Khóa luận Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp omeprazole natri tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già

ợ điều trị các triệu chứng nhƣ ợ nóng, khó nuốt và ho dai dẳng. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 2 Tuy nhiên, thuốc cũng có một số nhƣợc điểm nhƣ: không bền trong môi trƣờng axit, dễ bị biến đổi ở gan và trong quá trình sử dụng, ngƣời bệnh có thể gặp tác dụng phụ do thuốc gây ra nhƣ buồn nôn, sốt,... Với mục đích nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của VLC nhằm làm chậm quá trình giải phóng thuốc trong điều trị bệnh, tôi đã quyết định lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu sự giải phóng thuốc của vật liệu cellulose nạp omeprazole natri tạo ra từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già” 2. Mục đích nghiên cứu - Tạo VLC lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già. - Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole natri của VLC lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già. - Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc Omeprazole natri nhờ VLC trong một số trƣờng hợp khác nhau . Đánh giá khả năng giải phóng thuốc trong các trƣờng hợp đó. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Tạo và xử lí VLC lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già. - Thiết kế và chế tạo VLC nạp thuốc Omeprazole natri. 4. Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi nghiên cứu: ph ng thí nghiệm 5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học - Tăng độ hiểu biết về ứng dụng củaVLC, khắc phục nhƣợc điểm của thuốc. - Thực hiện việc nghiên cứu ứng dụng VLC nhằm khắc phục những hạn chế của thuốc Omeprazole natri giúp cho chúng ta có thêm hƣớng nghiên cứu. - Đánh giá những tiềm năng của VLC hấp thụ Omeprazole natri để từ đó có thể đề xuất hƣớng nghiên cứu trên các thuốc khác. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn SV:Nguyễn Thị Thu Hà 3 - VLC đƣợc tạo ra từ môi trƣờng nƣớc dừa già sẽ đƣợc dùng để đánh giá khả năng giải phóng của Omeprazole natri nhằm khắc phục những tác dụng phụ trong việc điều trị bệnh rối loạn dạ dày và thực quản. - Sau khi có kết quả nghiên cứu có thể đƣa vào ứng dụng thực tế. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 4 NỘI DUNG Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu tổng quan về đối tƣợng, lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter xylinus 1.1.1.1. Vị trí phân loại Gluconacetobacter xylinus thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae Là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào. Theo khóa phân loại của Bergey, Gluconacetobacter xylinus thuộc: + Lớp: Schizomycetes + Bộ: Pseudomonadales + Họ: Pseudomonadaceae 1.1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn Gluconacetobacer xylinus Gluconacetobacter xylinus có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có kích thƣớc chiều ngang: ,6 - ,8 m, chiều dài: 2 - 3 m. Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử, không có khả năng di động, xếp riêng rẽ hoặc thành chuỗi. Gluconacetobacter xylinus trong môi trƣờng thiếu chất dinh dƣỡng sẽ biến đổi thành các dạng hình thái khác nhau ví dụ nhƣ: kéo dài, phình to, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính. Trong môi trƣờng nuôi cấy rắn sau 3 – 7 ngày nuôi cấy , sẽ thu đƣợc khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đƣờng kính từ 2 – 5mm có dạng hình tròn, nhày, rìa mép trơn, có màu kem, hơi trong. Nhƣng sau một tuần khuẩn lạc phát triển có hình dạng to, đục, màu cafe sữa rồi khô dần. 1.1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus Gluconacetobacter xylinus là vi khuẩn hiếu khí. Loài này sẽ phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ: 25 – 300C, nếu nhiệt độ quá cao 370C tế bào sẽ SV:Nguyễn Thị Thu Hà 5 bị suy thoái hoàn toàn, theo nghiên cứu nhiệt độ thích hợp nhất để vi khuẩn phát triển là 250C. Vi khuẩn tăng trƣởng trong khoảng pH từ 3 - 8, môi trƣờng có độ pH 5,5 là môi trƣờng tối ƣu để sản xuất cellulose. Nguồn cacbon mà Gluconacetobacter xylinus sử dụng đƣợc lấy từ nhiều loại đƣờng khác nhau. Tùy từng chủng mà lƣợng đƣờng cần thiết là khác nhau và có thể thay đổi, nhƣng phổ biến là: glucose, fructose, manitol, sorbitol vì các loại này cho hiệu suất cao, còn nguồn đƣờng từ glycerol, galactose, sucrose, maltose sẽ cho hiệu suất thấp hơn. Khi nuôi cấy, ngƣời ta thƣờng bổ sung axit axetic vào môi trƣờng để tránh nhiễm các loại vi khuẩn lạ. Đối với môi trƣờng nuôi cấy lỏng, vi khuẩn có thể sử dụng đƣờng để chuyển hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trƣờng. Sau khoảng 36 – 48h lớp màng dày, trong và sau 7-19 ngày màng sẽ đạt đến độ dày nhất định. 1.1.2. Cấu trúc và đặc t nh của VLC tạo bởi Gluconacetobacter xylinus 1.1.2.1. Cấu trúc của VLC Vật liệu Cellulose (VLC) đƣợc cấu tạo bởi những chuỗi polimer do các glucopyranose không phân nhánh nối với nhau bằng liên kết β - 1,4 . Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc VLC phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy, cấu trúc hóa học của VLC giống cellulose của thực vật plant cellulose – PC , tuy nhiên về cấu trúc đại thể thì chúng khác nhau [7]. Theo AJ. Brown (1886), VLC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đƣờng kính 1,5nm. Các sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 1 nm, rộng khoảng 3 - 8nm. 1.1.2.2. Đặc tính của VLC Trong môi trƣờng nuôi cấy tĩnh, VLC tích lũy trên bề mặt môi trƣờng dinh dƣỡng lỏng tạo thành lớp màng mỏng nhƣ da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tƣơng tự nhƣ giấy da với độ dày , 1 – 0,5nm. Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt nhƣ: SV:Nguyễn Thị Thu Hà 6 - Độ kết tinh cao: VLC là Cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng hợp không chứa lignin hay hemicelluloses nên có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh. - Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, trọng lƣợng nhẹ. - Khả năng hút nƣớc cực cao ở trạng thái ẩm. Với các tính chất này VLC đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau đặc biệt là y học. 1.1.2.3. Sinh tổng hợp VLC Quá trình lên men: - Pha sinh trƣởng - Pha tích tụ sản phẩm - Quá trình tổng hợp Cellulose của Gluconacetobacter xylinus 1.1.2.4. Môi trường nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus Môi trƣờng tổng hợp chính là môi trƣờng nuôi cấy của Gluconacetobacter xylinus, môi trƣờng tổng hợp bao gồm các nguồn dinh dƣỡng cần thiết nhƣ cacbon, nito, nguồn sulfur và phosphate, các yếu tố tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng. Gluconacetobacter xylinus có nhu cầu sử dụng đƣờng rất lớn và nó giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp VLC nên đã có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác để làm nguyên liệu trong nuôi cấy Gluconacetobacter xylinus nhƣ: rỉ đƣờng, nƣớc dừa già, nƣớc mía... Điển hình là nƣớc dừa già. Nƣớc dừa già là môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn do có chứa 1,3 - diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,... là những chất chất dinh dƣỡng và chất kích thích tăng trƣởng. Vì vậy, Gluconacetobacter xylinus rất thích hợp phát triển trong môi trƣờng nƣớc dừa già. Sau khi thu hoạch, nƣớc dừa không đƣợc để quá 3 ngày, để lâu sẽ làm cho đƣờng và các chất dinh dƣỡng khác giảm đi dẫn đến hiệu suất kém. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 7 1.1.3. Giới thiệu t ng quan v thuốc meprazole natri Nhóm dƣợc lý: Thuốc đƣờng tiêu hóa Tên biệt dƣợc: Abacid, Bicasan, Drivo Dạng bào chế: viên nang, viên nén bao phim, viên nén dạng bột pha dung dịch Thành phần: Omeprazole natri Công thức hóa học: - Công thức phân tử: C17H19N3O3S - Phân tử khối: 345,4 - Tên IUPAC: 5 - methoxy- 2-[[(4 - methoxy - 3,5 - dimethyl – 2 - pyridinyl) methyl] sulfinyl] - 1H - benzimidazole. Tính chất: Bột trắng hoặc gần nhƣ trắng. Rất khó tan trong nƣớc, tan trong dicloromethan, hơi tan trong ethanol 96 và methanol, tan trong dung dịch kiềm loãng [1]. Dƣợc lực: Omeprazole natri là chất ức chế đặc hiệu tác dụng bằng cách khóa hệ thống enzyme của Hydrogen-potassium Adenosine Triphosphatase ở pH 5, cũng gọi là bơm proton H K ATPase của tế bào thành dạ dày. Do vậy Omeprazole natri đƣợc dùng để điều trị các bệnh nhƣ trào ngƣợc dạ dày, loét dạ dày tá tràng, Dƣợc động học: Omeprazole natri bị hủy trong môi trƣờng acid, nên thuốc ở dƣới dạng viên bao không tan ở dạ dày chỉ hấp thụ ở tá tràng, ruột non [16]. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 8 Sự hấp thụ của thuốc tùy thuộc vào liều dùng, thuốc bắt đầu có tác dụng sau 1 giờ ăn uống, đạt đỉnh cao sau 2 giờ và hấp thụ hoàn toàn sau 3 đến 6 giờ. Khi uống liều đầu tiên sự hấp thụ thuốc đạt khoảng 35 và sau vài liều thì có thể đạt 6 . Thuốc liên kết với protein huyết tƣơng và đƣợc phân bố vào các mô đặc biệt ở thành dạ dày. Omeprazole natri hầu nhƣ biến đổi ở gan. Các chất chuyển hóa không hoạt tính trong huyết tƣơng là sulfon, sulfua, hydroxyl omeprazole nhƣng lại có sự tƣơng tác với nhiều thuốc khác do tác dụng ức chế enzyme CYT.P45 của tế bào gan. Theo nghiên cứu thì 8 các chất chuyển hóa bài tiết trong nƣớc tiểu, 2 còn lại sẽ bài thải theo phân. Dƣợc động học của thuốc thay đổi không có ý nghĩa ở ngƣời già hoặc ngƣời suy thận. Thuốc Omeprazole natri chỉ định: loét tá tràng - loét dạ dày, viêm thực quản do hồi lƣu dạ dày - thực quản, hội chứng Zollinger - Ellison [1, 12]. Liều dùng: Đối với ngƣời lớn là 2 -4 mg ngày lần. Tác dụng phụ của thuốc: Các triệu chứng: buồn nôn, nhức đầu, đầy hơi, táo bón rất hiếm gặp. Thỉnh thoảng có ban da nhƣng chỉ có biểu hiện nhẹ và nhanh hết. 1.2. Giới thiệu tổng quan về t nh h nh nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 1.2.1. Trên thế giới 1.2.1.1: Vật liệu Cellulose Đã có nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu về màng và ứng dụng của VLC từ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus. Tính đến cuối năm 2 14, trên thế giới có khoảng 9 nghiên cứu về VLC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi của màng và 7 nghiên cứu với vật liệu nanocomposite. Vật liệu Cellulose vi khuẩn đã đƣợc ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: nhƣ dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 9 Ngoài ra trong y học, VLC đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch hay làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời. Tuy nhiên, trên thế giới VLC đƣợc ứng dụng nhiều trong ngành dƣợc phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả Wan và Milon 2 9 [16] sử dụng màng để đắp lên vết thƣơng hở, vết bỏng đã thu đƣợc các kết quả đáng kinh ngạc. 1.2.1.2: Omeprazole natri Ompeprazole natri đƣợc công ty Astra nghiên cứu sửa dụng làm thuốc điều trị và đƣợc lƣu hành từ năm 1988 với tên biệt dƣợc là Losec, thu về 8 tỷ USD mỗi năm. Sayed Aboflazl Mostafavi Iran [17] đã nghiên cứu đánh giá tƣơng đƣơng sinh học của 2 sản phẩm viên nang Omeprazole natri sản xuất tại Iran: Omeprazole Abidi và Lorsec Lorestan so với thuốc chứng là viên nang Losec của Astra, Sweden. Nghiên cứu thực hiện trên 12 ngƣời tình nguyện, thiết kế chéo theo ô vuông latin, mở, liều đơn, 3 thuốc, 3 giai đoạn với thời gian nghỉ giữa các giai đoạn là 7 ngày. Phân tích nồng độ thuốc trong huyết tƣơng bằng HPLC. Kết quả đánh giá qua các giá trị dƣợc động học AUC và Cmax cho thấy 3 chế phẩm này là tƣơng đƣơng sinh học. Elkoshi Z. [19] và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá tƣơng đƣơng sinh học của viên Omepradex so với thuốc đối chứng là viên Losec trên 2 mô hình invitro thử độ hòa tan và in vivo dƣợc động học . Nghiên cứu in vivo với thiết kế chéo, ngẫu nhiên, đơn liều kết hợp với đa liều, thực hiện trên 4 ngƣời tình nguyện khỏe mạnh. Hai chế phẩm nghiên cứu cho thấy không tƣơng đƣơng, sự sai khác sau khi dùng đa liều lớn hơn. Các tác giả đã nhận định rằng nghiên cứu tƣơng đƣơng sinh học Omeprazole natri nên thực hiện với thiết kế đơn liều kết hợp đã liều. 1.2.2. Ở iệt Nam Ở nƣớc ta, việc nghiên cứu đƣa VLC ứng dụng vào thực tế vẫn còn nhiều hạn chế do điều kiện về cơ sở vật chất vẫn chƣa đáp ứng đƣợc yêu cầu nghiên cứu, mới đang dừng lại ở bƣớc đầu đi vào thực nghiệm. Các kết quả vẫn chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 10 Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn đƣợc chủng Gluconacetobacter xylinus BHN có khả năng tạo VLC và những nghiên cứu bƣớc đầu cho thấy VLC từ chủng Gluconacetobacter xylinus BHN có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho ngƣời [2, 3]. Mong muốn khắc phục đƣợc những tác dụng phụ của thuốc Omeprazole natri trong chữa bệnh viêm loét dạ dày, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm đƣợc chi phí. Vật liệu Cellulose có thể tự sản xuất trong nƣớc từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Omeprazole natri. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 11 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị 2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu - Omeprazole natri (95%). - Dung môi là NaOH ,1M và chất phản ứng khác đƣợc cung cấp từ Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2. - Vật liệu Cellulose lên men từ môi trƣờng nƣớc dừa già. 2.1.2. Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo vật liệu Cellolose Các vật liệu sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong bảng 2.1 Bảng 2.1. Vật liệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc 1 Omeprazole natri Mỹ 2 Disodium phosphate Trung Quốc 3 Axit citric Trung Quốc 4 Amoni sunfat Trung Quốc 5 Axit axetic Việt Nam 6 D- glucose Trung Quốc 7 Nƣớc dừa già 8 Pepton Eupean Union 9 Natri hidroxit Việt Nam 10 Nƣớc cất 2 lần 11 Ethanol Nhà máy hóa chất Đức Giang- Việt Nam 12 Kali dihidrophotphat Trung Quốc SV:Nguyễn Thị Thu Hà 12 2.1.3. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2.2. C c thiết bị đƣợc dùng trong nghiên cứu Thiết bị Nƣớc sản xuất Nồi hấp khử trùng HV 11 HIRAIAMA Nhật Bản Máy đo quang phổ UV- Visa 2450 Shimadru- Nhật Bản Cân phân tích, cân kĩ thuật Thụy Sỹ Buồng cấy vô trùng Haraeus Tủ sấy, tủ ấm Binder- Đức Khuấy từ gia nhiệt CC162 IKA- Đức Máy lắc tròn tốc độ chậm Anh Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu - Ngoài ra còn có: bình tam giác có chia vạch, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh có chia vạch, bình thủy tinh, giấy lọc, giấy bạc và các dụng cụ hóa sinh thông dụng. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Tạo VLC từ vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus lên men trong môi trƣờng nƣớc dừa già - Xử lí VLC trƣớc khhi nạp thuốc. - Xác định lƣợng VLC tạo thành. - Hấp thụ thuốc Omeprazole natri qua màng VLC. - Tiến hành giải phóng màng VLC sau khi hấp thụ. 2.2.1. Chuẩn bị vật liệu Cellulose Tạo VLC từ môi trƣờng nƣớc dừa già. Quá trình lên men thu VLC thô SV:Nguyễn Thị Thu Hà 13 đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Bƣớc 1: Chuẩn bị môi trƣờng theo bảng 2.1. Bảng 2.3. Thành phần môi trƣờng tạo VLC Thành phần Trọng lƣợng D - glucose 20g pepton 10g Nƣớc dừa già 1000ml KH2PO4 0,3g Axit axetic 2% (NH4)2SO4 0,5g Dịch giống Glucoacetobacter xylinus 10% - Bƣớc 2: Hấp trong nồi khử trùng môi trƣờng ở 113oC trong 15 phút. - Bƣớc 3: Khử trùng các môi trƣờng ra bằng tia cực tím trong 15 phút rồi để nguội trong 3 phút. - Bƣớc 4: Bổ sung thêm 1 dịch giống và 2 axit acetic, sau đó lắc cho giống phân bố đều trong dung dịch. - Bƣớc 5: Ủ tĩnh trong khoảng từ 1 - 13 ngày ở 26oC, lƣu ý: dùng gạc vô trùng bịt kín miệng bình. - Bƣớc 6: Thu VLC thô, rửa sạch dƣới nƣớc. 2.2.2. Phương pháp xử lý VLC trước khi hấp thụ thuốc Omeprazole natri - Mục đích: nhằm loại bỏ các tạp chất có trong môi trƣờng nuôi cấy, đồng thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn có trong môi trƣờng. - Phƣơng pháp: Sau khi ủ tĩnh trong 6 - 14 ngày ở 26°C, VLC đƣợc nhúng vào nƣớc cất, sau đó các VLC này đƣợc tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo sơ đồ dƣới đây: SV:Nguyễn Thị Thu Hà 14 Xử lí VLC thô để thu VLC tinh khiết theo quy trình hình 2.1. H nh 2.1. Sơ đồ tinh chế VLC - Tách VLC: trong nuôi cấy tĩnh VLC, tạo thành màng dày ở mặt môi trƣờng nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trƣờng. Tách VLC thô Rửa bằng nƣớc cất Bình 1 ml NaOH ,3M (20 - 30 màng d=1,5cm Hấp trong 113o C, 15 phút VLC tinh khiết Xả nƣớc, 8 giờ SV:Nguyễn Thị Thu Hà 15 - Trong màng chứa một lƣợng lớn vi khuẩn nên ta cần ngâm màng trong NaOH nóng 3 ở nhiệt độ 113 C trong vòng 15 phút nhằm phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và loại bỏ nội độc tố của vi khuẩn [4]. - Ngâm HCl: Màng sau khi đƣợc ngâm bằng NaOH, ta tiến hành ngâm màng với HCl 3 khoảng 48h để trung hòa hết NaOH. - Ngâm nƣớc: Màng sau khi ngâm với HCl rửa sạch bằng nƣớc cất 2 lần rồi ép màng. Ngâm màng với nƣớc cất 2 lần trong 48 giờ để trung hòa hết acid, ta sẽ thu đƣợc Cellulose vi khuẩn tinh khiết [4]. 2.3 Kiểm tra độ tinh khiết của vật liệu Cellulose. Kiểm tra sự hiện diện của protein trong VLC sau khi tinh chế: Định tính bằng thuốc thử là axit Trichloro axetic CCl3COOH). VLC tinh chế đƣợc đục nhỏ bằng khuôn, cho vào 2 ống nghiệm: Ống 1 ống đối chứng chứa màng và 1 ml nƣớc cất 2 lần, Ống 2 ống thí nghiệm chứa 1 ml nƣớc, sau đó nhỏ vài giọt axit Trichloro axetic vào ống 2, sau đó lắc đều. Nếu nƣớc trong ống 2 không bị đục, nhƣ ống đối chứng thì màng đã sạch. Ngƣợc lại, nếu bị đục thì màng chƣa sạch và tiếp tục xả nƣớc. 2.4. Quét phổ hấp thụ của thuốc Omeprazole natri Hòa tan 2, mg chế phẩm trong dung dịch natri hydroxyd 0,1 M (TT) và pha loãng thành 1 , ml với cùng dung môi. Đo phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch thu đƣợc từ bƣớc sóng 2 nm đến 400 nm để tìm bƣớc sóng hấp thụ cực đại của thuốc Omeprazole natri. 2.5. Chế tạo VLC nạp thuốc Omeprazole natri 2.5.1. Xây dựng đường chuẩn thuốc Omeprazole natri Sử dụng hệ thống quang phổ tử ngoại UV để ghi mật độ quang hấp thụ của thuốc Omeprazole natri. Chuẩn bị mẫu chuẩn với các nồng độ khác nhau: Pha dung dịch Omeprazole natri ở các nồng độ mg ml khác nhau: 0,15mg/ml; 0,20mg/ml; 0,25mg/ml; 0,30mg ml; ,4 mg ml và 0,50mg/ml. Sử dụng dung môi là NaOH 0,1M. Đo UV ở bƣớc sóng hấp thụ cực đại của Omeprazole natri. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 16 2.5.2. Xác định hàm lượng thuốc Omeprazole natri được nạp vào VLC Sau 2h lấy VLC ra xác định lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng. Dùng máy đo quang phổ UV - 245 xác định lƣợng thuốc Omeprazole natri trong VLC đã nạp thuốc. Hiệu suất nạp thuốc vào VLC đƣợc tính theo công thức (1) [12]. EE (%) = x 100% (1) Trong công thức 1 : EE: Hiệu suất thuốc nạp vào màng . Qt: Lƣợng thuốc lí thuyết mg . Qd: Lƣợng thuốc còn lại mg . 2.5.3. Phân tích thống kê Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần để lấy trung bình mẫu và phân tích thống kê số liệu qua phần mềm Excel 2 13 để phân tích phƣơng sai và xác định khoảng tin cậy. Tất cả các dữ liệu đƣợc trình bày theo giả định trung bình và độ lệch chuẩn “MEAN ± SD”. 2.6. Chuẩn bị môi trƣờng đệm Pha 3 dung dịch đệm có độ pH lần lƣợt là 2; 4,5; 6,8 theo cách pha chế một số dung dịch chuẩn độ theo Dƣợc điển Việt Nam [1]. - Dung dịch đệm pH = 2, : Hoà tan 6,57g kali clorid trong nƣớc, thêm 119ml dung dịch acid hydrocloric ,1M và thêm nƣớc vừa đủ 1 ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần Dùng HCl hoặc NaOH . - Dung dịch đệm pH = 4,5: Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong 1 ml nƣớc, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần Dùng H3PO4 hoặc KOH . -Dung dịch đệm pH = 6,8: Hoà tan 28,8 g dinatri hydrophosphat và 11,45g kali dihydrophosphat trong nƣớc vừa đủ 1 ml, đo pH và hiệu chỉnh pH nếu cần Dùng H3PO4 hoặc KOH hay NaOH . SV:Nguyễn Thị Thu Hà 17 H nh 2.2. Chuẩn bị môi trƣờng đệm ở pH 2; 4,5; 6,8 2.6.1. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng từ VLC được nạp thuốc. Cách tiến hành xác định lƣợng thuố giải phóng thông qua hệ thống vận tải - Cho VLC đã đƣợc hấp thụ thuốc Omeprazol natri có độ dày màng là ,5 và 1cm vào bình chứa 9 ml môi trƣờng pH 2; 4,5; 6,8[1]. - Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, khuấy với tốc độ 5 vòng phút ở nhiệt độ 37 ± 0,5 C SV:Nguyễn Thị Thu Hà 18 H nh 2.3. Chuẩn bị điều kiện cho giải ph ng m y khuấy từ 5 v ng phút và ở nhiệt độ 37°C - Sau thời gian là ,5h; 1h; 2h; 4h; 6h; 8h; 24h lấy mẫu và tiến hành đo lƣợng thuốc giải phóng. - Lƣợng mẫu đƣợc rút ra sau mỗi khoảng thời gian là 5ml và đƣợc bổ sung lại 5ml dung dịch đệm tƣơng ứng - Tất cả các thí nghiệm đƣợc làm lặp lại 3 lần, sau đó lấy giá trị trung bình  Tỉ lệ giải phóng của thuốc Omeprazole natri từ VLC đƣợc tính theo công thức 2.1 R%= ∑ x 100% (2.1) Trong đó: R : Tỉ lệ thuốc đƣợc giải phóng C1: Nồng độ của thuốc Omeprazole natri trong dung dịch tại thời điểm t V1: Thể tích của dung dịch đệm tại các giá trị pH khác nhau n: Số lƣợng mẫu lấy ra từ dịch giải phóng V2: Thể tích dung dịch đệm đƣợc thêm vào m: Khối lƣợng thuốc đƣợc hấp thụ vào màng  Cách bố trí thí nghiệm Cho VLC nạp thuốc vào thiết bị giải phóng, sau đó quan sát sự giải phóng của thuốc qua màng trong các môi trƣờng có độ pH khác nhau hoặc trong cùng giá trị pH nhƣng khác nhau về độ dày và kích thƣớc màng. 2.6.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê Các số liệu nghiên cứu đƣợc biểu diễn dƣới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn. Số trung bình cộng đƣợc dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp SV:Nguyễn Thị Thu Hà 19 lại thí nghiệm. Những khác biệt đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < , 5. Kết quả đƣợc xử lý bởi phần mềm DDSolver, và Data analysic [15]. SV:Nguyễn Thị Thu Hà 20 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu VLC thô và tạo VLC tinh khiết 3.1.1. Vật liệu Cellulose nuôi cấy từ môi trường nước dừa già Vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus sử dụng chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng lên men ở nhiệt độ phòng để sinh trƣởng và phát triển tạo cellulose. Những ngày đầu, vi khuẩn bắt đầu làm quen với môi trƣờng, lúc này axit bắt đầu đƣợc sản sinh ra làm giảm độ Ph. Đến những ngày tiếp theo, vi khuẩn bắt đầu sản sinh ra một lớp VLC trên bề mặt môi trƣờng màu trắng đục có lẫn nhiều tạp chất. Khi môi trƣờng hết chất dinh dƣỡng thì lớp màng này dày lên đến thời điểm nhất định rồi ngƣng lại hoàn toàn. Màng có độ dày còn phụ thuộc vào lƣợng môi trƣờng, thời gian nuôi cấy và con tùy vào mục đích nghiên cứu mà ta thu màng ở thời gian khác nhau để đƣợc các màng mỏng hay dày phù hợp. 3.1.2. Thu vật liệu Cellulose thô từ môi trường Khi nuôi cấy tĩnh trong môi trƣờng nƣớc dừa già, VLC có màu trắng đục, chứa nhiều nƣớc, bề mặt phẳng trơn, có thể chất dẻo dai. Khi thu VLC ở các thời điểm khác nhau ta thấy màng có độ dày mỏng khác nhau. Sau khoảng 11 - 18 ngày, thu VLC thô có độ dày ,5cm - 1cm a b H nh 3.1. Thu VLC thô ở c c khoảng thời gian kh c nhau SV:Nguyễn Thị Thu Hà 21 a. VLC thô c độ dày .5cm tƣơng ứng với thời gian nuôi cấy là 11 ngày b. VLC thô c độ dày 1cm tƣơng ứng với 18 ngày nuôi cấy 3.2. Tinh chế VLC Để thu đƣợc VLC tinh chế trƣớc khi hấp thụ thuốc cần phải xử lý màng vì sau khi thu VLC chứa một lƣợng lớn môi trƣờng lên men và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất, axitaxetic. Tinh chế vật liệu nhằm trung hòa độc tố của vi khuẩn và loại bỏ các tạp chất có trong môi trƣờng nuôi cấy. Đây đƣợc xem là một quá trình quan trọng trƣớc khi màng đƣợc đƣa vào để nạp thuốc, nó giúp VLC có thể sử dụng đƣợc lƣợng thuốc tối đa. Một số hình ảnh màng đã đƣợc tinh chế và sau kiểm tra độ tinh khiết đƣợc cắt thành viên và khuôn nhƣ hình 3.4: H nh 3.3. VLC đ đƣợc tinh chế và kiểm tra độ tinh sạch SV:Nguyễn Thị Thu Hà 22 3.3. Kết quả quét phổ và ây dựng phƣơng tr nh đƣờng chuẩn của Omeprazole natri Bảng 3.1.Bảng nồng độ Omeprazole natri gi trị OD 276nm (pH=2) Nồng độ (mg/ml) Gi trị OD 276nm Gi trị trung b nh 15 0,102 0,105 0,106 ,1 4± , 2 20 0,139 0,137 0,139 ,138± , 1 25 0,167 0,166 0,172 ,168± , 3 30 0,207 0,206 0,205 ,2 6± , 1 40 0,271 0,272 0,278 ,274± , 4 50 0,337 0,344 0,335 ,339± , 5 Dựng đồ thị biểu diễn và lập đƣờng chuẩn Omeprazole natri bằng phần mềm Excel 2 1 , kết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 3.5 H nh 3.5. Biểu đồ biểu diễn đƣờng chuẩn của Omeprazole natri ở pH 2 SV:Nguyễn Thị Thu Hà 23 Phƣơng trình đƣờng chuẩn của thuốc Omeprazole là: y = 0,6771x + 0,0015 (R 2 = 0,9996) Trong công thức y: Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x. x: Nồng độ Omeprazole (mg/ml). R 2: Hệ số tƣơng quan. Bảng 3.2. Bảng nồng độ Omeprazole natri gi trị OD 275nm (pH = 4,5) Nồng độ (mg/ml) Gi trị OD 275nm Gi trị trung b nh 15 0,107 0,109 0,108 ,1 8± , 1 20 0,141 0,140 0,142 ,141± , 1 25 0,175 0,176 0,177 ,175± , 1 30 0,207 0,209 0,208 ,2 9± , 1 40 0,272 0,273 0,271 ,272± , 1 50 0,332 0,331 0,329 ,331± , 2 SV:Nguyễn Thị Thu Hà 24 Dựng đồ thị biểu diễn và lập đƣờng chuẩn Omeprazole natri bằng phần mềm Excel, kết quả thu đƣợc nhƣ đồ thị hình 3.6 H nh 3.6. Biểu đồ biểu diễn