Khóa luận Nghiên cứu sự phát triển của hệ sợi nấm Hương (Lentinula edodes) trong môi trường nuôi cấy lỏng

nấm Hương trên cây gỗ [1] Theo truyền thống thì ban đầu nấm Hương được trồng trên gỗ và về sau đã từng bước áp dụng thêm phương pháp nuôi trồng giá thể đóng túi sử dụng mùn của một số cây và các loại phụ phế thải nông nghiệp khác. Cần chọn các loại gỗ không có tinh dầu, cây còn tươi tốt, không sâu bệnh. Nhóm gỗ thích hợp nhất để nấm Hương sinh trưởng và phát triển cho năng suất cao, chất lượng tốt là gỗ sồi, dẻ, sau sau. Lựa chọn những đoạn gỗ thẳng, cắt thành khúc có đường kính từ 5-20cm, chiều dài 1,0-1,2m. Không làm sây xát lớp vỏ. Để gỗ trong nhà thoáng mát, sạch sẽ, sau 5-9 ngày là trồng được. Các đoạn gỗ đạt tiêu chuẩn đem rửa sạch, dùng nước vôi đặc quét hai đầu đoạn gỗ. Lấy búa chuyên dùng hoặc khoan tạo lỗ trên đoạn gỗ, đường kính lỗ 1,5cm, sâu 3-4cm, cứ cách 15-20cm tạo một lỗ; hàng nọ cách hàng kia 7-10cm; các lỗ so le nhau. Tra giống nấm gần đầy miệng lỗ, lượng giống dùng 3kg/1m3, dùng phoi gỗ đã tạo ra làm nắp đậy (chiều dày bằng chiều dày của vỏ cây), lấp kín lớp giống cấy. Phía ngoài dùng xi măng hòa thành bột giống như vữa trát tường quét trên miệng nắp để bịt kín miệng lỗ. Xếp gỗ theo kiểu "cũi lợn" thành đống, cách mặt đất 15-20cm cao 1,5m, chiều dài tùy theo khối lượng gỗ đem trồng. Phía trên cùng dùng bao tải gai dấp ướt để ráo nước phủ kín toàn bộ đống ủ. Hàng ngày chăm sóc đống ủ, chủ yếu là tưới nước. Lượng nước tưới chỉ đủ ướt lớp bao tải. Tuyệt đối không tưới nhiều, nước sẽ thấm sâu vào thân gỗ làm chết giống. Tốt nhất nên ươm trong nhà thoáng mát, tránh mưa nắng. Thời gian ươm kéo dài 6-16 tháng tùy thuộc theo từng chủng loại gỗ. Cứ 2 tháng lại tiến hành đảo đống gỗ một lần. Khi đảo cần kiểm tra độ ẩm của gỗ. Nếu thấy gỗ quá khô cần dùng bình để phun nước nhẹ xung quanh thân gỗ, sau đó mới ủ đống lại. Khi phát hiện các đoạn gỗ bị bệnh cần để cách ly khỏi đống ủ nhằm tránh lây lan sang các đoạn gỗ khác. Khi kết thúc giai đoạn ươm, nấm Hương bắt đầu hình thành quả thể. Quan sát trên bề mặt thân gỗ có những chấm màu hồng nhạt, chúng lớn dần như hạt ngô và hình thành nên cây nấm hoàn chỉnh. Dựng đứng thân gỗ, xếp theo kiểu giá súng, hàng nọ cách hàng kia 50-60cm. Có thể xếp gỗ trong nhà có mái che, thoáng mát, độ ẩm không khí cao, ánh sáng khuyếch tán. Hàng ngày tiến hành tưới nước nhẹ vài lần trực tiếp lên thân gỗ. Khi nấm đủ lớn thì bắt đầu hái. Hái nấm xong cắt bỏ phần gốc bám vào thân gỗ. Tiêu thụ ở dạng tươi hoặc sấy khô. Cứ khoảng 2 tháng một lần cần đảo đầu đoạn gỗ trên quay xuống dưới để độ ẩm trong thân gỗ đều hơn. Quá trình chăm sóc, thu hái nấm liên tục như vậy trong khoảng thời gian 2-3 năm. Năng suất trung bình khi kết thúc toàn bộ quá trình thu hái đạt 15-20 kg nấm khô/1m3 gỗ. 2.4.2. Trồng nấm Hương trên mùn cưa và giá thể khác [1] Xử lý nguyên liệu: Chọn các loại mùn cưa không có tinh dầu, không bị mốc và không có các độc tố (dầu mỡ, hóa chất...). Một số cơ chất thường sử dụng để nuôi trồng nấm Hương như: mùn cưa, rơm rạ, bã mía, vỏ hạt bông, vỏ lạc, khô dầu đậu đỗ, lạc vừng…. Làm ẩm đạt độ thủy phân 70%. Ủ đống có khối lượng từ 300 kg/đống trở lên. Thời gian ủ kéo dài 4-6 ngày, đảo một lần mỗi lần cách nhau 2-3 ngày. Mùn cưa đã ủ xong trộn thêm 3% bột nhẹ (CaCO3) hoặc 1,5% vôi bột đóng vào túi nilon chịu nhiệt. Kích thước túi rộng 25cm, cao 40cm. Khối lượng 1,5kg/túi. Nút cổ túi bằng ống nhựa và bông, đưa túi mùn cưa vào nồi thanh trùng. Cấy giống nấm: Túi mùn cưa đã được thanh trùng theo một trong hai cách trên, lấy ra để trong phòng sạch sẽ, đến khi nguội. Cấy giống nấm trong các tủ cấy vô trùng sang túi mùn cưa theo tỷ lệ 2,5-3% lượng giống so với nguyên liệu. Ươm túi mùn cưa đã cấy giống và chăm sóc: Chuyển các túi mùn cưa đã cấy giống vào nhà ươm có nhiệt độ 24-26o C. Nhà cần thoáng, mát, sạch sẽ, không có ánh sáng. Thời gian ươm bịch kéo dài khoảng 60-70 ngày. Sợi nấm phát triển, ăn dần vào nguyên liệu, tạo nên màu trắng đồng nhất. Chăm sóc và thu hái nấm: Khi kết thúc thời gian nuôi sợi (pha sợi) ta chuyển các túi mùn cưa đã có sợi nấm ăn kín đáy túi, mở túi bông và miệng túi rộng ra, đặt sang phòng khác. Yêu cầu nhà có ánh sáng, nhiệt độ đạt 16-18oC, độ ẩm không khí 80%. Dùng bình phun tưới nước dưới dạng sương mù ngày 2-3 lần. Khoảng 15 ngày sau, nấm bắt đầu lên và thu hoạch. Thời gian thu hoạch kéo dài 4-5 tháng sẽ kết thúc một đợt nuôi trồng. Trong suốt quá trình chăm sóc và thu hái nấm cần chú ý đảm bảo việc tưới nước đúng lúc theo nguyên tắc: nấm lên nhiều và kích thước lớn thì lượng nước tưới nhiều lần trong ngày, hết đợt nấm ra phải tạo nên sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ "cú sốc" xuống 13-15o C kéo dài 8-12h để kích thích sự hình thành quả thể mạnh hơn. Năng suất nấm trung bình khi hết một chu kỳ thu hái mỗi túi cho thu hoạch 600-800g nấm tươi. Nấm thu hoạch xong có thể tiêu thụ ở dạng tươi hoặc phơi sấy khô ở nhiệt độ 40-45oC. Giữ nấm khô trong túi nilon, buộc chặt. Trong nhân dân có thói quen treo trên gác bếp sẽ bảo quản nấm được lâu hơn. 2.5. Nuôi cấy hệ sợi nấm Hương trong môi trường lỏng 2.5.1. Quá trình lên men chìm đối với vi sinh vật 2.5.1.1. Khái niệm Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có sục khí để bổ sung oxy hoặc nuôi tĩnh. Giống vi sinh vật sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (pha log). Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu oxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng dần đến khi nhiều có thể trào ra khỏi bình lên men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn. Ưu điểm của phương pháp: - Hiệu suất sử dụng không gian cao (ba chiều), lượng hoạt chất được sinh tổng hợp trên thể tích sử dụng cao, hiệu suất lên men cao. - Vì quá trình lên men diễn ra trong lòng chất lỏng nên tránh được nhiễm khuẩn. - Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu đáp ứng được nhu cầu sinh lý của vi sinh vật. - Các thiết bị cơ giới hóa và tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công. Tuy nhiên kỹ thuật lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị chịu áp lực và đòi hỏi đảm bảo vô trùng tuyệt đối. 2.5.1.2. Các phương pháp lên men chìm a. Lên men gián đoạn: Quá trình này còn gọi là lên men theo mẻ có hoạt động như là một hệ thống đóng kín. Sự phát triển vi sinh vật được phân chia thành 4 pha đặc thù: Pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha lũy thừa), pha dừng, và pha suy tàn. Pha lag: Khi cấy các tế bào vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi. Trong giai đoạn này vi sinh vật làm quen với môi trường, thích nghi dần với điều kiện môi trường mới. Pha log: Cuối pha lag các tế bào đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ, quần thể vi sinh vật chuyển sang pha log, pha phát triển năng động nhất. Pha dừng hay pha ổn định: Sau khi đồng hóa các chất dinh dưỡng hay sau khi tích lũy các sản phẩm trao đổi chất, sinh trưởng của vi sinh vật giảm xuống hay hoàn toàn ngừng lại. Trong pha ổn định này sinh khối có thể còn tăng chậm hoặc không đổi. Pha suy tàn: Đặc trưng của pha này là các chất dinh dưỡng bị cạn kiệt. Năng lượng của tế bào giảm đến tối thiểu và tế bào chết dần. Minh hoạ các pha phát triển nêu trên hình 2.2. b. Lên men bổ sung Kỹ thuật lên men bổ sung ứng dụng thích hợp cho các trường hợp sau: Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định (lên men nấm men) Nồng độ cơ chất cần khá cao và không đổi Phải bổ sung tiền chất liên tục. logxx III IV II I t |h| Hình 2.2. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn (I- Pha lag, II- Pha log, III- Pha ổn định, IV- Pha suy tàn) 2.5.2. Ảnh hưởng của chủng giống Theo một số kết quả nghiên cứu thấy rằng cùng một loài nấm Hương, nhưng các chủng giống nấm khác nhau tốc độ phát triển của chúng cũng khác nhau. Mata và CS [6] khi nuôi cấy 11 chủng giống nấm Hương trên đĩa Petri với môi trường MEA đã thu nhận được đường kính sợi nấm dao động từ 4,9 đến 7,1cm. Chủng Q616 có đường kính phát triển thấp nhất là 4,9cm, chủng M115 và V084 có đường kính phát triển lớn nhất sau 7 ngày nuôi cấy. Các chủng còn lại có đường kính từ 5,9cm đến 6,8cm. Theo nghiên cứu của De Carvalho [7] thì đường kính phát triển của 2 chủng Lentinula edodes em BDA và Lentinula edodes em SDA trên môi trường thạch là khác nhau. Sau 10 ngày, kết quả đo đường kính phát triển của chúng tương ứng là 9,2cm và 4,5cm. 2.5.3. Môi trường nuôi cấy lỏng cho nấm Hương 2.5.3.1. Nhu cầu dinh dưỡng của nấm Hương Về nguồn cacbon, nấm Hương có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đa đường (như tinh bột, chất xơ, chất gỗ). Về nguồn nitơ, nấm Hương có thể sử dụng nitơ hữu cơ như protein, peptit, axit amin hay urê. Tỷ lệ C:N trong môi trường ở giai đoạn nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1. Nhưng tỷ lệ C:N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thì tỷ lệ C:N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1. Theo nghiên cứu này bổ sung cám gạo vào môi trường đến một lượng nhất định thu được kết quả tỷ lệ C:N phù hợp nhất là 30:1 cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [14]. Về nhu cầu nguyên tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm hương còn cần một số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ sung thêm khoảng 2mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn. Khi có Fe, Mn, Zn tồn tại trong môi trường với nồng độ thích hợp thì việc bổ sung thêm một chút Cu và Mo có thể làm xúc tiến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm. Khi nuôi trồng nấm Hương cần lưu ý bổ sung vitamin B1. Các vitamin khác nấm Hương đều có thể tự tổng hợp. Trong 1 lít môi trường nuôi cấy cần bổ sung 100μl vitamin B1. Một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật như gibberellin (GA3), axit indolaxetic (IAA), kinetin (KT)…cũng có tác dụng xúc tiến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [1]. Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cácbon, nitơ, chất khoáng… đáp ứng cho nhu cầu phát triển của hệ sợi nấm Hương. 2.5.3.2. Môi trường giữ giống Có hai loại môi trường thường được sử dụng cho mục đích giữ giống nấm Hương, đó là môi trường PDA và môi trường MEA. Môi trường PDA: Áp dụng để giữ giống trong ống thạch nghiêng và đĩa Petri. Thành phần trong 1 lít môi trường gồm: 200g khoai tây, 20g glucoza (có thể thay bằng đường kính hoặc maltoza), 20g thạch và nước. Trong 200g khoai tây có 38g hydratcacbon, 0,2 chất béo, 6g protein và 158g nước. Bên cạnh đó, khoai tây còn chứa các chất dinh dưỡng như vitamin, chất khoáng. Môi trường MEA: Thành phần gồm chiết malt 15g và thạch 20g trong 1 lít môi trường. 2.5.3.3. Môi trường nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương 1. Môi trường YEM: 2g chất chiết nấm men, 10g chất chiết malt, 1 gam CaSO4 . Tính cho 1 lít. 2. Môi trường PD (đường và khoai tây): 200g khoai tây, 10 g glucose (hoặc dextrose). Tính cho 1 lít. 3. Môi trường YMPG: 3 g chất chiết men, 3g chất chiết malt, 5g peptone, 10g glucose. Tính cho 1 lít. 4. Môi trường ME: 15 g chất chiết malt, 5g pepton. Tính cho 1 lít. 5. Môi trường YME: 2% chất chiết malt, 0.2% chất chiết nấm men. Tính cho 1 lít. 6. Môi trường PDR: 200 g khoai tây, 10 g glucose; 0,25 g cám gạo. Tính cho 1 lít. 7. Môi trường PDY: 20g chất chiết nấm men, 10g glucose; 250g khoai tây. Tính cho 1lit. 8. Môi trường MP: 20g chất chiết malt, 250g khoai tây, 20g glucose. Tính cho 1 lít 9. Môi trường SMPY: 10g Sucrose; 10g chất chiết malt; 5g pepton; 5g chất chiết nấm men. Tính cho 1 lít. 10. Môi trường CYM 2g pepton; 2g chất chiết nấm men; 20g glucose; 0,5g K2HPO4; 0,5g MgSO4; 0,46g KH2PO4. Tính cho 1 lít [5,6,10,11]. 2.5.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng đối với nấm Hương 2.5.4.1. Nồng độ ôxy Nấm Hương thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quá trình nuôi hệ sợi nấm Hương nên bổ sung ôxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí. Bào tử nấm sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) khoảng 24 giờ, rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (còn gọi là pha log). Cuối pha lag các bào tử nấm đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ. Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu ôxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng. Nên phải cấp khí ôxy bằng cách lắc ở quy mô phòng thí nghiệm và dùng thiết bị sục khí như khuấy, sục khí ở quy mô sản xuất để tăng hiệu suất lên men cao tạo sinh khối sợi nấm Hương. Theo nghiên cứu của Hassegawa trong môi trường nuôi cấy lỏng với sự cung cấp ôxy thông qua chế độ nuôi có lắc và không lắc (nuôi tĩnh) sử dụng môi trường YEM ở nhiệt độ 25oC. Khi nuôi cấy tĩnh chỉ thu được hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tối đa là 4 mg/ml. Trong khi nuôi cấy có lắc với tốc độ 150 vòng/phút thì hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm Hương tăng lên 5 mg/ml [5]. 2.5.4.2. Nhiệt độ môi trường Bào tử nấm Hương nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 22-26oC. Trong điều kiện khô hạn ở 70oC bào tử đảm của nấm sẽ bị chết sau 5 giờ. Nếu ở 80oC thì sẽ chết chỉ sau 10 phút. Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Sợi nấm phát triển ở dải nhiệt độ từ 5 đến 35oC nhưng phát triển tốt nhất ở 20 đến 25oC. Đây là nhiệt độ phù hợp với điều kiện khí hậu ở nhiều vùng của nước ta. Còn dưới nhiệt độ 10oC và trên nhiệt độ 32oC sự sinh trưởng của hệ sợi nấm bị hạn chế. Đến nhiệt độ 35oC sợi nấm bắt đầu ngừng phát triển [3]. Theo nghiên cứu của Hassegawa thì ở nhiệt độ 20oC thu được lượng sinh khối sợi nấm là lớn nhất, hay 20oC là nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương. Tác giả này đã nghiên cứu với nhiều môi trường khác đều cho kết quả ở nhiệt độ này là tối ưu [5]. Trong nhiều nghiên cứu khác, người ta thường dùng khoảng nhiệt độ 20 đến 25o cho sự phát triển của hệ sợi. Nghiên cứu tại Trường đại học Utah [13] cho biết điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm trong môi trường rắn và lỏng đều là 25oC. Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Ishikawa và CS [8] thì nhiệt độ phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm Hương cũng là 25oC. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ 25oC cho sinh khối sợi cao và nhiệt độ này là khoảng nhiệt độ phòng thí nghiệm và thường phù hợp với điều kiện tự nhiên của nhiều vùng nên không đòi hòi khắt khe về thiết bị nuôi, giảm chi phí cho quá trình lên men. 2.5.4.3. Độ pH môi trường Độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng của hệ sợi của nấm Hương trên môi trường nuôi cấy rắn là pH 5,0-6,0. Sau khi nuôi cấy được vài ngày, pH môi trường sẽ giảm đi rất nhanh do nấm Hương sản sinh ra một số axit hữu cơ như axit axetic, axit sucxinic, axit oxalic. Trong giai đoạn nuôi sợi, pH không ảnh hưởng nhiều đến sinh khối sợi. Thường sử dụng pH tự nhiên của môi trường dinh dưỡng. Trong nuôi cấy lỏng, theo nghiên cứu của Hassegawa và CS thì pH tối ưu cho sợi nấm phát triển trên môi trường dung dịch là 4,5. Tuy nhiên, ở pH 4,5 này thì vi khuẩn cũng phát triển mạnh, nên pH từ 3 – 3,5 là tốt nhất vì ở pH này hệ sợi phát triển tốt và kháng khuẩn [5]. 2.5.4.3. Cường độ ánh sáng Ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát triển hệ sợi, vì trong giai đoạn phát triển hệ sợi không cần quan tâm đến cung cấp ánh sáng. Khi nuôi trên môi trường thạch đĩa, thường nuôi ở trong tủ ấm, không có ánh sáng, hệ sợi nấm Hương vẫn phát triển tốt. Tuy nhiên, đối với nuôi cấy môi trường lỏng (trong thiết bị lên men) thì thường sử dụng nuôi ở ánh sáng phòng hay trong tối [9]. PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung và phương pháp bố trí thí nghiệm 3.1.1. Sự phát triển của các chủng nấm Hương khác nhau trên môi trường thạch PDA Để đánh giá và so sánh sự phát triển của các chủng nấm Hương, chúng tôi tiến hành nuôi các chủng nấm này trên môi trường nuôi cấy rắn (môi trường thạch PDA). Đối tượng nghiên cứu là 3 chủng nấm Hương: Lentinula edodes Thái, Lentinula edodes Sapa, Lentinula edodes L170. Sử dụng môi trường nuôi cấy rắn PDA (200 khoai tây, 20g glucose, 20g agar/1 lít môi trường), pH tự nhiên của môi trường. Nhiệt độ môi trường nuôi cấy là 25oC trong tủ ấm. Xác định đường kính phát triển của các chủng giống sau 6, 9 và 12 ngày nuôi cấy. Từ đánh giá tốc độ phát triển của các chủng nấm Hương trên môi trường thạch đĩa để kết luận chủng giống nào phát triển tốt nhất trên môi trường rắn làm cơ sở cho sự nghiên cứu phát triển của các chủng giống này trong môi trường nuôi cấy lỏng tiếp theo. 3.1.2. Sự phát triển của các chủng nấm Hương khác nhau trong môi trường lỏng Đối tượng nghiên cứu là 3 chủng nấm Hương trên (đã nghiên cứu ở phần 3.1.1). Môi trường nuôi cấy là PDR lỏng. Trước tiên tăng sinh giống trong môi trường PD lỏng (200g khoai tây, 20g glucose/ 1 lít môi trường) sau 10 ngày phát triển, số lượng giống đã tăng lên đáng kể thì cấy chuyển sang môi trường lỏng PDR. Nuôi cấy ở cùng điều kiện của môi trường phòng thí nghiệm (20-30oC), pH 4,5, tốc độ lắc 150 vòng/ phút (lắc 8 giờ/ ngày chia làm 2 lần). Lấy mẫu để xác định khối lượng sinh khối khô vào các ngày 10, 15, 20, 25 và 30. Kết quả cần xác định là sự biến đổi sinh khối của các chủng giống để xem chủng nào có khả năng phát triển tốt nhất trong môi trường lỏng và thời gian nuôi cấy bao lâu để đạt được giá trị sinh khối lớn nhất. 3.1.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường tới sự phát triển sinh khối của nấm Hương trong môi trường lỏng Từ mục 3.1.1 và 3.1.2. có được chủng giống nấm Hương có khả năng mọc tốt nhất trong môi trường rắn và lỏng. Chon một chủng giống tốt nhất để sử dụng cho thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lỏng. Sử dụng 5 môi trường nuôi cấy lỏng khác nhau: 1- Môi trường PD (200g khoai tây, 20g glucose), PDR (200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo), YME (2g chất chiết nấm men, 10g chất malt, 1g CaSO4 ), ME (chiết malt 40ml), YMPG (3g chất chiết nấm men, 3g chất chiết malt, 5g peptone, 10g glucose). Hàm lượng trong các môi trường tính cho 1 lít. Điều kiện nuôi cấy có cùng nhiệt độ, pH 4,5, tốc độ lắc 150vòng/phút (8 giờ/ngày chia làm 2 lần). Tại thời điểm sinh khối lớn nhất (xác định được từ mục 3.1.2.) sẽ dừng thí nghiệm để xác định khối lượng sinh khối khô của tất cả các mẫu. 3.1.4. Ảnh hưởng của pH tới sự phát triển sinh khối của nấm Hương trong môi trường lỏng Sử dụng kết quả thu được của mục 3.1.1 và 3.1.2 sẽ biết được chủng giống thích hợp và thời gian phát triển tối ưu. Sử dụng kết quả của mục 3.1.3 sẽ biết được loại môi trường thích hợp cho sự phát triển. Sử dụng các kết quả đó cho phần này để xác định khoảng pH tối ưu. Các điều kiện nuôi cấy được duy trì như các phần trên, chỉ có sự khác biệt về pH trong khoảng 3,0-6,0. Dự chọn 7 giá trị pH là: 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. 3.2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng giống nấm Hương: 1- Chủng lentinula edodes Thái do Viện Di truyền nông nghiệp cung cấp. Chủng giống này có nguồn gốc xuất xứ từ Thái Lan. 2- Chủng lentinula edodes Sa Pa của Viện Bảo tàng Vi sinh vật cung cấp. Chủng giống này được phân lập tại Sa Pa. 3- Chủng lentinula edodes L170 do Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt cung cấp. Theo PGS-TS Lê Xuân Thám là người tặng chủng giống thì chủng này có nguồn gốc xuất xứ từ Nhật Bản. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ tiến hành Nồi hấp khử trùng, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, máy lắc, cân kỹ thuật (độ chính xác đến 10-4), bếp điện, máy đo độ đường. Dụng cụ thủy tinh các loại: bình tam giác 250ml, ống nghiệm, ống đong, phễu, cốc, que cấy, que trang, đũa thủy tinh, đĩa petri. Micropipet loại 1ml và 0,2ml, giấy đo pH và thang đo pH. Các dụng cụ khác: bình định mức 1 lít, đầu côn, bông, giấy báo, nồi nấu, dao, vải màn lọc, que đục lỗ thạch. 3.2.3. Môi trường nuôi cấy 3.2.3.1. Môi trường nuôi cấy rắn Môi trường thạch PDA (200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar). Tính cho 1 lít. 3.2.3.2. Môi trường nuôi cấy lỏng 1- Môi trường PD: 200g khoai tây, 20g glucose. 2- Môi trường PDR: 200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. 3 - Môi trường YME: 2g chất chiết nấm men, 10g chất chiết malt, 1g CaSO4. 4 - Môi trường ME: 40ml dịch chiết malt. 5 - Môi trường YMPG: 3g chất chiết men, 3g chiết malt, 5g peptone, 10g glucose. Các thành phần của các môi trường nêu trên đều tính cho 1 lít môi trường sau khi hoàn thành. 3.2.4. Phương pháp chuẩn bị môi trường thạch đĩa PDA Khoai tây (đã gọt vỏ, cắt nhỏ) – 200g, glucoza – 20g, 20g thạch và nước cho đủ 1 lít. Đun sôi đến chín kỹ khoai tây rồi lọc qua vải màn. Sau đó mới thêm thạch bổ sung cho đủ 1 lít rồi đun cho tan thạch. Phân vào các bình tam giác, đậy nút bông rồi hấp khử trùng ở điều kiện áp suất 1at trong 20 phút. Môi trường này không cần điều chỉnh pH. Sau khi khử trùng môi trường để nguội xuống khoảng 50oC tiến hành đổ vào đĩa Petri vô trùng khoảng 20ml rồi dùng tay xoay tròn cho môi trường dàn đều trong đĩa. Sau đó đậy nắp để thạch đông thì lật ngược lại cho vào tủ ấp. Sau một ngày kiểm tra đĩa thạch nào bị nhiễm mốc xanh hay đen thì loại bỏ. Các đĩa sử dụng phải vô trùng mới mang đi cấy giống nấm. 3.2.5. Phương pháp chuẩn bị các môi trường nuôi cấy lỏng 3.2.5.1. Chuẩn bị dịch chiết men và dịch chiết malt - Chuẩn bị dịch chiết malt Lấy 300g malt và 1lít nước (điều chỉnh pH 8 bằng axit lactic). Khuấy đều cho malt tan và nâng nhiệt độ lên 52oC trong thời gian là 30 phút, sau đó nâng tiếp nhiệt độ lên 60oC trong 30 phút, tiếp tục nâng nhiệt độ lên 62oC trong thời gian 15 phút, sau đó nâng nhiệt độ lên 70oC trong thời gian 30 phút, cuối cùng nâng nhiệt độ đến 75oC trong thời gian 15 phút rồi lọc qua vải màn, tiếp tục lọc qua vải lọc malt. Sau khi lọc sạch bằng vải lọc dùng máy đo độ đường điều chỉnh bằng nước cất sao cho độ đường Brix = 10. Sau đó phân vào các bình nón, đậy nút bông và bọc giấy báo mang đi hấp khử trùng trong nồi hấp khử trùng ở 120oC trong thời gian 25 phút, và để nguội, cho vào tủ lạnh để bảo quản đến khi sử dụng. - Chuẩn bị dịch chiết nấm men Lấy 1 kg men bia (bã) hòa với 3 lít nước thủy phân ở nhiệt độ 52oC trong 42 giờ. Sau đó ly tâm (lọc) lấy phần nước ở trên, phân vào các bình tam giác, và đậy nút bông, bọc giấy báo mang khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 120oC, 1at trong thời gian 25phút. Để nguội 1 ngày mới bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng. 3.2.5.2. Chuẩn bị 5 môi trường nuôi cấy lỏng 1- Môi trường PD (môi trường dịch chiết đường khoai tây: 200g khoai tây, 20g glucose. Tính cho 1 lít): Khoai tây gọt vỏ cắt nhỏ được 200g bổ sung 1 lít nước đem nấu chín kỹ rồi mang lọc qua vải màn. Lúc này lượng nước đã giảm, phải định lượng thêm nước đến 1 lít môi trường rồi bổ sung 20g đường glucose. Đun nóng cho tan đường rồi điều chỉnh pH theo yêu cầu. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 160oC trong 2 giờ. 2- Môi trường PDR (môi trường dịch chiết khoai tây đường bổ sung cám gạo: 200g khoai tây, 20g glucose, 25g cám gạo. Tính cho 1 lít): Khoai tây gọt vỏ cắt nhỏ được 200g bổ sung 1 lít nước đem đun chín kỹ rồi bổ sung 25g cám gạo vào và khuấy đều. Đem lọc qua vải màn rồi lọc tiếp bằng vải lọc malt. Sau đó định lượng đến một lít, bổ sung 20g đường glucose. Đun nóng cho tan đường rồi điều chỉnh pH theo yêu cầu. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 160oC trong 2 giờ. 3- Môi trường YME (2g chất chiết nấm men, 10g chất chiết malt, 1g CaSO4. Tính cho 1 lít): Sử dụng dịch chiết nấm men và dịch chiết malt đã được chuẩn bị như đã nêu ở mục 3.2.5.1 và được bảo quản trong tủ lạnh. Tiến hành lấy 2ml dịch chiết nấm men, 10ml dịch chiết malt, 1g CaSO4 cho vào bình đựng môi trường, định lượng thêm nước đến 1 lít sau đó khuấy và đun ở nhiệt độ thấp (khoảng 50oC) cho hòa tan dung dịch. Điều chỉnh pH theo yêu cầu. Phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 160oC trong 2 giờ. 4- Môi trường ME (dịch chiết malt 40ml): Lấy 40ml dịch chiết malt vào nồi đựng môi trường. Các bước tiếp theo tương tự như thực hiện chuẩn bị các môi trường khác đã nêu. 5- Môi trường YMPG (3g chất chiết nấm men, 3g chất chiết malt, 5g peptone, 10g glucose, tính cho 1 lít): Lấy dịch chiết malt và dịch chiết nấm men vào bình định mức 100ml. Các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng như ở trên. Sau đó cho thành phần của dịch chiết malt và dịch chiết nấm men vừa đong vào bình môi trường. Định lượng thể tích đến 1 lít môi trường và bổ sung 5g pepton, 10g glucose, khuấy đều cho dung dịch môi trường được hòa tan. Điều chỉnh pH rồi phân vào các bình tam giác dung tích 250ml, mỗi bình 100 ml rồi tiệt trùng ở 160oC trong 2 giờ. 3.2.6. Phương pháp nuôi cấy 3.2.6.1. Phương pháp đặt thạch Thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Dùng que cấy móc, khử trùng bằng dung dịch cồn 70oC và hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Khi móc nguội dùng lấy sợi nấm trong ống nghiệm giống gốc rồi chấm vào 3 điểm trên đĩa thạch. Sau đó lật ngược lại nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 25oC. Sau 10 ngày khi sợi nấm phát triển rộng thì tiến hành đục lỗ thạch (nơi có sợi nấm phát triển) bằng cái đục tròn rỗng có