Khóa luận Nghiên cứu tổng hợp, xác định cấu trúc và thăm dò hoạt tính ức chế tế bào ung thư của phức ion cu2+, zn2+, cd2+ với salicylaldehyden(4) - Morpholinylthiosemicarbazone

nước ở vị trí para là có lợi cho hoạt tính này. Việc thay thế nhóm metyl của acetophenone-thiosemicarbazone bằng hydro đã làm giảm hoạt tính. Khi vòng phenyl của acetophenone-thiosemicarbazone được thay thế bằng naphthyl, thì hoạt tính sẽ tăng lên đáng kể. Theo [21], các thiosemicabazone chứa hợp phần quinoline có tính kị nước thấp hơn các hợp phần là các dẫn xuất của benzene. Có thể sắp xếp tính kị nước của N(4)-aminyl theo thứ tự tăng dần theo hoạt tính: 2H<CH3<H, CH3<H, C2H5<H, C6H5. Năm 2010, nhóm tác giả [22] đã công bố một loạt dẫn xuất benzoyl thiosemicarbazone của isoquinoline và pyridine có khả năng chống một số dòng tế bào ung thư như HuCCA-1, HepG2, A549 và MOLT-3. Hình 1.10. Một số thiosemicarbazone chứa isoquinoline và pyridine Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học cho rằng hợp chất 4 khi gắn nhóm thế phenyl vào N(4) hoạt động nhất với chỉ số IC50 = 0,004 μg/ml, nhạy gấp hàng ngàn lần so với N(3), cao hơn nhiều so với 1 và 2. Nhóm nghiên cứu đã kết luận rằng hiệu ứng không gian của nhóm phenyl kị nước đóng góp quan trọng trong việc thay đổi hoạt tính của 1. R = OMe 2. R = H 3. R = H 4. R = Ph 5. R1 = H; R2=Ph 6. R1 = Ph; R2=H 9 loại hợp chất hữu cơ này. Mặt khác, theo [1] các dẫn xuất của thiosemicarbazone được tổng hợp từ quionline có khả năng chống lại dòng tế bào ung thư HCT116. Hình 1.11. Một số thiosemicarbazone chứa dẫn xuất của quinoline Khi nhóm thế ở vị trí N (4) ở thiosemicarbazone là aldehyde hay ketone có chứa nhân thơm thì hoạt tính sinh học cao. Nhóm thế càng cồng kềnh, chứa nhiều dị tố sẽ làm tăng hoạt tính sinh học của thiosemicarbazone [1],[23]. 1.3. Định hướng nghiên cứu về phức chất của thiosemicarbazone hiện nay Với mong muốn tạo ra những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao, người ta có xu hướng sẽ chọn thiosemicarbazone có hợp phần dị vòng chứa N, do theo các tài liệu thì sự có mặt của hợp phần dị vòng có khả năng làm tăng hoạt tính của thiosemicarbazone. Mặc khác cũng mong muốn tạo ra phức chất có cấu trúc bất đối xứng để cải thiện khả năng hòa tan của chúng. Do đó chúng tôi chọn hợp phần morpholine với những tiêu chí phù hợp. Hơn nữa, các nhà nghiên cứu trên thế giới cũng rất quan tâm đến morpholine, là một amin chứa cả nhóm amin và ete và thích hợp cho khai thác, chưng cất và dung môi cho ứng dụng trong ngành công nghiệp hóa dầu [24]. Các chất dẫn xuất morpholine được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ để sản xuất hoá chất nông nghiệp, thuốc diệt nấm và chất diệt khuẩn. Nhiều hợp chất thuộc nhóm này được cho là có khả năng chống viêm, giảm đau, gây tê cục bộ, chống HIV, chống ung thư, chống trầm cảm, kháng nấm và kháng khuẩn [25]. Đối với hoạt tính kháng ung thư, Bacher và cộng sự năm 2015 [26], đã công bố phức chất Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone. Kết quả cho thấy phức Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone có khả năng tan trong nước, trong khi phức Cu(II) của hợp phần piperazine- thiosemicarbazone không hòa tan trong nước được. Đó là điểm thú vị của phức Cu(II) với hợp phần morpholine thiosemicarbazone, cho phép kiểm tra độc tính hai dòng tế bào ung thư HeLa và A549 với giá trị IC50 từ 10 25,5- 65,1 μM sau 48 giờ thử nghiệm, đồng thời khi so sánh với phối tử tự do, phức chất có hoạt tính tốt hơn. Năm 2016, nhóm tác giả người Trung Quốc, nghiên cứu một loạt các hợp chất thiosemicarbazone với hợp phần morpholine, piperazine hay N-(4-methoxyphenyl)piperazine với bảy dẫn xuất methyl hydrazin-carbodithioate của 5-acetyl-2-arylamino-4-methylthiazoles dưới bức xạ vi sóng. Tất cả các hợp chất đã được kiểm tra về hoạt động gây độc tế bào của chúng trong ống nghiệm (in vitro) đối với tế bào ung thư dạ dày, phổi và ung thư vú ở người. Khi so sánh tính gây độc của tất cả các hợp chất trên, tác giả đã nhận thấy hợp phần morpholine có hoạt tính khá tốt, tùy thuộc vào các nhóm thế khác nhau. Đặc biệt với nhóm thế cloro, hoạt động kháng ung thư cao nhất với các tế bào MCF-7 với IC50 có giá trị là 5,49 μM, tương đương với cisplatin (6,53 μM) [27]. Do đặc tính tan tốt trong nước của morpholine, mà Salicylaldehyde-N(4)- morpholinylthiosemicarbazone (SMT) của chúng tôi hiện vẫn còn là đối tượng mới chưa được tổng hợp, nghiên cứu cấu trúc. Điều đó có nghĩa là phức chất Cu(II), Zn(II),Cd(II) của SMT đều là những phức chất mới cần được nghiên cứu và thăm dò hoạt tính sơ bộ trước khi đưa vào ứng dụng trong ngành y tế. Kết luận: Ở bài nghiên cứu này, Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone (HL1) và các phức của HL1 được điều chế và dự đoán cấu trúc bằng phổ IR, UV-Vis, MS, NMR, 1D và 2D. Trong lần nghiên cứu này một loạt thí nghiệm được thực hiện để khảo sát từng yếu tố tác động lên hiệu suất tổng hợp HL1. Hơn thế nữa, mô hình Box- Hunter được áp dụng nhằm để xác định điểm tối ưu, giảm bớt đi số thí nghiệm cần phải thực hiện cũng như cải thiện những mặt hạn chế của phương pháp đơn biến mang lại. Ngoài ra, HL1 và các phức của HL1 được khảo sát khả năng ức chế 2 dòng tế bào ung thư Hep-G2 (ung thư gan), A549 (ung thư phổi). 11 1.4. Mục tiêu nghiên cứu Với tất cả những kiến thức mà chúng tôi đã nghiên cứu và trình bày, trong nghiên cứu của đề tài này, chúng tôi tập trung vào các mục tiêu sau: - Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay. - Tổng hợp và xác định cấu trúc salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone. - Tổng hợp và xác định cấu trúc một số phức ion kim loại Cu2+, Zn2+, Cd2+ với salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone. - Thăm dò khả năng gây độc tế bào u trên 2 dòng tế bào Hep-G2 (Tế bào ung thư gan), A549 (Tế bào ung thư phổi) của salicyaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone và các phức chất đã tổng hợp trên. 12 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và dụng cụ Hóa chất Dụng cụ - Carbon disulfide CS2 (d = 1,26 g/ml) (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Bình cầu chịu nhiệt 100 ml, 500 ml, 1000 ml - Ammonia NH3 (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml - Erlen bình tam giác - Morpholine C4H9NO (độ tinh khiết 98 %, Merck, Đức) - Ống đong 25 ml - Sodium chloroacetate ClCH2COONa (độ tinh khiết 98 %, Aldrich- Sigma, Mỹ) - Pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml - Ethanol C2H5OH (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Nhiệt kế thủy ngân - Hydrochloride HCl đặc (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Đũa thủy tinh - Hydrazine hydrate N2H4.xH2O 50% (độ tinh khiết 99 %, Aldrich- Sigma, Mỹ) - Giấy lọc - Salicylaldehyde (độ tinh khiết 98 %, Merck, Đức) - Cân kỹ thuật - Acid acetic CH3COOH (độ tinh khiết 99%, Xilong, Trung Quốc) - Bếp điện - Copper (II) nitrate tryhydrate Cu(NO3)2. 3H2O (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Máy khuấy từ, cá từ - Zinc (II) nitrate hexahydrate Zn(NO3)2. 6H2O (độ tinh khiết 99,5 %, Xilong, Trung Quốc) - Hệ thống lọc chân không - Cadmium (II) nitrate tetrahydrate Cd(NO3)2. 4H2O (độ tinh khiết 99,5%, Xilong, Trung Quốc) - Hệ thống sinh hàn ngược 13 2.2. Tổng hợp hỗn hợp Salicyaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT ( HL1) 2.2.1. Quy trình tổng hợp SMT Sơ đồ tổng hợp SMT qua 3 giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Tổng hợp Carboxymethyl-N(4)-morpholinyldithiocarbamate (CMT) Cho vào cốc 12ml CS2 (0,2 mol) và 24 ml NH3 25% được khuấy đều trên máy khuấy từ ở 0-10oC. Cho từ từ 0,2 mol morpholine (17,5 ml) vào hỗn hợp trên thật chậm từng giọt. Sau 30 phút, khi chất rắn màu vàng tách ra khỏi dung dịch, hỗn hợp được tiếp tục khuấy liên tục ở 0-100C trong 90 phút nữa để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Lọc nhanh thu được kết tủa vàng, hòa tan kết tủa vàng trong 300 ml nước cất, khuấy trên máy khuấy từ. Sau đó, nhỏ từ từ dung dịch chứa 23,3 g ClCH2COONa đến hết. Dung dịch màu vàng nhanh chóng nhạt màu và tiếp tục được khuấy đều trong 5-6 giờ. Cho khoảng 10 ml HCl 36% vào dung dịch không màu trên tạo ngay kết tủa trắng.Lọc lấy kết tủa trắng, dịch lọc tiếp tục được axit hóa từ từ cho đến khi không còn xuất hiện kết tủa trắng thì dừng.Sản phẩm được kết tinh lại trong ethanol, lọc lấy kết tủa hình kim bằng phểu lớn, cho vào cốc để khô tự nhiên. Hiệu suất phản ứng đạt 82%. 14 Giai đoạn 2: Tổng hợp N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) Cân 22,1 g sản phẩm giai đoạn 1 hòa vào 10 ml nước cất và 25 ml N2H4.H2O cho vào bình cầu. Đun cách thủy ở 80oC khoảng 15 phút kết tủa tan tạo dung dịch đồng nhất và chuyển sang màu tím, xuất hiện kết tủa màu trắng, tiếp tục đun cách thủy thêm 45 phút nữa.Kết tinh lại sản phẩm bằng ethanol, hiệu suất phản ứng đạt 65%. Giai đoạn 3 : Quy hoạch thực nghiệm Tổng hợp Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT (HL1) bằng cách ngưng tụ Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol. Đun hồi lưu hỗn hợp gồm m(g) MT trong ethanol và 3 giọt acid acetic băng (hỗn hợp 1). Nhỏ từ từ V(ml) Salicylaldehyde vào hỗn hợp 1 ở nhiệt độ ToC. Sau đó, kết tủa màu vàng SMT (HL1) bắt đều xuất hiện.Các giá trị m, V, và T được khảo sát như mục 2.3 2.3. Tối ưu hóa điều kiện tổng hợp SMT 2.3.1. Xác định các mức cơ sở bằng phương pháp đơn biến - Sự ảnh hưởng của xúc tác acid đến hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol MT được đun hồi lưu trong ethanol ở 900C trong vòng 2 giờ với các xúc tác acid HCl đặc, H2SO4 đặc, HNO3 đặc, CH3COOH đặc. 15 - Sự ảnh hưởng của yếu tố tỉ lệ mol SA : MT (T) lên hiệu suất: hỗn hợp SA với MT với T lần lượt là 0,8; 1,0; 1,2 và 1,5 được đun hồi lưu trong ethanol ở 900C trong vòng 2 giờ với xúc tác CH3COOH đặc. - Sự ảnh hưởng của nhiệt độ nước cách thủy (T) lên hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol MT được đun hồi lưu trong ethanol lần lượt ở 60; 70; 80 và 900C trong vòng 2 giờ với xúc tác CH3COOH đặc. - Sự ảnh hưởng của yếu tố thời gian lên hiệu suất: 1 mmol SA và 1 mmol MT được đun hồi lưu trong ethanol ở 900C ở trong vòng 30, 60, 90, 120, 150 phút với xúc tác CH3COOH đặc. 2.3.2. Mô hình bề mặt (RSM) tối ưu hóa hiệu suất tổng hợp HL1 Salicylaldehyde-N(4)-morpholinylthiosemicarbazone SMT (HL1) được tổng hợp bằng cách ngưng tụ Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol, có mặt của xúc tác acid acetic băng, chúng tôi đã chọn phương án trực giao cấp 1 và cấp 2 để mô tả bề mặt đáp ứng sự ảnh hưởng của hai biến : tỉ lệ mol tác chất và thời gian phản ứng, vì theo khảo sát theo sự ảnh hưởng theo nhiệt độ thì ở nhiệt độ 900C đã cho hiệu suất tương đối cao, ổn định và là nhiệt độ tối đa của phản ứng, nên ta bỏ qua việc tối ưu hóa nhiệt độ. Mô hình trực giao cấp 1 Gọi tỉ lệ mol SAL : MT và thời gian phản ứng lần lượt là x1 và x2. Bảng 2.1 trình bày các mức khảo sát của từng biến. Bảng 2.2 trình bày các thí nghiệm cần tiến hành N = 22 = 4 thí nghiệm theo mô hình trực giao cấp 1. Dựa trên kết quả khảo sát đơn biến, các mức của yếu tố ảnh hưởng được xác định và trình bày trong bảng 2.1 Bảng 2.1. Các mức và khoảng biến thiên của các yếu tố ảnh hưởng Biến Các mức biến thiên Khoảng biến thiên Mức dưới -1 Mức cơ sở 0 Mức trên +1 x1 0,6 0,8 1,0 0,2 x2 90 120 150 30 16 Bảng 2.2. Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1 N x0 x1 x2 x1x2 % Sản phẩm y 1 +1 -1 -1 +1 33 2 +1 +1 -1 -1 43 3 +1 -1 +1 -1 36 4 +1 +1 +1 +1 0 Cùng với 3 thí nghiệm ở tâm phương án N0 x1 x2 y0tâm 1 0,8 120 60 2 0,8 120 58 3 0,8 120 58 Mô hình trực giao cấp 2 Cũng với các biến và mức đã chọn ở bảng 1, chúng tôi tiến hành khảo sát các thí nghiệm theo tiêu chuẩn mô hình trực giao cấp 2 như sau: + Phần cơ sở: có 2k = 22 = 4 thí nghiệm hoàn toàn giống quy hoạch trực giao cấp 1 + Phần tâm: các thí nghiệm ở tâm miền quy hoạch + Phần cánh tay đòn: là các thí nghiệm cách tâm (dạng mã hóa gốc tọa độ) một đoạn α > 0 với xj = ± α ( k 2 4 4α = 2 = 2 = 1,414 , k là số lượng yếu tố khảo sát) ,ứng với số thí nghiệm là 2.k = 2.2 = 4 Vậy tổng số thí nghiệm trong phương án là N = 2k + 2.k + N0 =13 Ma trận thực nghiệm cấp 2 được xây dựng theo bảng 2.3 17 Bảng 2.3. Ma trận quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 N x0 x1 x2 x1x2 x12 x22 y 1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 33 2 +1 +1 -1 -1 +1 +1 43 3 +1 -1 +1 -1 +1 +1 36 4 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0 5 +1 -1,414 0 0 +2 0 20 6 +1 +1,414 0 0 +2 0 0 7 +1 0 -1,414 0 0 +2 54 8 +1 0 +1,414 0 0 +2 50 9 +1 0 0 0 0 0 60 10 +1 0 0 0 0 0 56 11 +1 0 0 0 0 0 58 12 +1 0 0 0 0 0 58 13 +1 0 0 0 0 0 58 2.4. Tổng hợp phức chất đồng, kẽm, cadmi 2.4.1. Tổng hợp phức chất CuL1 Cân 0,53g (0,002 mol) phối tử HL1, cho hoàn tan vào 30mL dung dịch ethanol. Đun ở nhiệt độ khoảng 60oC cho phối tử tan hết. Dung dịch thu được có màu vàng, sau đó hạ nhiệt độ của hỗn hợp khoảng 50oC. Cân 0,24g (0,001 mol) Cu(NO3)2.3H2O, hòa tan trong 15mL ethanol để cho muối tan hết. Dùng pipet mũi dài, nhỏ từ từ dung dịch muối vào dung dịch phối tử khi nhiệt độ dung dịch phối tử là 50oC. Đun hồi lưu hỗn hợp với máy khuấy từ trong khoảng 30 phút, kết tủa màu xanh lá xuất hiện sau 90 phút. Phức chất được để khô tự nhiên, hiệu suất phản ứng là 49%. Quá trình xảy ra được đề nghị như sau: 18 2.4.2. Tổng hợp phức chất ZnL1 Cân 0,53g (0,002 mol) phối tử HL1,cho hoàn tan vào 30mL dung dịch ethanol. Đun ở nhiệt độ khoảng 60oC cho phối tử tan hết. Dung dịch thu được có màu vàng, sau đó hạ nhiệt độ của hỗn hợp khoảng 50oC. Cân 0,30 mg (0,001 mol) Zn(NO3)2.6H2O, hòa tan trong 15mL ethanol để cho muối tan hết. Dùng pipet mũi dài, nhỏ từ từ dung dịch muối vào dung dịch phối tử khi nhiệt độ dung dịch phối tử là 50oC. Đun hồi lưu hỗn hợp với máy khuấy từ trong khoảng 30 phút, kết tủa màu trắng xuất hiện sau 90 phút. Phức chất được để khô tự nhiên, hiệu suất phản ứng là 45%. Quá trình xảy ra được đề nghị như sau: 2.4.3. Tổng hợp phức chất CdL1 Cân 0,53g (0,002 mol) phối tử HL1, cho hoàn tan vào 30mL dung dịch ethanol. Đun ở nhiệt độ khoảng 60oC cho phối tử tan hết. Dung dịch thu được có màu vàng, sau đó hạ nhiệt độ của hỗn hợp khoảng 50oC. Cân 0,31g (0,001 mol) Cd(NO3)2.4H2O, hòa tan trong 15mL ethanol để cho muối tan hết. Dùng pipet mũi dài, nhỏ từ từ dung dịch muối vào dung dịch phối tử khi nhiệt độ dung dịch phối tử là 50oC. Đun hồi lưu hỗn hợp với máy khuấy từ trong khoảng 30 phút, kết tủa màu vàng xuất hiện sau 90 phút. Phức chất được để khô tự nhiên, hiệu suất phản ứng là 59%. Quá trình xảy ra được đề nghị như sau: 19 2.5. Phương pháp nghiên cứu 2.5.1. Quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp trực giao Tìm điều kiện tối ưu nhất để tổng hợp Salicylaldehyde-N(4)–morpholinyl thiosemicarbazone. 2.5.2. Phương pháp tổng hợp Sử dụng các phương pháp truyền thống trong tổng hợp hữu cơ và trong tổng hợp phức chất. 2.5.3. Phương pháp nghiên cứu thành phần và cấu trúc của phối tử và phức chất 2.5.3.1. Đo nhiệt độ nóng chảy Khoảng nhiệt độ nóng chảy của SMT và dự đoán sự tinh khiết của CMT, MT được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp MPD -350 tại phòng thí nghiệm Hóa đại cương, khoa Hóa học, trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh. 2.5.3.2. Phổ hấp thu hồng ngoại FT- IR Phân tích thành phần nhóm chức và sự biến đổi dao động của các nhóm chức đặc trưng trong cấu trúc của phối tử và phức chất tại Viện Công nghệ Hóa học Thành phố Hồ Chí Minh. 2.5.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR 1D và 2D Thành phẩn và cấu trúc phân tử phối tử và phức chất được xác nhận qua thông tin từ các phổ cộng hưởng từ một chiều 1H, 13C-NMR, và hai chiều COSY, HSQC, HMBC được ghi trên máy Brucker 500 MHz (trong DMSO) và HRMS trên máy FT-ICR-MS, Varian 910 tại phòng NMR, viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. 2.5.3.4. Phổ khối lượng ESI MS Phổ khối lượng của phối tử và phức chất được xác định trên máy 1100-Series LC-MSD- Trap- SL trong dung môi methanol, bằng phương pháp ion hóa bởi dòng phun ESI, viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. 20 2.5.4. Phương pháp thăm dò hoạt tính sinh học Thử khả năng ức chế tề bào u của phối tử và phức chất tại phòng sinh học thực nghiệm Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên -Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam Hà Nội trên hai dòng tế bào Hep-G2, A549. 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá các mức của khảo sát đơn biến Các kết quả của khảo sát từng yếu tố ảnh hưởng lên hiệu suất được trình bày ở bảng 3.1 dưới đây a) Sự ảnh hưởng của xúc tác acid. Điều kiện phản ứng: tỷ lệ mol 1:1, nhiệt độ 900C, thời gian 2 giờ. Xúc tác Acid HCl đặc H2SO4 đặc HNO3 đặc CH3COOH đặc Không xúc tác Hiệu suất % 38 17 9 49 45 Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào xúc tác acid Kết luận : Có thể nhìn thấy CH3COOH đặc cho hiệu quả xúc tác tốt nhất khi mà phản ứng ngưng tụ giữa SA và TM đạt hiệu suất khoảng 49%. Đối với H2SO4 đặc và HNO3 đặc lại cho kết quả hiệu suất khá thấp vì do khả năng oxi hóa mạnh, thêm vào đó, vì chúng là các acid mạnh nên ngoài việc proton hóa nguyên tử O của phân tử SA, còn proton hóa nguyên tử N của TM, dẫn đến làm giảm tính nucleophile của nhóm chức amine. Chính vì thế, CH3COOH đặc được chọn làm xúc tác acid cho các thí nghiệm sau. b) Sự ảnh hưởng của tỉ lệ mol T = 𝒔ố 𝒎𝒐𝒍 𝑺𝑨𝑳 𝒔ố 𝒎𝒐𝒍 𝑴𝑻 đến hiệu suất Hình 3.1. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào yếu tố tỉ lệ mol T Dựa trên kết quả thu được từ hình 3.1 điểm cực đại của T=0,8, phản ứng đạt hiệu suất cao nhất, nên ta chọn tỷ lệ 0.8:1 thực hiện phản ứng khảo sát tiếp theo. 22 c) Sự ảnh hưởng của nhiệt độ nước cách thủy. Với tỉ lệ mol T = 0.8:1, xúc tác acid CH3COOH đặc, ta thấy ở 900C phản ứng đạt hiệu suất cao nhất Hình 3.2. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào nhiệt độ nước cách thủy d) Sự ảnh hưởng của thời gian. Với tỉ lệ mol T = 0.8:1 , ở 900C , và với xúc tác acid CH3COOH đặc, ta thấy ứng với thời gian t =120 phút phản ứng đạt hiệu suất cao nhất. Hình 3.3. Sự phụ thuộc của hiệu suất vào thời gian Dựa trên kết quả thu được từ bảng 3.1 và hình 3, hình 4, hình 5 Salicylaldehyde (SAL) với N(4)-morpholinylthiosemicarbazide (MT) trong dung môi ethanol, có mặt của xúc tác acid acetic băng, chúng tôi đã chọn phương án trực giao cấp 1 và cấp 2 để 23 mô tả bề mặt đáp ứng sự ảnh hưởng của hai biến : tỉ lệ mol tác chất và thời gian phản ứng, vì theo khảo sát theo sự ảnh hưởng theo nhiệt độ thì ở nhiệt độ 900C đã cho hiệu suất tương đối cao, ổn định và là nhiệt độ tối đa của phản ứng, nên ta bỏ qua việc tối ưu hóa nhiệt độ. 3.2 Thiết lập phương trình hồi quy Với số liệu thu được, chúng tôi tiến hành xử lý theo phương án trực giao cấp 1 Phương trình hồi quy theo toán học có dạng: 0 1 1 2 2 12 1 2y b b x b x b x x= + + + Các hệ số hồi quy bj được tính theo công thức: N 0 i i 1 1 b y N = =  ; N i ij i i 1 1 b x y N = =  N x0y x1y x2y x1x2y 1 33 -33 -33 33 2 43 43 -43 -43 3 36 -36 36 -36 4 0 0 0 0 Từ số liệu thực nghiệm ta xác định được các giá trị b0, bi như sau: bo b1 b2 b12 28 -6,5 -10 -11,5 Để kiểm định ý nghĩa của hệ số hồi quy và sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm phải làm thêm 3 thí nghiệm ở tâm phương án để xác định phương sai tái hiện. N0 yt0 ( 0 ty - 0 y )2 1 60 1,77 2 58 0,45 3 58 0,45 Với 0N 0 0 t0 t 1 1 y y N = =  . Phương sai tái hiện theo công thức: 0N 0 2 0 2 th t0 t 1 1 S (y y ) N 1 = = − −  với N0 là số thí nghiệm lặp ở tâm. Thay vào được kết quả 2 thS = 1,335 Hệ số b trong phương trình hồi quy cấp 1 độc lập nhau và xác định với độ chính xác (Sbj) th bj S S N = thay số vào tìm được Sbj = 0,58 24 Ý nghĩa của các hệ số b được kiểm định theo chuẩn Student (t) xác định như sau: j j bj b t S = . Kết quả thu được các giá trị tj tbo tb1 tb2 tb12 48,28 11,21 17,24 19,83 Tra bảng phân phối phân vị Student với mức ý nghĩa p = 0.05, f = N0-1 = 2 ta có 0.05(2)t = 4.3. Vậy các hệ số tj đều lớn hơn t0.05(2) nên các hệ số b của phương trình hồi quy đều có nghĩa. Phương trình hồi quy có dạng sau: y =28 – 6,5x1 -10x2 -11,5x12 Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm: Phương sai dư tính theo công thức N 2 tt lt 2 i 1 du ( ) S N L y y = − = −  với L là hệ số ý nghĩa Ta có: 2 duS = 0 . Tiêu chuẩn Fisher: 2 du 2 th S F S = = 0 Tra bảng phân vị phân bố Fisher với p = 0,05; f1 = N-L = 3; f2 = m – 1 = 2 thấy rằng F < F0,05(3,2) = 19,2 Mô hình quy hoạch cấp 1 không phù hợp với thực nghiệm nên ta tiếp tục làm thêm các thí nghiệm theo ma trận kế hoạch thực nghiệm cấp 2. Phương pháp quy hoạch cấp 2 đã xây dựng kế hoạch thí nghiệm và xử lý số liệu dựa trên một số tiêu chí giống quy hoạch cấp 1, nhưng là mô hình hồi quy dạng đa thức bậc 2 đầy đủ mô tả sự phụ thuộc của hàm y vào các thông số ảnh hưởng x1, x2, x12. Phương trình hồi quy: �̂� = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 + b11x12 + b22x22. N x0 x1 x2 x12 ythực tế ylí thuyết (ytt – ylt)2 1 +1 -1 -1 +1 33 33 0 2 +1 +1 -1 -1 43 43 0 3 +1 -1 +1 -1 36 36 0 4 +1 +1 +1 +1 0 0 0 25 Với các hệ số b được tính bằng công thức sau: 2 N k N N 2 o 1 2 3i ji i j ji i i=1 j=1 i=1 i=1 N k N N 2 2 54 6jl ji li i jj ji i ji i i i=1 j=1 i=1 i=1 ; b = a y - a x y b = a x y (j = 1÷k) b = a x x y (l j; l,j=1÷k); b = a x y + a x y - a y        Do phương án thực hiện ở đây là phương án quay bậc 2 với 2 biến (k=2), nên ứng với đó là các giá trị a. Bảng 3.2. Các giá trị hằng số a trong phương trình tính các hệ số hồi quy k a1 a2 a3 a4 a5 a6 a7 2 0,2 0,1 0,125 0,25 0,1251 0,0187 0,1438 Bảng 3.3. Ma trận quy hoạch thực nghiệm kế hoạch tâm bậc 2 xoay N x0 x1 x2 x1x2 x12 x22 y 1 +1 -1 -1 +1 +1 +1 33 2 +1 +1 -1 -1 +1 +1 43 3 +1 -1 +1 -1 +1 +1 36 4 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0 5 +1 -1,414 0 0 +2 0 20 6 +1 +1,414 0 0 +2 0 0 7 +1 0 -1,414 0 0 +2 54 8 +1 0 +1,414 0 0 +2 50 9 +1 0 0 0 0 0 60 10 +1 0 0 0 0 0 56 11 +1 0 0 0 0 0 58 12 +1 0 0 0 0 0 58 13 +1 0 0 0 0 0 58 26 Từ các dữ kiện thực nghiệm trên suy ra các giá trị b như sau. b0 b1 b2 b12 b11 b22 58 -6,785 -5,707 -11,5 -24,758 -3,742 Phương sai tái hiện được tính theo kết quả của các thí nghiệm ở tâm bằng công thức on o o 2 u 2 u=1 th o (y - y ) s = n - 1  Trong đó : * no là số thí nghiệm song song ở tâm phương án (no = 5 trong nghiên cứu này). * o uy là giá trị hiệu suất ở thí nghiệm thứ u ở tâm phương án. * oy là giá trị trung bình hiệu suất trong no thí nghiệm ở tâm. Từ đó ta tính được 2 ths = 2,0 . Phương sai các hệ số hồi quy được tính theo các công thức bên dưới: o j lj jj 7 2 2 2 2 2 2 2 2 y y y y1 3 4b b b bs = a s ; s = a s ; s = a s ; s = a s Với sy2 = 𝑆𝑡ℎ 2 𝑁 = 2,0 13 = 0,15. Do đó ta có: 2 12 22o 1 11 2 2 2 2 2 2 b b b b b bs = 0,03; s = 0,01875; s =0,01875;s = 0,0375; s = 0,02157;s =0,02157. Kiểm định các hệ số hồi quy theo tiêu chuẩn Student: j j j b b t = s t0 t1 t2 t12 t11 t22 334,86 49,55 41,68 59,39 168,57 25,48 So sánh các giá trị tj với giá trị chuẩn số Student (mức ý nghĩa p = 0,05; f = n0-1 = 4) thì giá trị tj > t0,05(4) = 2,78. Do đó các hệ số b đều có ý nghĩa thống kê, phương trình hồi quy thu được có dạng: 2 2 1 2 12 1 258 6,785 5,707 11,5 24,758 3,742 .= − − − − −y x x x x x Từ mô hình bậc nhất với độ tin cậy 95%, phương trình hồi quy y =28 – 6,5x1 -10x2 - 11,5x12 Mô hình quy hoạch cấp 1 không phù hợp với thực nghiệm 27 Đối với mô hình bậc 2 với độ tin cậy 95%, phương trình hồi quy được thiết lập bởi phần mềm Modde 5.0. 13 thí nghiệm ngẫu nhiên được chọn để giảm đi sự ảnh hưởng của các yếu tố không thể kiểm soát. Trong đó, 5 thí nghiệm tại mức không được dùng để ước tính lỗi thử nghiệm. Các hệ số thống kê được trình bày trong bảng 3.4 Kết quả ANOVA mô hình bậc 2 của hiệu suất được liệt kê trong bảng 3.5 Bảng 3.4. Đánh giá thông kê các hệ số Phương trình hồi quy được xây dựng như sau : 2 2 1 2 12 1 258 6,785 5,707 11,5 24,758 3,742 .= − − − − −y x x x x x (*). Từ đó cho thấy sự tương tác giữa tỉ lệ mol và thời gian phản ứng không ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp. Các hệ số bậc một và bậc hai mang giá trị âm nghĩa là việc tăng tỉ lệ mol hoặc thời gian phản ứng có thể dẫn đến việc giảm hiệu suất phản ứng. Yếu tố tỉ lệ mol có tác động lên phương trình nhiều hơn yếu tố thời gian phản ứng. Giá trị 0,969 của hệ số tương quan R2 cho thấy có thể giải thích bằng mô hình này. Hệ số tương quan adjusted R2 bằng 0,947 cho thấy tương quan tốt giữa thực nghiệm và giá trị dự đoán. Chính vì thế mô hình này phù hợp để dự đoán hiệu suất phản ứng. Độ chính xác và khả năng tin cậy được xác nhận bằng RSD (hệ số biến thiên). Giá trị RSD càng lớn cho thấy mức độ biến động, độ phân tán của lượng biến càng lớn và ngược lại. Tại lần khảo sát này giá trị RSD thu được là tư