Khóa luận Nghiên cứu về Cây vối (Cleistocalyx operculatus Roxb)

IC=8 mg/ml) vµ S.aureus (MIC=64 mg/ml). Trong khi ®ã, ho¹t tÝnh chèng ung th­ cña nã l¹i dùa trªn sù ng¨n c¶n qu¸ tr×nh sao m· cña virus HIV-1 ë trªn tÕ bµo H9 (IC50=21,8 mg/ml; EC50=1,7 mg/ml). Axit oleanolic(2) C¸c saponin cã chøa khung oleanan nh­ Gleditsia saponin C t¸ch ra tõ loµi Gleditsia japonica vµ Gymnocladus G t¸ch ra tõ loµi Gumnocladus chinensis còng thÓ hiÖn kh¶ n¨ng chèng HIV in vitro kh¸ m¹nh. Gleditsia saponin C Gymnocladus saponin G Trong khi ®ã, Glycyrrhizin, mét saponin chÝnh t¸ch ra tõ c©y Cam th¶o nh·n (Glycyrrhiza glabra) l¹i øc chÕ sù ph¸t triÓn cña mét sè loµi virus bao gåm c¶ virus HIV-1 in vitro. C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu trªn bÖnh nh©n AIDS ë NhËt cho thÊy Glycyrhizin lµm chËm qu¸ tr×nh ph¸t triÓn cña virus HIV. RÊt cã thÓ nã ®· k×m h·m qu¸ tr×nh sao chÐp cña virus HIV in vitro. Glycyrrhizin Theo nh÷ng nghiªn cøu míi nhÊt th× 3 tritecpen míi khung oleanan lµ: (23Z)-coumaroyl hedreagenin, (23E)- coumaroyl hedreagenin vµ (3Z)- coumaroyl hedreagenin, t¸ch ra tõ c©y Rau m­¬ng l«ng (Ludwigia octovalis), cã ho¹t tÝnh g©y ®éc tÕ bµo rÊt tèt trªn 2 dßng tÕ bµo ung th­ KB vµ HT29 víi gi¸ trÞ IC50trong kho¶ng 1,2-3,6 mM. Ho¹t tÝnh cña 3 tritecpen nµy cã thÓ so s¸nh víi Etoposide (IC50=1,2-2,3 mM), mét lo¹i thuèc chèng ung th­. 1.4.2 C¸c hîp chÊt kh¸c C¸c dÉn xuÊt tritecpen khung ursan: axit 2a,19a-®ihi®roxy-3-oxo-12-ursen-28-oic, axit ursolic, axit maslinic t¸ch ra t­ c©y Geum japonicum ®Òu thÓ hiÖn ho¹t tÝnh øc chÕ enzym proteaza cña virus HIV-1 kh¸ tèt. Gi¸ trÞ nång ®é øc chÕ 50% tÕ bµo HIV cña axit ursolic lµ 18,6 mg/ml. 2a,19a-Dihi®roxy-3-oxo-12-ursen-28-oic Axit maslinic Axit ursolic Bªn c¹nh ®ã, 3b-O-trans-p-coumaroyl maslinic vµ 3b-O-cis-p- coumaroyl maslinic, c¸c dÉn xuÊt cña axit maslinic ph©n lËp tõ loµi Licania heteromorpha, l¹i thÓ hiÖn kh¶ n¨ng kh¸ng mét sè lo¹i vi khuÈn Gram (+) vµ nÊm men. 1.5 Một số đặc điểm của flavonoit liên quan đến đối tượng nghiên cứu của đề tài 1.5.1 Sự phân bố flavonoit trong thực vật Trong thực vật bậc thấp flavonoit ít được gặp. Trong ngành rêu chỉ phát hiện được rất ít chất. Trong dương xỉ số lượng flavonoit ít nhưng đều có mặt các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, chacon, dihydrochacon. Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavonoit cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của ngành hạt trần có khác thực vật bậc thấp và ngành hạt kín ở chỗ sự hiên diện của nhiều dẫn chất biflavonoit. Flavonoit tập trung chủ yếu vào trong ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm. Có rất nhiều họ chứa flavonoit và đủ các loại flavonoit. Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ; ví dụ, họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài , 1000 chi, có rất nhiều dẫn chất thuộc các nhóm khác nhau. Tuy nhiên một số chi có nét đặc trưng riêng của nó; ví dụ, các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặp các dẫn chất chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chất flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm). Họ Fabaceae thì hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoit. Họ Rutaceae thường gặp các flavon và flavonol có nhiều nhóm methoxy. Họ Theaceae hay gặp các flavan-3-ol. Họ Raunculaceae và Paeoniaceate hay gặp các dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid. Họ Rosaceae chi Rurbus và Prunus ở trong quả hay gặp cá anthocyanin có mạch đường phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và flavon sulfat. Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy có flavonoit : Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Idrilaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Orchidaceae, Poaceae. Động vật không tổng hợp được flavonoit nhưng trong một loài bướm khi phân tích thấy có flavonoit là do chúng lấy từ thức ăn thực vật. Hàm lượng và cả thành phần flavonoit trong cây phụ thuộc vào nơi mọc. Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi thiếu ánh sáng. 1.5.2 Phản ứng định tính Các dẫn xuất flavonon có màu vàng rất nhạt có khi không màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hóa), flavonol màu vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm đến đỏ cam. Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanol, leuco-anthocyanidin, flavan-3-ol do không có nối đôi liên hợp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo độ PH của môi trường. Tuy nhiên khi các flavonoit ở trong bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác. Độ tan không giống nhau, thường flavonoit glycozit và flavonoit sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn nước. Các dẫn chất flavonoit có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng. * Một số phản ứng định tính - Tác dụng với FeCl3. Tùy theo nhóm của flavonoit là tùy theo số lượng vị trí nhóm OH trong phần tử mà cho màu lục, xanh, nâu. - Tác dụng với kiềm. Nếu hơ một tổ chức thực vật như cánh hoa, nhát cắt của gỗ hoặc tờ giấy thấm cỡ nhỏ, dịch chiết trên miệng lọ amoniac thì có màu vàng tăng lên tùy theo nồng độ flavonoit và tùy theo nhóm flavonoit. Flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dương. Chalcon và auron có thể cho màu đỏ và da cam. Một số nhóm khác như flavan-3-ol, flavanon, isoflavan màu không thay đổi. Tuy nhiên nếu thực hiện trong ống nghiệm với dung dịch alkali thì một số dẫn chất flavan-3-ol lại cho màu xanh vì dễ bị oxi hóa, còn flavonon dễ bị isomer hóa thành chalcon nên nếu để một lúc lại cho màu vàng đậm đến đỏ. - Tác dụng với NaOH đậm đặc và đun nóng (phân hủy kiềm). Đun nóng flavonoit với dung dịch 30% KOH thì sẽ mở vòng C rồi dẫn đến tạo thành dẫn chất axit thơm và dẫn chất phenol. Tùy theo nhóm thế và vị trí thế vào vòng A và B mà có các dẫn chất axit thơm và phenol khác nhau. Có thể xác định các dẫn chất này bằng phương pháp sắc kí đối chiếu với chất mẫu, kết quả thu được dùng để góp phần biện luận cấu trúc. Ví dụ, khi phân hủy chất chrysin thì thu được phloroglucin, axit benzoic. - Tác dụng với H2SO4 đậm đặc. Axit sunfuric khi nhỏ lên các dẫn chất flavon, flavonol thì cho màu vàng đậm. Đối với chalcon và auron cho màu đỏ, đỏ thắm, đỏ tươi. Flavanon cho màu đỏ cam rồi đỏ thắm, có thể do chuyển flavonon thành chalcon. - Tác dụng với antimoin pentacholorid (Phản ứng Martini Bettolo). Dung dịch SbCl5 trong CCl4 cho màu từ đỏ đến tím với chalcon, vàng đến vàng cam với flavon. Dihydrochalcon thì mất màu nối đôi liên hiệp giữa nhóm carbonyl và vòng B nên không cho màu với SbCl5 hoặc H2SO4. - Phản ứng cyanidin (Phản ứng Shinoda hay Willstater). Đây là phản ứng khử thường được sử dụng để tìm sự có mặt của các dẫn xuất nhóm flavonoit. Dung dịch flavonoit trong etanol, thêm bột Mg rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc. Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thắm hoặc đỏ tươi với các dẫn xuất flavon, flavonol, flavanonol, flavonon. Màu sắc đôi khi có thể bị thay đổi tùy theo loại, số lượng, vị trí nhóm thế; ví dụ, các dẫn chất methoxy flavon (Tangeretin, Nobiletin) thì âm tính. Để phân biệt giữa flavonoit glycozit và aglycol của chúng, đem lắc dung dịch có màu với octanol, nếu màu ở lớp dưới lên hết ở lớp octanol, chất thử là aglycol, nếu lớp octanol không màu, chất thử là glycozit. Cũng cần lưu ý rằng các dẫn chất xanthon ví dụ mangierin (có trong lá xoài) cũng dương tính với thuốc thử cyanidin. - Tác dụng với chì acetat trung tính hoặc kiềm. Phản ứng thực hiện trên giấy thấm. Nhiều dẫn chất flavonoit tạo thành muối hoặc phức có màu khi nhỏ thêm dung dịch chì axetat trung tính hoặc kiềm. Màu phụ thuộc vào các dẫn chất flavonoit . Nếu tiến hành trong ống nghiệm, chì axetat kiềm cho tủa màu với hầu hết các flavonoit phenol còn chì axetat trung tính tạo tủa với những dẫn chất có nhóm o-dihydroxyphenol. - Phản ứng ghép đôi muối diazoni. Các dẫn chất flavonoit có nhóm OH ở vị trí 7 có thể phản ứng với muối diazoni để tạo thành chất màu azoic vàng cam đến đỏ. 1.5.3 Tác dụng sinh học của flavonoit Các dẫn chất của flavonoit có khả năng dập tắt các gốc tự do như •OH, ROO•. Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây ra biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa. Thí nghiệm cho thấy khả năng dập tắt của một số flavonoit theo thứ tự: Myricetin > quercetin > morin > diosmetin > naringenin > apigenin > catechin > 5,7 dihydroxyl-3’, 4’, 5’-trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon. Flavonoit tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa. Các flavonoit có 3, 5, 3’, 4’-hydroxy có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon , oxicarbonyl hoặc 3’, 4’-octo-dioxyphenol . Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị peroxyt hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng dẫn đến sự hủy hoại tế bào. Đưa các chất chống oxi hóa như flavonoit vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ, thoái hóa gan. Flavonoit cùng với axit ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzym oxi hóa-khử. Flavonoit còn ức chế tác động của hyaluronidazơ. Enzym này làm tăng tính thẩm của mao mạch. Khi enzym này thừa thì gây hiện tượng xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P (Pavitaminose). Các chế phẩm chứa flavonoit chiết từ các loài Citrus như “Cemaflavone”, “Circularine”… Flavonoit từ lá bạc hà (diosmin) như “Daflon”, “Diosmil”, flavonoit từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dược khác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính “dòn” và tính thấm của mao mạch. Tác dụng này được hợp lực cùng với axit ascorbic. Flavonoit được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hoàn võng mạc. Các dẫn chất anthocyanozit có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm. Tác dụng chống độc cua flavonoit thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan khi một số chất độc được đưa vào cơ thể súc vật thí nghiệm (CCl4,, benzen, etanol, CHCl3, quinin, novasenol…). Dưới tác dụng của flavonoit ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng. Sự tích lũy glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan. Việc sử dụng một số dược liệu trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan rất hiệu quả như : cây actiso, có biệt dược là Chophytol. Cây Silibum marianum Gaertn có biệt dược là Chophytol. Cây Silibum marianum Gaertn có biệt dược “Leganlon”; cây bụt dấm-Hibiscus sabdariffa. Tác dụng kích thích tiết mật thể ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon, flavonol và flavan-3-ol. Flavonoit thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Ví dụ, apigenin có tác dụng làm giảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, axetylcholin, seretonin. Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoit thuộc nhóm flavon, flavonol thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt. Scoparosid trong Sarothamnus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capitata, quercitrin trong lá diếp cá, flavonoit của cây râu mèo đều có tác dụng thông tiểu. Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycozit của rễ cam thảo đã được ứng dụng để chữa đau dạ dầy. một số dẫn chất khác như catechin, 3-O-methyl catechin, naringenin cũng đã được thử thấy có tác dụng chống loét. Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoit thuộc các nhóm flavon, flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chaleon, isoflavon, biflavon, 4-arylcoumarin, 4-arylchroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất flavonoit này ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin. Người ta sử dụng rutin, citrin, leucodelphinidin, quercetin, catechin để điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị. Trên hệ tim mạch , nhiều flavonoit thuộc nhóm flavonol, flavan-3-ol, anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelargonin, hỗn hợp catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích phút của tim, thí nghiệm làm hồi phục tim khi bị ngộ độc bởi CHCl3, quinin, metanol, bình thường lại sự rối loạn nhịp. Cao chiết từ lá cây bạch quả, Ginko biloha chứa các dẫn chất 3-rutinosid của kaempferol, quercetin và isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin và isoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt dược; ví dụ, “Ginkogink”, “Tanakan” có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch. Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc bằng trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáu gắt. Trên hệ thần kinh, một số C-flavon glycozit của hạt táo, Ziziphus vulgais var.spinosus (chứa spinosin, swertisin và các dẫn chất acyl của spinosin) có tác dụng an thần rõ rệt. Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7-O-β-D-galactopyranosid. Các dẫn chất thuộc nhóm isoflavonoit có tác dụng estrogen ví dụ genistein (=5, 7, 4’ trihydroxyisoflavon) daizein (=7, 4’ dihydroxyisoflavon). Tác dụng này được giải thích do sự gần nhau về cấu trúc với diethylstillboestrol. 8,55A0 15,5A0 3,88A0 Một số flavonoit khác thuộc nhóm rotenoid như chất rotenon có trong dây mật, Derris elliptica Benth thì tác dụng diệt côn trùng đã được biết và đã được ứng dụng từ lâu. PHẦN 2. MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu - Xây dựng qui trình chiết tách các lớp chất trong lá vối. - Phân tích thành phần hoá học các cặn chiết bằng các phương pháp SKLM. - Phân tách các chất từ cặn chiết. - Xác định cấu trúc phân tử các chất phân lập. 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp chiết các lớp chất theo độ phân cực của dung môi. - Phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột để phân lập các chất từ cặn chiết. - Phương pháp vật lý hiện đại IR, UV, MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1 chiều và 2 chiều) để xác định cấu trúc phân tử các chất phân lập. Phần 3. Kết quả và thảo luận 3.1 Xử lý mẫu và chiết Xử lí mẫu. Lá vối (Cleistocalyx operculatus Roxb) ®ược thu hái ở Vĩnh phúc, vào tháng 8 năm 2005. Lá không bị sâu được rửa sạch, rồi phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy ở nhiệt độ khoảng 45-500C cho đến khô giòn. Nghiền nhỏ lá thành bột mịn để làm nguyên liệu chiết. Các lớp chất có mặt trong lá vối mà chúng tôi quan tâm là các flavonoit và các axit tritecpen-cacboxylic. Do vậy, một qui trình xử lí mẫu đã được xây dựng để chiết định hướng hai lớp chất này. Qui trình chiết. Bột lá vối (1,2kg) được ngâm chiết với etanol 950 ë nhiÖt ®é phßng trong thêi gian 1-2 ngµy. Sau đó lọc lấy dịch chiết etanol, bã lại cho vào bình ngâm tiếp với etanol. Quá trình được lặp lại như vậy 3 lần. Các dịch chiết etanol được gộp lại và cất loại dung môi ở 500C dưới áp suất thấp đến khi còn 0,3 lít. Pha loãng dịch này với nước cất, và chiết với ete dầu hoả (30-600C) để loại sắc tố, các axit béo,.... Tiếp theo, chiết dịch etanol-nước lần lượt với cloroform và etylaxetat. Hiệu suất thu 3 cặn chiết này so với lượng mẫu cây khô ban đầu như sau: cặn ete dầu hỏa (kí hiệu cặn A) 50,8g, (hiÖu suÊt 8,26%); cÆn CHCl3 (cặn C) 86,8g (hiệu suất 14,26%) và cặn chiết EtOAc (cặn E) 7,4g (hiệu suất 1,24%). Quy trình chiết được chỉ ra trên hình 3.1: H×nh 3.1 Quy tr×nh ®iÒu chÕ c¸c cÆn chiÕt tõ l¸ vèi 3.2 Kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc cña c¸c phÇn chiÕt Do sù quan t©m cña chóng t«i tËp trung vµo hai cÆn chiÕt clorofom vµ etylaxetat nªn sù kh¶o s¸t ho¹t tÝnh sinh häc nh­ kh¸ng khuÈn vµ kh¸ng «xi hãa chØ ®­îc thùc hiÖn víi hai cÆn nµy. 3.3 §Þnh tÝnh flavonoit vµ axit triterpen-cacboxylic Để định hướng cho việc phân lập, chúng tôi đã tiến hành thử định tính các flavonoit và axit cacboxylic trong các cặn chiết. Để nhận biết các flavonoit người ta thường dùng phản ứng với dung dịch FeCl3 và phản ứng tạo màu xianidin (phản ứng Shinoda). Peach K. và Traecy M.V đã chỉ ra rằng tuỳ theo cấu tạo của flavonnoit mà khi tạo phức với FeCl3 cho màu khác nhau, lục, tím, hoặc nâu [17]. Cũng phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của flavonoit mà khi khử hoá với Mg/HCl cho màu khác nhau, từ đỏ vừa đến đỏ sẫm hay màu fucsin và gọi chung là màu xianidin [21]. Thực hiện hai phản ứng này chúng tôi nhận thấy trong cặn A không có flavonoit. Còn cặn C và E thì có flavonoit. Các axit hữu cơ, đặc biệt là các axit có phân tử lượng lớn hay mạch các bon dài thường cho kết tủa với chì axetat. Áp dụng phản ứng này chúng tôi nhận thấy cặn C có các axit tritecpenoit. 3.4 Nghiªn cøu thµnh phÇn cña cÆn chiÕt clorofom (cÆn C) 3.4.1 Ph©n tÝch b»ng s¾c kÝ líp máng (TLC) CÆn chiÕt clorofom ®­îc kh¶o s¸t b»ng TLC ®Ó ®Þnh h­íng cho viÖc ph©n t¸ch c¸c thµnh phÇn cña nã. Sù ph©n tÝch ®­îc thùc hiÖn trªn b¶n máng silica gel víi hÖ dung m«i ete dÇu háa (30-600C)/ clorofrom : 9/1 (v/v). KÕt qu¶ cho thÊy phÇn chiÕt nµy kh¸ phøc t¹p, gåm 9 thµnh phÇn vµ ®­îc ph¸t hiÖn d­íi d¹ng vÖt râ nÐt cã mµu vµng hoÆc tÝm nh¹t víi thuèc thö vanilin - axit sunfuric khi h¬ nãng (xem kÕt qu¶ ph©n tÝch TLC ë phÇn Thùc nghiÖm, b¶ng 4.1, trang 44). 3.4.2 Ph©n t¸ch b»ng s¾c kÝ cét C¸c thµnh phÇn cña cÆn chiÕt clorofom ®· ®­îc ph©n t¸ch trªn cét trung ¸p, sö dông thiÕt bÞ t¸ch MPLC trªn chÊt hÊp phô silicagel röa gi¶i theo gradient, ¸p dông víi c¸c hçn hîp nh­ ete dÇu háa-clorofom, n-hexan-axeton, clorofom-metanol. Dùa trªn kÕt qu¶ kh¶o s¸t TLC, c¸c ph©n ®o¹n röa gi¶i gièng nhau ®­îc gom l¹i thµnh c¸c nhãm ph©n ®o¹n, kÝ hiÖu tõ C0 ÷ C8. C¸c ph©n ®o¹n gép l¹i ®­îc ph©n t¸ch tiÕp b»ng s¾c kÝ cét nhanh vµ kÕt hîp víi sù kÕt tinh ph©n ®o¹n, tõ mét sè ph©n ®o¹n chóng t«I ®· thu ®­îc 3 chÊt tinh khiÕt: (i)- ChÊt C5 nhËn ®­îc d­íi d¹ng c¸c tinh thÓ h×nh kim mµu vµng tõ ph©n ®o¹n C5.1; (ii)- ChÊt C6 nhËn ®­îc d­íi d¹ng c¸c tinh thÓ h×nh kim mµu vµng tõ ph©n ®o¹n C6.1.4 vµ (iii)- ChÊt C7 nhËn ®­îc d­íi d¹ng c¸c tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng tõ ph©n ®o¹n C7.1.2. Sù ph©n t¸ch c¸c chÊt tõ cÆn clorofom ®­îc minh häa nh­ ë h×nh 3.2 : 3.5 Ph©n tÝch thµnh phÇn cña cÆn chiÕt etylaxetat (cÆn E) CÆn chiÕt etylaxetat ®­îc kh¶o s¸t b»ng TLC ®Ó ®Þnh h­íng cho viÖc ph©n t¸ch c¸c thµnh phÇn cña nã. Sù ph©n tÝch ®­îc thùc hiÖn trªn b¶n máng silica gel víi hÖ dung m«i etylaxetat/ n-hexan : 7/3 (v/v). KÕt qu¶ cho thÊy phÇn chiÕt nµy gåm nhiÒu vÖt cã Rf kh¸ gÇn nhau, trong ®ã c¸c vÖt chÊt ®­îc ph¸t hiÖn qua sù hiÖn mµu xanh sÉm víi thuèc thö FeCl3 5%. Do bÞ h¹n chÕ vÒ thêi gian, c¸c thµnh phÇn cña cÆn C ch­a ®­îc ph©n t¸ch tinh khiÕt. 3.6 Kh¶o s¸t cÊu tróc cña c¸c chÊt ph©n lËp 3.6.1 CÊu tróc chÊt C5. Dùa vµo ph¶n øng ®Þnh tÝnh còng nh­ ®Æc ®iÓm mang mµu vµng cña chÊt chóng t«I dù ®o¸n C5 lµ mét flavonoit. §iÒu nµy ®­îc thÊy râ trong phæ hång ngo¹i (IR, KBr, cm-1) cña nã. Ch¼ng h¹n, c¸c d¶i hÊp thô ®Æc tr­ng cho mét hîp chÊt phenol (nOH ë 3241,81; nC-H ë 1538.76 vµ 1620,58); nhãm cacbonyl liªn hîp a,β-kh«ng no (nC=O 1760). Th«ng qua c¸c d÷ liÖu tõ phæ NMR (1H- vµ 13C-) vµ phæ MS (M+, m/z= 298), c«ng thøc ph©n tö cña C5 ®· ®­îc x¸c ®Þnh lµ C18H18O4, phï hîp víi c«ng thøc cña mét dÉn xuÊt chalcon. CÊu tróc cña C5 ®· ®­îc lµm s¸ng tá khi kh¶o s¸t c¸c phæ 1H-NMR. Theo phæ nµy vßng B lµ vßng phenyl víi 5 H: 2H t­¬ng ®­¬ng ë d 7.49 ppm cña C-2’ vµ C-6’; 2H t­¬ng ®­¬ng ë d 7.43 ppm cña C-3’ vµ C-5’ vµ 1H ë d 7.26 ppm cña C-4’). TÝn hiÖu cu¶ hai proton Hγ vµ Hβ ®Æc tr­ng cho c¸c chalcon còng cã mÆt trong phæ nµy (d 8.00 ppm vµ d 7.90 ppm). Ngoµi ra, tÝn hiÖu cña hai nhãm metyl xuÊt hiÖn ë tr­êng thÊp h¬n so víi c¸c nhãm metyl th«ng th­êng kh¸c (d 2.13 ppm vµ d 2.13 ppm) lµ do chóng n»m gÇn c¸c nguyªn tö/nhãm hót electron m¹nh. Trong phæ 1H-NMR cña C5 cßn cã tÝn hiÖu cña mét nhãm metoxi (-OCH3) ë d 3.66 ppm vµ mét nhãm OH n»m gÇn nhãm C=O (d 13.58 ppm). Tõ sù ph©n tÝch ë trªn còng nh­ ®èi chiÕu víi c¸c gi¸ trÞ dC trong phæ 13C-NMR vµ kh¶o s¸t phæ HMQC vµ HMBC cÊu tróc cña chÊt C5 ®· ®­îc x¸c ®Þnh lµ 2,4-®ihidroxi-6-metoxi-3,5-dimetylchalcon. ChÊt nµy ®· ®­îc nhãm nghiªn cøu cña PGS. NguyÔn V¨n §Ëu t¸ch tõ c©y vèi Nam §Þnh [Gãp phÇn nghiªn cøu thµnh phÇn ho¸ häc cña l¸ c©y vèi - NguyÔn V¨n ThuÊn, Khãa luËn tèt nghiÖp, tr­êng §HKHTN, §HQG HN, 2005]. γ β 2,4-dihidroxi-6-metoxi-3,5-dimetyl chalcon (C18H18O4) Cấu trúc phân tử của cũng phù hợp với sơ đồ phân mảnh của nó trong phối khổ ở một số mảnh chính như sau: Phæ NMR vµ MS xem phÇn thùc nghiÖm vµ Phô lôc [] Đặc điểm vật lý Mét sè h»ng sè vËt lý cña C5 ®­îc nªu ra trong b¶ng 3.1 Chất Hình dạng mầu sắc Nhiệt độ nóng chảy (◦C) Dung môi kết tinh SKLM Hiệu suất phân lập (◦/◦◦) RF Dung môi sắc ký Sắc phổ Vanilin /HsSO4 5% FeCl3 Hình kim- màu vàng sẫm 125±1◦C Cloroform 0.74 Ete dầu hỏa / cloroform (9/1) Vàng sẫm Nâu nhạt 2.711 Dạng bột- màu vàng sẫm 216±1◦C Ete dầu hỏa / axeton 0.76 Ete dầu hỏa / cloroform (1/9) Da cam Nâu 0.176 Hình kim-màu vàng sẫm 306±1◦C Metanol 0.71 Ete dầu hỏa / axeton Tím sẫm Không màu 0.112 Bảng 3.1: Đặc điểm vật lý và hiệu suất phân lập các chất từ cặn chiết cloroform của lá vối. 3.6.2 CÊu tróc chÊt C6. Dùa vµo ph¶n øng ®Þnh tÝnh chÊt C6 cã thÓ dù ®o¸n lµ mét flavonoit. Trong phæ hång ngo¹i cña nã cã c¸c giao ®éng cña nhãm hidroxi ë 3227 cm-1, cña nhãm cacbonyl ë 1693 cm-1 vµ cña vßng phenyl ë 1608 vµ 1515 cm-1. Qua c¸c d÷ liÖu tõ c¸c phæ NMR (1H- vµ 13C-) vµ MS (M+, m/z= 298) chÊt C6 cã c«ng thøc ph©n tö lµ C18H18O4. So s¸nh phæ 1H-NMR cña C5 vµ cña chÊt C6 chóng t«i nhËn thÊy ë chÊt C6 kh«ng cã 2 proton Hβ vµ Hγ n÷a nh­ng thay vµo ®ã lµ 2 proton cña nhãm metylen, CH2. Kh¶o s¸t kü h¬n c¸c phæ HMQC vµ HMBC ®· cho phÐp kÕt luËn cÊu tróc cña chÊt C6 lµ 7-hidroxi-5-metoxi-6,8-dimetylflavanon. ChÊt nµy lµ s¶n phÈm ®ãng vßng cña chÊt C5 vµ nã h×nh thµnh trong qu¸ tr×nh sinh tæng hîp xÈy ra trong c©y vèi.[] 7-hidroxi-5-metoxi-6,8-đimetyl flavanon (C18H18O4) Công thức cấu tạo này phù hợp với sự phân mảnh như sau : Phæ NMR vµ MS xem phÇn thùc nghiÖm vµ Phô lôc []. Mét sè h»ng sè vËt cña C6 ®­îc nªu ra trong b¶ng 3.1 3.6.3 CÊu tróc chÊt C7. Phæ 1H- vµ 13C-NMR cho thÊy chÊt C7 cã 48 proton vµ 30 nguyªn tö cacbon. Phæ khèi l­îng (EI-MS) chØ ra pic ion ph©n tö m/z 456 (M+) vµ c¸c m¶nh ph©n r· ë 248, 203, 189 t­¬ng øng víi sù ph©n r· retro Diels-Alder tõ mét tritecpen thuéc d·y urs-12-en víi nhãm OH ë vßng A. Nh­ vËy, c«ng thøc ph©n tö cña C7 lµ C30H48O3. CÊu tróc cña ®· ®­îc x¸c ®Þnh dùa vµo c¸c tÝn hiÖu xuÊt hiÖn trªn c¸c phæ NMR. Phæ DEPT cña C7 cho thÊy trong 30 nguyªn tö cacbon, cã 7 nguyªn tö cacbon bËc bèn, 5 nhãm CH, 10 nhãm CH2 vµ 7 nhãm CH3. Vµ ®iÒu nµy phï hîp víi nhËn xÐt r»ng chÊt C7 lµ mét hîp chÊt tritecpen n¨m vßng. KÕt hîp ph©n tÝch c¸c tÝn hiÖu trªn c¸c phæ 1H- vµ 13C-NMR, vµ HMQC nhËn thÊy r»ng proton cña nhãm hidroxymetin xuÊt hiÖn ë d 3,20 ppm (1H, dd, J=9,0 vµ 7,1 Hz, Ha-3) ®­îc g¾n vµo nguyªn tö >CH cã dc 79,1 ppm (d, C-3). Sù cã mÆt cña nhãm metin olefinic thÓ hiÖn qua tÝn hiÖu ë 5,28 ppm (1H, t, J=3,5 Hz, H-12) ®­îc g¾n vµo nguyªn tö C-12 cã dc 125,66 ppm. Ngoµi ra, tÝn hiÖu cña nhãm cacboxyl ®­îc ph¸t hiÖn dÔ dµng trong phæ 13C-NMR ë d 180,94 ppm (s, C-28). Trªn c¬ së nh÷ng ph©n tÝch ë trªn còng nh­ so s¸nh víi c¸c sè liÖu phæ ®· c«ng bè trong tµi liÖu [19], cho phÐp kÕt luËn C7 lµ axit oleanolic. CÊu tróc ph©n tö cña C7.1.2 phï hîp víi s¬ ®å ph©n m¶nh cña nã trong khèi phæ ë mét sè m¶nh chÝnh nh­ sau: m/z=13 m/z=248 m/z=438 m/z=187 m/z=203 m=18 m=16 m٠=45 m٠=45 M+456 Phæ NMR vµ MS xem phÇn thùc nghiÖm vµ Phô lôc []. Mét sè h»ng sè vËt cña C7.1.2 ®­îc nªu ra trong b¶ng 3.1 PHẦN 4. THỰC NGHIỆM 4.1 Mẫu nguyên liệu Mẫu lá vối được thu hái vào tháng 5 dương lịch 2003 tại tỉnh Vĩnh Phúc. Lá vối được rửa sạch, phơi khô và sấy ở nhiệt độ 45-500C đến khi lá vối có màu đen đều, giòn dễ vỡ thì đem xay thành bột mịn và cho vào chai màu nâu, bảo quản nơi khô ráo. 4.2 Dụng cụ và hoá chất Các dung môi hữu cơ dùng để chiết thực vật là các dung môi tinh khiết (pure); khi dùng sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột phải sử dụng dung môi tinh khiết (PA), nếu dung môi công nghiệp thì phải xử lí như sau: + Dung môi etylaxetat kỹ thuật được rửa axit ba lần với dung dịch natri cacbonat 5%, sau đó rửa bằng nước cất đến pH=7. Làm khô bằng natri sunfat khan sau đó bằng canxi clorua khan, cất lấy etylaxetat ở phân đoạn có nhiệt độ sôi 76-780C. + Dung môi toluen và methanol loại (PA) của Trung Quốc. + Dung môi n-hexan kỹ thuật được rửa bằng H2SO4 đậm đặc, sau đó bằng nước cất đến pH=7. Làm khô bằng natri sunfat khan và cất lấy phân đoạn có nhiệt độ sôi 67-690C. + Dung môi cloroform kỹ thuật đem lắc với H2SO4 đặc, tiếp đó rửa với nước, làm khan bằng canxi clorua khô và cất cloroform ở nhiệt độ 61-62oC. Sắc kí lớp mỏng được chạy trên bản nhôm tráng sẵn Silica gel 60F254 độ dầy 0,2mm (hãng Merck). Các sắc kí đồ lớp mỏng được thực hi