MỤC LỤC
Nội dung Trang
Lời cảm ơn . iii
Tóm tắt. iv
Summary . vi
Mục lục . vii
Danh sách các chữ viết tắt . x
Danh sách các bảng . xi
Danh sách các hình . xii
1. MỞ ĐẦU . 1
1.1. Đặt vấn đề . 1
1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu . 3
1.2.1. Mục đích . 3
1.2.2. Nội dung . 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía . 4
2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển . 4
2.1.2. Phân loại học . 4
2.1.3. Phân bố . 5
2.1.4. Đặc điểm thực vật học . 5
2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía . 5
2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển . 6
2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía . 8
2.2. Các loại bệnh hại trên mía . 9
2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc . 12
2.3.1. Tác nhân gây bệnh . 12
2.3.2. Triệu chứng . 13
2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh . 14
9
2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh . 15
2.4. Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Lxx . 16
2.4.1. Phương pháp chẩn đoán truyền thống . 16
2.4.2. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi . 16
2.4.3. Phương pháp nhuộm STM . 16
2.4.4. Phương pháp huyết thanh học . 17
2.4.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử . 18
2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc . 19
2.5.1. Trên thế giới . 19
2.5.2. Trong nước . 20
3. VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP . 21
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu . 21
3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm . 21
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm . 21
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm . 21
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ . 22
3.3. Phương pháp nghiên cứu . 22
3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu . 22
3.3.2. Phương pháp nhuộm STM . 24
3.3.3. Phương pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của
cây mía bị bệnh . 24
3.3.4. Phương pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng
định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được . 24
3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn . 24
3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate . 26
3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh
vật . 26
3.4. Bố trí thí nghiệm . 27
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 29
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng
của cây mía bị bệnh . 29
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ
cây bị bệnh sau khi chủng . 34
4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx . 38
4.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn
Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được . 41
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 45
5.1. Kết luận . 45
5.2. Đề nghị . 45
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 47
Tài liệu tham khảo Tiếng Việt . 47
Tài liệu tham khảo Tiếng Anh . 48
Tài liệu tham khảo Internet . 51
7. PHỤ LỤC . 52
Phụ lục 1: Môi trường SC . 52
Phụ lục 2: Môi trường MSC . 52
Phụ lục 3: Môi trường lỏng S8. 53
Phụ lục 4: Môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth . 53
Phụ lục 5: Môi trường Starch . 53
Phụ Lục 6: Bảng sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx . 54
68 trang |
Chia sẻ: leddyking34 | Lượt xem: 1852 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
thích: Có 4 mesosome rõ ràng (3 trong tế bào dài và 1 trong tế bào ngắn).
Đường kính của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli đo được là 195 - 220 nm, chiều
dài của hai tế bào gắn với nhau là 2610 nm. Tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli không
xuyên qua màng lọc 0,22 m nhưng có thể xuyên qua màng lọc 0,4 m. Các vi khuẩn
hình que này có thể phồng ra ở một đầu làm cho chúng có dạng hình chùy.
27
trong điều kiện thiếu ẩm độ, bị thối ở đỉnh và mép lá. Hệ thống rễ của cây bị bệnh
phát triển kém hơn so với cây khỏe mạnh bình thường.
Bệnh gây ra làm cho các bó mạch ở phía dưới đốt mía bị đổi màu, nhưng triệu
chứng này thường chỉ xuất hiện trong thời gian rất ngắn. Khi chẻ dọc thân mía của
cây bị bệnh có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn và sự đổi
màu này không kéo dài khắp lóng mía như triệu chứng của các bệnh khác (Davis và
Bailey, 2000) (Hình 2.5). Ở một số giống, cây mía non cũng có sự đổi màu từ vàng
đến nâu đỏ của tế bào mạch dẫn ngay dưới mô phân sinh ngọn; triệu chứng có thể
có là làm cho 1 phần thân bị chuyển thành màu hồng ngay tại các đỉnh sinh trưởng
của chồi non hay hóa đỏ cam tại các bó mạch ở giữa đốt của những thân mía đã
trưởng thành (Brumbley và ctv., 2006).
2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh
Vi khuẩn Lxx kí sinh chuyên tính trong cây mía và không có môi giới lan
truyền bệnh; bệnh lây nhiễm trong cánh đồng do sử dụng hom giống đã bị nhiễm
bệnh. Bởi vì triệu chứng của bệnh không thể quan sát được bằng mắt nên vi khuẩn
có thể lan truyền từ vùng này sang vùng khác một cách "âm thầm" mà người nông
dân vẫn không biết cánh đồng mía của họ đang bị bệnh. Thậm chí, khi thấy ruộng
Hình 2.5. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc
(Nguồn: www.pakissan.com/english/allabout/crop/sugarcane.shtml)
a) Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; b) Đốt thân ngắn; c) Vết đổi màu trong thân cây mía bệnh
28
mía có dấu hiệu chậm phát triển, người ta thường quy cho các nguyên nhân khác
như: điều kiện canh tác nghèo nàn, thiếu độ ẩm hoặc chất dinh dưỡng.
Vi khuẩn Lxx phát tán, lây lan trong đồng ruộng một cách nhanh chóng thông
qua các dụng cụ thu hoạch cơ giới hay thủ công, trong đó sự lây nhiễm do máy móc
khi thu hoạch cơ giới rất đáng kể. Các loài động vật ăn mía cũng có thể là tác nhân
truyền bệnh khi chúng gặm một thân mía bị bệnh sau đó lại tiếp tục gặm sang một
thân mía khỏe khác. Ngoài ra, có một vài báo cáo mới đây cho rằng vi khuẩn Lxx
vẫn tiếp tục sống sót trong đất sau khi thu hoạch và tái nhiễm vào rễ cây khỏe mạnh
thông qua vết thương; tuy nhiên, quy mô của sự lây nhiễm này vẫn chưa được biết
(Comstock và Lentini, 2005; Davis và Bailey, 2000).
Theo Bailey và Tough (1992); Damann (1992); Comstock và ctv. (1996), tùy
thuộc vào tính mẫn cảm của từng giống mía đối với bệnh mà mức độ lây nhiễm
cũng như mức thiệt hại khác nhau trong các cánh đồng. Thêm vào đó, các yếu tố bất
lợi về nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, ngập lụt hay khô hạn cũng góp phần làm gia tăng
tỉ lệ bệnh. Bệnh gây thiệt hại nặng nề hơn trong các vụ mía gốc, mía tái sinh từ gốc
sót lại cũng dễ dàng lây bệnh sang mía tơ (Westphal và Mirkov, 2003).
2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh
Bệnh cằn mía gốc được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến
sản lượng mía trên thế giới. Vi khuẩn Lxx chủ yếu làm cản trở sự vận chuyển nước
và chất dinh dưỡng của cây (Kao và Damann, 1978; 1980). Bởi vì cây mía có thể
phát triển thành 4 - 5 vụ mía gốc từ một vụ mía tơ nên phải thận trọng, tránh sự xâm
nhiễm của loại vi khuẩn này lên toàn bộ cánh đồng (Westphal và Mirkov, 2003).
Để tiêu diệt hay ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh nên ngâm mía trong
nước nóng (50 C) trong hai giờ trước khi đem trồng. Các dụng cụ thu hoạch phải
được rửa sạch và sát trùng bằng hóa chất trước khi thu hoạch sang ruộng khác. Các
chất diệt trùng hóa học có thể sử dụng đối với dụng cụ cắt mía bao gồm: lysol,
dettol, ethanol, mirrol and roccal. Nên cho hóa chất tiếp xúc với bề mặt cắt ít nhất 5
phút để đảm bảo chắc chắn vô trùng. Ngoài ra, sử dụng giống kháng cũng là một
biện pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh; mặc dù không có giống nào được tìm thấy là
29
miễn dịch hoàn toàn đối với sự xâm nhiễm của Lxx nhưng CP 78-1628 và CP 80-
1743 là 2 giống đã được chứng minh là có khả năng kháng đối với bệnh cằn mía
gốc (Comstock và Lentini, 2005).
2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx
2.4.1. Phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống
Phương pháp chẩn đoán truyền thống dựa vào các triệu chứng biểu hiện bên
ngoài như sự cằn cỗi của cây, sự chuyển thành màu hồng tại mô mạch ở các mắt của
cây mía trưởng thành và màu hồng nhạt ở các lóng cây non (Hughes và Steindl,
1955). Tuy nhiên cường độ biểu hiện có sự khác nhau rất lớn giữa các giống cây
cũng như giữa các cây trong cùng một giống. Thêm vào đó, triệu chứng biểu hiện
của bệnh không khác gì mấy so với bệnh do các tác nhân thông thường gây ra trên
mía như côn trùng, các nhân tố môi trường và sự hủy hoại cơ học (Gillaspie và
Teakle, 1989) (Trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Do đó, bệnh cằn mía gốc
thường được xác định thông qua các kĩ thuật phòng thí nghiệm.
2.4.2. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi
Kiểm tra trực tiếp dịch chiết nước mía bằng kính hiển vi đối pha hoặc kính
hiển vi nền tối ở độ phóng đại X-1000 để phát hiện vi khuẩn nhưng phương pháp
này có độ nhạy thấp (khoảng 1 x 106 tế bào/ml) và chậm khi chọn lọc một số lượng
mẫu lớn (Taylor và ctv., 2003). Việc phát hiện vi khuẩn dưới kính hiển vi đặc biệt
khó khăn đối với cây bị nhiễm Lxx ở giai đoạn đầu, sau khi tưới hoặc trong mùa
mưa; bởi vào các thời điểm này, nồng độ vi khuẩn Lxx ở trong dịch chiết nước mía
rất thấp (Davis và Bailey, 2000). Do đó, hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc
rất nhiều vào kinh nghiệm của người quan sát.
2.4.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method )
Sự kí sinh của các tế bào vi khuẩn Lxx làm ngăn cản sự hấp thu nước và chất
dinh dưỡng của cây; sự tạo gel và chất gôm trong bó mạch mộc là dấu hiệu sinh lý
quan trọng liên quan đến sự giảm sản lượng ở cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Giglioti
và ctv., 1999). Dựa vào các đặc điểm trên, phương pháp nhuộm STM đã được phát
triển nhằm chẩn đoán, phát hiện cây mía bị bệnh.
30
2.4.4. Phƣơng pháp huyết thanh học
Kĩ thuật huyết thanh bao gồm nhuộm kháng thể huỳnh quang (fluorescent-
antibody staining - FAT), kĩ thuật miễn dịch dot blot (dot blot immunoassay) và kĩ
thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay). Gần đây, người ta đã cải tiến
kĩ thuật miễn dịch dot blot thành kĩ thuật phân tích miễn dịch học enzyme liên kết
với mô mẫu (Tissue Blot Immunoassay - TBIA) để chẩn đoán bệnh và đánh giá
mức độ nghiêm trọng của bệnh. Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể phát hiện Lxx
trong một số lượng lớn mẫu mía một cách nhanh chóng; ngoài ra, kĩ thuật này còn
được sử dụng để chọn lọc dòng kháng bệnh và xác định mức độ tác động của bệnh
đối với cây giống (Comstock và Lentini, 2005).
Nhuộm kháng thể huỳnh quang: Harris và Gillaspie (1978) là những người
đầu tiên đưa ra phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (FAT) sử dụng kháng
huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Brlansky và ctv.
(1982) đã phát hiện Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc
hiệu để gắn kết Lxx với tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) (Trích dẫn
bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). Năm 1985, Davis phát triển kỹ thuật đếm trực tiếp
kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF) cho độ nhạy gấp 100 lần FAT.
Màng lọc được kiểm tra có vi khuẩn gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi
huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần (Trích dẫn bởi Westphal and Mirkov, 2003).
Kĩ thuật miễn dịch dot blot: dịch chiết nước mía (50 μl) được trộn với 10 mM
PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 (v:v). 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS được lọc qua
màng NCM 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở
80°C trong 60 phút trước khi đem nhuộm bằng phương pháp EIA/TBIA. Các phản
ứng dương tính được nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.
Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu: vi khuẩn được tách ra
khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm, được dính lên màng nitrocellulose (NCM) và được
nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dương
tính đối với vi khuẩn Lxx khi đem phân tích miễn dịch học.
31
Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay (EB – ELISA):
phương pháp EB - ELISA do Croft và ctv. đưa ra năm 1994 để chẩn đoán bệnh cằn
mía gốc. Dịch chiết nước mía được ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000
vòng trong 5 phút. Dịch nổi được loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550
μl dịch đệm. Mẫu phân tích được cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở
35°C. Sau khi ủ, mẫu được đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa không kem và kháng thể.
Phương pháp EB - EIA có thể phát hiện vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường với mật
độ thấp hơn 105 tế bào/ml và 5.105 tế bào/ml trong dịch chiết.
Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT – EIA): Leaman và ctv. (1991) sử
dụng phương pháp LT - EIA để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc và so sánh phương
pháp này với phương pháp FADCF. Phương pháp LT - EIA phát hiện được Lxx ở
nồng độ 5.101 tế bào/ml dịch chiết và cho độ chính xác đến 98 %. FADCF có khả
năng phát hiện 5.101 tế bào/ml và với độ chính xác đến 100 %. Tuy nhiên, FADCF
không thể thực hiện nhiều mẫu cùng một lúc còn LT - EIA thích hợp cho việc kiểm
tra một số lượng mẫu lớn (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006).
Mặc dù những kĩ thuật này được chấp nhận vì đủ độ nhạy, tương đối rẻ tiền
và hiệu quả nhưng đòi hỏi người phân tích phải có kinh nghiệm, đặc biệt khi giải
thích các kết quả kiểm tra âm tính. Tất cả các kĩ thuật huyết thanh để phát hiện vi
khuẩn này đều dựa vào huyết thanh miễn dịch đa dòng chống lại tất cả các vi
khuẩn. Theo Davis và Dean (1984), giới hạn phát hiện là 104 tế bào/ml dịch chiết
có thể được cải thiện bằng cách dùng các kháng thể đơn dòng.
2.4.5. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử
Dưới kính hiển vi hay bằng phương pháp miễn dịch học ta có thể phát hiện
được Lxx vào cuối vụ mía lúc mà nồng độ vi khuẩn cao nhất trong cây (Pan và ctv.,
1998). Tuy nhiên, việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh trên mía có ý nghĩa đặc
biệt quan trọng trong các chương trình trao đổi giống để tránh sự lan truyền bệnh từ
vùng này sang vùng khác hay từ quốc gia này sang quốc gia khác (Taylor và ctv.,
2003). Gần đây, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và
phát hiện vi khuẩn Lxx ở cây mía đã đem lại các kết quả đáng tin cậy, có độ nhạy,
32
độ đặc hiệu cao trong giai đoạn sớm. Theo Taylor và ctv. (2003), phương pháp
chẩn đoán dựa vào kĩ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao hơn (104 tế bào/ml) so
với các phương pháp khác: phương pháp kiểm tra miễn dịch học (104 - 105 tế
bào/ml) (Gilaspie và Harris, 1979; Davis và Dean, 1994); quan sát vi khuẩn Lxx trên
nền kính hiển vi đối pha (106 tế bào/ml).
Chẩn đoán dựa vào việc sử dụng các probe DNA: Chung và ctv. (1994) đã sử
dụng probe DNA để làm tăng độ nhạy trong phát hiện vi khuẩn Lxx ở nồng độ 104
tế bào/ml. Tuy nhiên, kĩ thuật này dựa vào sự lai của mỗi mẫu vi khuẩn với các
probe DNA được đánh dấu, chậm và tốn kém nên không hiệu quả trong công tác
chẩn đoán bệnh (Trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003).
Kỹ thuật PCR: Pan và ctv. (1998); Taylor và ctv. (2003); Grisham và ctv. (2007)
đã thành công trong chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kĩ thuật PCR. Primer cho
các phản ứng này được thiết kế từ vùng ITS (intergenic transcribed spacer region)
giữa gen rRNA 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx.
2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc
2.5.1. Trên thế giới
Bệnh cằn mía gốc là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất tác động đến
năng suất và sản lượng mía trên thế giới. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế
giới đã đạt được một số thành công nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía
gốc. Năm 1945, Steind đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia
(trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Đến năm 1980, Davis và ctv. đã thành công khi
phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết nước mía trên môi trường nhân tạo. Năm 1998,
Pan và ctv. dùng kĩ thuật PCR để phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch khuẩn lạc nuôi
cấy và dịch chiết nước mía; cặp mồi Cxx được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA
dài 438 bp đặc hiệu cho tác nhân gây bệnh. Hoy và ctv. (1999) đã tiến hành so sánh
hiệu quả của các phương pháp khác nhau trong phát hiện dịch bệnh cằn mía gốc
trên cánh đồng. Năm 2002, Brumbley và ctv. đã chuyển gen và gây đột biến
Transposon thành công trên đối tượng vi khuẩn Lxx. Cặp mồi có độ nhạy và tính đặc
33
hiệu cao hơn cho phản ứng PCR phát hiện Lxx trong dịch chiết nước mía đã được phát
triển bởi Taylor và ctv. (2003).
Năm 2004, Monteiro-Vitorello và ctv. đã thành công trong quá trình nghiên
cứu trình tự genome của vi khuẩn Gram dương Lxx. Cũng trong năm này, viện khoa
học nông nghiệp Tây Nam Trung Quốc đã phát hiện được vi khuẩn Lxx ở Quảng
Tây bằng kỹ thuật PCR. Đến năm 2006, Young và ctv. đã chứng minh sự ổn định
về mặt di truyền của 105 quần thể Lxx được phân lập từ các vùng trồng mía có sự
phân bố địa lý khác nhau trên thế giới (Indonesia, Nhật Bản, Hoa Kỳ, Brazil, Mali,
Zimbabwe, Nam Phi và Réunion).
Gần đây nhất, vào tháng 4 năm 2007, Grisham và ctv. đã tuyên bố thành công
trong việc chẩn đoán sớm dịch bệnh cằn mía gốc trên cánh đồng. Tác giả đã tiến
hành phản ứng Real – Time PCR để phát hiện vi khuẩn Lxx từ lá của cây mía còn
non. Đây là một nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong chiến lược đề phòng và
kiểm soát dịch bệnh từ giai đoạn sớm nhằm giảm thiệt hại do bệnh gây ra.
2.5.2. Trong nƣớc
Bệnh cằn mía gốc đã được phát hiện ở nước ta từ rất lâu và gây thiệt hại
nghiêm trọng đối với nhiều vùng sản xuất (Hà Đình Tuấn, 2004). Tuy nhiên, loại
bệnh này vẫn chưa thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học. Các
nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trong nước chỉ tập trung vào khía cạnh điều tra,
khảo sát, đánh giá tỉ lệ bệnh cũng như tác hại của bệnh trên cánh đồng. Cho đến
nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về tác nhân gây bệnh cằn mía gốc.
34
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 năm 2007 đến ngày 30 tháng 8 năm
2007 tại phòng Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông
Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm
3.2.1. Vật liệu thí nghiệm
Mẫu mía bệnh làm vật liệu thí nghiệm thuộc các giống C90-127, VN84-4137,
DLM24, R570, VN85-1427 được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến
Cát, Bình Dương. Cây mía được chọn là cây có các biểu hiện bên ngoài của bệnh
cằn mía gốc (cằn cỗi, thấp, đường kính nhỏ, lóng ngắn, có vết đổi màu trong thân).
Cây con nuôi cấy mô trong thí nghiệm chủng được thu thập tại Trung tâm
nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương và trồng tại nhà lưới Bộ môn Bảo
vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm
Hóa chất trong dung dịch thuốc nhuộm Safranin 2,5 ‰: Safranin (BDH
Chemicals, Anh), cồn 96 .
Hóa chất trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lxx: cornmeal agar (Việt Nam),
Bactoagar (BioRad, Mỹ), Bactopeptone (Himedia, Ấn Độ), bovine hemine chloride
(Nacalai Tesque, Nhật), MgSO4. 7H2O (Merk, Đức), K2HPO4 (Merk, Đức),
KH2PO4 (Merk, Đức), glucose (Merk, Đức), cystein (Nacalai Tesque, Nhật), bovine
serum albumine (Nacalai Tesque, Nhật), nalidixic acid (Nacalai Tesquie, Nhật),
soytone (Nacalai Tesquie, Nhật), hemine chloride (Sigma, Đức). Ngoài ra, HCl
(Merk, Đức) và NaOH (Merk, Đức) được sử dụng để điều chỉnh pH môi trường về
giá trị thích hợp cho sự sống của vi khuẩn.
35
Hóa chất trong các thử nghiệm sinh hóa khẳng định vi khuẩn Lxx: dung dịch
KOH 3 % (Merk, Đức), proteone peptone (Oxoid, Anh), NaCl (Merk, Đức), beef
extract (Himedia, Ấn Độ), phenol red (Merk, Đức), manitol (Merk, Đức), sorbitol
(Merk, Đức), H2O2 30 % (Trung Quốc), dung dịch thuốc thử KI (Trung Quốc),
peptone (Himedia, Ấn Độ), starch (Việt Nam), agar (Việt Nam), casein (Oxoid,
Anh), ferric citrate (Trung Quốc).
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong toàn bộ quá trình thí nghiệm bao
gồm: kính hiển vi quang học, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow),
máy đo pH, tủ định ôn, màng lọc vô trùng (0,2 m và 0,45 m), màng parafilm, cối,
chày, dao, hộp nhựa, bercher, kim tiêm, túi nilon, ống nghiệm, ống Durham, bình
tam giác, đĩa petri, micropipet và đầu típ các loại.
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu
Bệnh cằn mía gốc không tạo ra các triệu chứng biểu hiện rõ rệt và đặc trưng
nên rất khó phát hiện cây bị bệnh (Pan và ctv., 1998; Brumbley và ctv., 2006;
Taylor và ctv., 2003). Do đó, cần phải rất thận trọng trong quá trình thu thập mẫu để
chọn đúng cây bị bệnh vì đây là khâu quan trọng đầu tiên quyết định thành công của
tất cả các thí nghiệm.
Chỉ tiêu quan sát
Cây sinh trưởng và phát triển chậm, có đường kính nhỏ, lóng ngắn hơn so với
các cây xung quanh. Tuy nhiên, nếu hầu hết cây trong ruộng mía đều bị bệnh thì sẽ
không có sự khác biệt (Comstock và Lentini, 2005). Do đó, chúng tôi tiến hành so
sánh với cây trong một ruộng khác có các điều kiện canh tác tương tự (cùng giống,
cùng thời gian trồng, cùng lượng nước tưới và phân bón). Ngoài ra, cây bị bệnh còn
có sự đổi màu của các bó mạch ở phía dưới mắt mía (khi dùng dao chặt chéo thân
qua phần mắt mía có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn)
(Comstock và Lentini, 2005; Brumbley và ctv., 2006; Pan và ctv., 1998).
36
37
3.3.2. Phƣơng pháp nhuộm STM
Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Safranin 2,5 ‰: hòa tan 2,5 g safranin
trong 100 ml cồn 96 . Sau đó, thêm nước cất vào dung dịch cho vừa đủ 1000 ml.
Quy trình nhuộm STM để phát hiện cây mía bị bệnh cằn mía gốc (hình 3.1):
nhổ cây mía, chặt sát gốc, nhúng vào dung dịch thuốc nhuộm safranin 2,5 ‰ và để
dưới trời nắng. Sau khoảng 30 phút, lấy cây mía ra; cây mía được lóc bỏ vỏ để lấy phần
ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm).
Cắt thân mía thành từng lát mỏng theo chiều ngang và quan sát màu của các bó
mạch dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40 - 100 lần. Tiến hành ghi nhận số liệu tỉ lệ bó
mạch đỏ và bó mạch vàng của thân mía đem nhuộm STM (trong đó, bó mạch đỏ là bó
mạch không bị nhiễm vi khuẩn; bó mạch vàng là bó mạch bị nhiễm vi khuẩn). Mức độ
nhiễm bệnh của cây có thể được đánh giá dựa vào tỉ lệ của các loại bó mạch. Theo đó,
cây mía được đánh giá là nhiễm nặng, nhiễm trung bình hay nhiễm nhẹ khi có tỉ lệ
mạch đỏ lần lượt chiếm < 70 %, 70 – 84,9 % và 85 – 99,9 %. Ngược lại, cây mía
không bị bệnh cằn mía gốc khi không có sự hiện hiện của mạch vàng, tức tỉ lệ mạch đỏ
là 100 % (Hà Đình Tuấn, 2004).
3.3.3. Phƣơng pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây
mía bị bệnh
Tiến hành chủng bệnh cho cây nuôi cấy mô ba tháng tuổi bằng dịch chiết của
cây mía bị bệnh cằn mía gốc (hình 3.2). Quy trình chủng bệnh được tiến hành như
sau: cắt ngang ngọn của cây mía nuôi cấy mô ở ngay phía trên phần mô phân sinh
ngọn, dùng kim tiêm bơm 1ml dịch chiết từ cây mía bị nhiễm bệnh lên bề mặt mới
cắt. Sau đó, bọc túi nilon vào phần ngọn mới cắt và cột lại để tránh sự tấn công của
côn trùng phá hoại (Young và Brumbley, 2004).
3.3.4. Phƣơng pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bƣớc đầu khẳng định vi
khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc
3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn
Dùng que cấy lấy dịch vi khuẩn và khuấy đều trong giọt KOH trên miếng lam.
Sau đó, nhấc nhẹ que cấy, nếu xuất hiện dịch nhớt kéo theo que cấy (dài 2 – 3 cm) thì
38
39
vi khuẩn cần xác định là vi khuẩn Gram (-). Ngược lại, ở vi khuẩn Gram (+) không có
dịch nhớt (Malcolm và Charles, 1997).
3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate
Tiến hành kiểm tra khả năng lên men của các dòng vi khuẩn phân lập được với 2
loại nguồn carbon là manitol và sorbitol. Cách thực hiện như sau: hút 20 l dịch vi
khuẩn cho vào các ống nghiệm chứa môi trường Phenol Red Carbohydate Broth (phụ
lục 4; trong đó, carbohydrate là manitol hoặc sorbitol).
Chỉ tiêu quan sát: sau khi ủ ở 28 C trong 48 h, khả năng lên men của vi khuẩn
được đánh giá dựa vào khả năng sinh acid và khả năng sinh hơi. Vi khuẩn có khả
năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường chuyển thành màu vàng;
ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi
trường không đổi màu. Vi khuẩn có khả năng sinh hơi khi có bọt khí xuất hiện trong
ống Durham và ngược lại. Nếu vi sinh vật lên men chậm, sự đổi màu thường không
rõ ràng và không có bọt khí xuất hiện trong ống Durham, cần phải so sánh với ống
đối chứng không cấy vi sinh vật hoặc thực hiện lại thử nghiệm để thu được kết quả
chính xác (Trần Linh Thước, 2003).
3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật
Thử nghiệm Catalase: tất cả các vi sinh vật hiếu khí chứa chuỗi chuyền điện
tử cytochrome đều có enzyme catalase, đây là enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi
các tổn thương bởi dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử thông qua quá trình thủy
phân H2O2 thành H2O và O2. Thử nghiệm được tiến hành bằng cách nhỏ trực tiếp 1
ml dung dịch H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt môi trường thạch
SC; phản ứng được ghi nhận thông qua hiện tượng sủi bọt khí. Thử nghiệm Catalase
được ghi nhận dương tính khi có hiện tượng sủi bọt khí; ngược lại, thử nghiệm âm
tính khi không có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2003).
Thử nghiệm amylase: trong thí nghiệm này, môi trường Starch Agar (phụ lục
5) và dung dịch thuốc thử KI được sử dụng để xác định hoạt động phân giải tinh bột
của enzyme amylase ngoại bào. Phản ứng được thực hiện bằng cách chuyển 20 l
dịch vi khuẩn phân lập được lên đĩa môi trường Starch Agar. Sau khi ủ ở 28 C
40
trong 24 h, tiến hành kiểm tra lượng tinh bột trên đĩa môi trường bằng dung dịch KI.
Phản ứng amylase được ghi nhận là dương tính khi có vòng phân giải tinh bột xung
quanh vùng phát triển của vi khuẩn. Ngược lại, phản ứng âm tính khi không có
vòng phân giải tinh bột quanh vùng phát triển của vi khuẩn (Schaad, 1994).
Thử nghiệm protease: nhằm xác định khả năng phân giải protein bởi enzyme
protease ngoại bào của vi sinh vật. Thử nghiệm này được thực hiện trên môi trường
SC có bổ sung 1% (w/v) casein và 0,05 % (w/v) ferric citrate (trong đó, nguồn
protein được thử nghiệm là casein, đây là loại protein chính có trong sữa). Phản ứng
được ghi nhận là dương tính khi có vòng phân giải trong suốt xung quanh vùng phát
triển của vi khuẩn; ngược lại là phản ứng âm tính (Schaad, 1994).
3.4. Bố trí thí nghiệm
Luận văn bao gồm bốn thí nghiệm như sau:
Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía
bị bệnh
Tiến hành nhuộm STM đối với 20 cây mía có biểu hiện của bệnh cằn mía gốc
được thu thập ngẫu nhiên ngoài đồng ruộng. Sau đó, quan sát dưới kính hiển vi và
thống kê tỉ lệ bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch đỏ) và bó mạch bị nhiễm vi
khuẩn (bó mạch vàng) trong mỗi lóng; từ đó suy ra vị trí lóng có mật độ vi khuẩn cao
nhất (tức là lóng có tỉ lệ bó mạch bị nhiễm vi khuẩn cao nhất).
Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh
sau khi chủng
Từ kết quả của thí nghiệm 1, tiến hành chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm cao
nhất và thu nhận dịch chiết từ lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất. Dịch chiết này được
lọc qua màng lọc 0,45 m và chủng bệnh vào các cây nuôi cấy mô 3 tháng tuổi. Sau
các khoảng thời gian 15, 30, 45, 60 ngày, khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc
mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng bằng phương pháp STM.
Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx
Từ kết quả của thí nghiệm 1, tiến hành chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm cao
nhất và thu nhận dịch chiết từ lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất. Sau đó, lọc dịch
41
chiết qua màng lọc 0,45 m và tiến hành cấy trãi dịch chiết trên môi trường thạch SC
và MSC. Sau 28 – 42 ngày ủ ở 28°C, các khuẩn lạc có đặc điểm giống như mô tả
khuẩn lạc Lxx (đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố)
(Davis, 1980) được cấy chuyền sang các đĩa môi trường khác. Tăng sinh các khuẩn
lạc thuần sau 2 lần cấy chuyền trong môi trường lỏng S8 để thu sinh khối. Thành
phần các môi trường nuôi cấy được trình bày trong bảng phụ lục 1, 2, 3.
Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các
dòng vi khuẩn phân lập được
Dịch vi khuẩn nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng S8 (thí nghiệm 3) được
sử dụng trong các thử nghiệm sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx. Trong thí nghiệm này,
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- CHU THI BICH PHUONG.pdf