Việt Nam so với thế giới. 36 4.5. Kết quả khuếch đại gen Pr1 1 2 3 4 5 M L 6 7 8 9 10 1.2 kb Hình 4.7: Khuếch đại gen Pr1 Ghi chú: 1.BDTN 4.BDBD7 2.SCLLLA 5.BXDTV 3.RNBT 6.BDTV5 4.RNLA 7.BDQ96 8.BXDTG 9.RBC96 10.BDBD7 L. Ladder M.BXDTG 1.5kb Sản phẩm thu đƣợc là một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1.2 kb. Sản phẩm đƣợc tạo ra trên toàn bộ 10 mẫu nấm. Điều này chứng có tất cả những mẫu nấm Metarhizium anisopliae đƣợc sử dụng trong đề tài đều có gen Pr1. 4.6. Kết quả đọc trình tự gen Pr1 Sản phẩm khếch đại đƣợc tinh sạch và đọc trình tự bằng máy ABI PRISM 3100 với cặp primer METPR2/METPR5, là cặp primer nằm bên trong cặp primer METPR1/METPR4. 37 Nhận xét: Trình tự đƣợc đọc bằng cặp primer METPR2/METPR5 có tín hiệu không ổn định ở đầu và cuối của trình tự. Trình tự khi đƣợc đọc bằng một primer là không hoàn chỉnh. Chúng tôi đã tiến hành đọc bằng hai primer và chọn ra vùng đáng tin cậy để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo. Trong 10 mẫu đƣợc đem đọc trình tự chúng tôi nhận thấy có 3 mẫu: BXDTG, RBCQ9 và BDBD7 trình tự có nhiều sai sót trong quá trình đọc nên không đạt độ tin cậy. Do đó chúng tôi loại bỏ 3 mẫu trên. Trình tự của 7 mẫu còn lại đƣợc sử dụng trong những nghiên cứu tiếp theo. Trình tự của các nguồn nấm trên genbank đƣợc sử dụng trong các phân tích tiếp theo có thông tin cụ thể đƣợc nêu ở bảng 4.3. Trình tự của các mẫu nấm đƣợc tiến hành so sánh bằng phần mềm ClustalX. Bảng 4.4: Các nguồn nấm Metarhizum anisopliae trên genbank đƣợc dùng để so sánh trình tƣ ̣gen Pr1 Ký hiệu Dòng phân lập Nơi phân lâp̣ Tác giả Ngày công bố AY389128 M.a.var.anisopliae Taiwan Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389132 M.a.var.anisopliae USA Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389127 M.a.var.anisopliae Finland Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389122 M.a.var.anisopliae China Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389129 M.a.var.anisopliae UK Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389126 M.a.var.anisopliae Ethiopia Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY289123 M.a.var.anisopliae China Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389119 M.a.var.anisopliae Austria Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389121 M.a.var.anisopliae Brazil Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389133 M.a.var.anisopliae USA Wang,C.và ctv 12-9 -2003 38 Trên cở sở có kết quả của sự so sánh chúng tôi đã thiết lập đƣợc ma trận khoảng cách giữa các dòng nấm với nhau dựa vào chƣơng trình Draw N-J trong phần mềm ClustalX. Kết quả so sánh đƣơc̣ trình bày trong phần phu ̣luc̣ 2 Bảng 4.5: Ma trận khoảng cách giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dƣạ vào trình tự gen Pr1 BDTV5 RNLA RNBT BDTN BXDTV BDQ96 SCLLLA BDTV5 100 100 99 99 99 99 95 RNLA 100 100 99 99 99 99 95 RNBT 99 99 100 99 99 99 95 BDTN 99 99 99 100 100 100 95 BXDTV 99 99 99 100 100 100 95 BDQ96 99 99 99 100 100 100 95 SCLLLA 95 95 95 95 95 95 100 Kết quả so sánh cho thấy: Có sự khác biệt về trình tự nuleotide giữa dòng SCLLLA với những dòng còn lại. Sự khác biệt chiếm khoảng 5% (54nu/1091nu) .Điều này có thể đƣợc giải thích là dòng SCLLLA đƣợc phân lập trên sâu cuốn lá thuộc Cánh vảy (Lepidoptera) trong khi đó những dòng nấm còn lại đƣợc phân lập trên bọ dừa, rầy nâu và bọ xít đen thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), do đó có sự khác biệt về mặt ký chủ . Nhƣ vậy sự khác biệt về mặt ký chủ đã ảnh hƣởng tới sự đa dạng về mặt di truyền của gen Pr1. Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae đƣợc dựng bằng chƣơng trình Bootstrap Maximum Parsimony cũng đã cho thấy mức độ tƣơng đồng giữa những dòng nấm . 39 Đơn vị di truyền: 10 Hình 4.8: Cây phát sinh loài giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae dƣạ vào trình tự gen Pr1 Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng của gen Pr1 giữa những dòng trong nƣớc với những dòng trên thế giới, chúng tôi đã tiến hành so sánh với những trình tự thu thập trên genbank. Các nguồn nấm đƣợc sử dụng trong so sánh đƣợc thể hiện trong bảng 4.4. Kết quả so sánh cho thấy sự tƣơng đồng cao giữa những dòng nấm trong nƣớc và các dòng trên genbank. Tỉ lệ tƣơng đồng cao nhất là 99% và tỉ lệ tƣơng đồng thấp nhất là 94%. Chúng tôi đã phát hiện đƣợc một s ố vị trí đột biến trong một số dòng so với quần thể . Trong đó đối với dòng RNBT chúng tôi đa ̃tìm thấy có 5 vị trí đột biến bao gồm chèn môṭ nu G ở vi ̣ trí 197, thay nu C bằng G ở vi ̣ trí 906 và thay nu C bằng T ở 3 vị trí : 872, 943, 922. Còn ở hai dòng BDTV 5 và RNLA xuất hiêṇ 4 vị trí đột biến. 2 đôṭ biến thay C bằng G ở vi ̣ trí nu thƣ́ 943 và 1039, 1 đôṭ biến thay thế G bằng T ở vi ̣ trí 861 và một đột biến thay C bằng A ở vị trí nu 926. Trong dòng BDQ96 có môṭ đôṭ biến ở vi ̣ trí 922 và kiểu đột biến là thay thế môṭ nu C bằng môṭ nu T. 40 Bảng 4.6: Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thê giới dựa vào trình tự gen Pr1 Chúng tôi cũng nhận thấy có sự khác biệt về trình tự xảy ra ở 6 dòng nấm của Viêṭ Nam so với thế giới ngoaị trƣ̀ dòng SCLLLA . Nhƣ̃ng sƣ ̣khác biêṭ xảy ra ở 6 vị trí trên toàn bô ̣trình tƣ ̣của gen Pr1, chiếm tỉ lê ̣0.6%. Sƣ ̣khác biêṭ đầu tiên mà chúng tôi nhâṇ thấy là taị vi ̣ trí nu thƣ́ 217, tại vị trí này có sự thay thế một nu T bằng một nu G . Nhƣ̃ng đôṭ biến tiếp theo xảy ra ở các vi ̣ trí : 583, 974 với các kiểu đôṭ biến là thay t hế giƣ̃a nu A và C , giƣ̃a A và T ở vi ̣ trí 637 và 1055.Và đột biến cuối cùng xảy ra ở vị trí nu thƣ́ 754, tại đây 1 nu G đƣơc̣ thay bằng 1 nu C. Nhƣ̃ng đôṭ biến này có thể đƣơc̣ hình thành trong quá trình phát sinh bào tử dƣới ảnh hƣởng của các yếu tố bên ngoài . Kết quả khác biệt giữa các mẫu nấm Metarhizium anisopliae của Việt Nam so với thế giới là điều hoàn toàn có thể xảy ra . Bởi lẽ, vị trí địa lý có sự khác biệt rất lớn về điều kiện tự nhiên, khí hậu và thời tiết. Bản thân các nguồn nấm genbank cung cấp cũng có sự khác biệt. Điều đó chứng tỏ có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến sự đa dạng di truyền của gen Pr1, cụ thể nhƣ vị trí địa lý, ký chủ, cây trồng. 41 Cây phát sinh loài đƣợc vẽ bằng chƣơng trình Bootstrap Maximum Parsimony trong gói phần mềm Phylip với 100 lần lăp̣ laị. Đơn vi ̣ di truyền là 10 Hình 4.9: So sánh quan hê ̣ giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và thế giới dƣạ vào trình tự gen Pr1. Các dòng nấm của Việt Nam và thế giới đƣợc chia làm 2 nhóm: - Nhóm I: gồm những dòng Metarhizium anisopliae đƣợc phân lập tại Việt Nam. - Nhóm II: gồm những dòng Metarhizium anisopliae đƣợc phân lập tại nhiều nơi trên thế giới. Tuy nhiên do trong quá trình đọc trình tự gen Pr1 không hoàn toàn do đó việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền dựa vào trình tự gen Pr1 còn nhiều hạn chế. 42 Chƣơng 5. KẾT LUÂṆ VÀ ĐỀ NGHI ̣ 5.1. Kết luâṇ 5.1.1. Phát hiện và đọc trình tự gen Pr1 Xác định đƣợc gen gây độc Pr1 của 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae. Kích thƣớc của gen Pr1 sau khi đƣơc̣ đoc̣ bằng 2 primer METPR2/METPR5 là 1091 bp. Có sự tƣơng đồng cao về mặt di truyền của gen Pr1 giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisoplise trong nƣớc. Tỉ lệ tƣơng đồng c ao nhất là 100% và thấp nhất là 95%. Xác định đƣợc sự khác biệt giữa dòng SCLLLA với những dòng còn lại . Tỉ lệ khác biệt chiếm 5% (54/1091). Xác định đƣợc sự khác biệt về trình tự của 6 dòng nấm trong nƣớc so với thế giới bao gồm các dòng BDTV5, RNLA, RNBT, BDTN, BXDTV, BDQ96. Tỉ lệ tƣơng đồng giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae so vơ