Khóa luận Nhân giống lan hồ điệp Phalaenopsis sp. bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS – temporary immersion system)

hu kỳ (hình 1.8b). Mẫu cấy được đặt trên một tấm lưới polypropylene gắn vào thành bình nuôi cấy. Quá trình điều khiển thực hiện ở việc nạp môi trường, độ sâu mực chất lỏng, chu kỳ tuần hoàn môi trường lỏng và được điều chỉnh theo lịch trình trong suốt quá trình nuôi cấy. Hệ thống có khả năng điều khiển đồng thời 4 bình nuôi cấy. a b Hình 1.8a. Hệ thống của Aitken - Christie và Davies (1988). Hình 1.8b. Hệ thống của Simonton và cộng sự (1991). 1.4.3.4. Hệ thống ngập hoàn toàn có sự vận chuyển môi trường lỏng bằng áp lực không khí và không có sự thay mới môi trường Nhiều hệ thống khác nhau đã được Alvard và cộng sự (1993) mô tả trong đó có những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời được thiết kế gần đây nhất, tất cả đều khá đơn giản và rất dễ sử dụng. Hệ thống này cho phép toàn bộ mẫu cấy được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng, đồng thời bầu không khí trong bình nuôi được làm mới nhờ sử dụng bộ phận bơm khí có chức năng vừa cung cấp không khí vào môi trường, vừa đẩy chất lỏng ra vào bình nuôi cấy. Mẫu cấy được đặt trong bình nuôi thành một khối, điều này giúp chúng ta tiết kiệm được thời gian đặt mẫu trên giá đỡ. Môi trường lỏng được đẩy từ bình chứa môi trường sang bình nuôi cấy và ngược lại nhờ một áp lực khí bơm vào bình chứa chất lỏng. Để tránh sử dụng nhiều ống nối, bình chứa thường thiết kế gồm hai bình có cùng thể tích. Áp suất vượt mức được đưa qua những van solenoid hay một máy nén khí nối với công tắt đã được lập trình. Điều này cho phép chúng ta xác định được thời gian và thời điểm ngập nước vào ngăn chứa cây. Do những hệ thống này không có bình chứa môi trường mới nên môi trường nuôi cấy phải được thay mới sau 4 - 6 tuần. Tuy nhiên việc thay đổi này rất nhanh và không cần thiết phải di chuyển mẫu cấy. Các biến thể khác nhau của hệ thống này đã được phát triển và bán rộng rãi trên thị trường, đó là hệ thống RITA® (the Recipient for Automated Temporary Immersion system), hệ thống đôi (BIT®) và hệ thống Plantima. Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 1.4.4.1. Hệ thống RITA® Hệ thống RITA® (hình 1.9) (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa dung tích 1 lít có hai ngăn, ngăn trên chứa mẫu cấy và ngăn dưới chứa môi trường. Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng ở dạng ngăn dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy. Mẫu cấy được ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức được duy trì. Trong thời gian mẫu ngập trong môi trường lỏng, không khí được sục vào trong môi trường lỏng dưới dạng những bọt khí góp phần làm xoay trở nhẹ mẫu cấy và làm mới không gian bên trong bình nuôi cấy, áp suất vượt mức sẽ đẩy không khí trong bình ra ngoài qua một màng lọc khí trên nắp bình. Hình 1.9. Hệ thống RITA® Bao gồm: Pha 1: mô không ngập trong môi trường. Pha 2: hiện tượng ngập được hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy. Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA®. Pha 4: chu kỳ kết thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới. 1.4.4.2. Hệ thống bình sinh đôi BIT®   Hệ thống bình đôi BIT® (hình 1.10) do Escalona và cộng sự (1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôi soma; thiết kế chủ yếu phục vụ cho việc nhân sinh khối cơ quan do có thể tích bình chứa lớn hơn và có giá thành thấp hơn. Cách dễ dàng nhất để vận hành hệ thống nuôi cấy ngập chìm sử dụng áp lực khí là nối hai bình thủy tinh hay plastic có dung tích từ 250 ml - 1000 ml bằng một hệ thống ống dẫn, và điều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại. Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên. Hình 1.10. Hệ thống bình đôi BIT® 1.4.4.3. Hệ thống Plantima® Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA® tuy nhiên có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc. Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A - tech Bioscientific tại đảo Ðài Loan. Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 1.11, Hình 1.12) Hình 1.11. Các thành phần của bình Plantima, Đài Loan. ĐaiLoan Hình 1.12. Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập Hình 1.13. Hệ thống Plantima a: Bình Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập b: Cây sinh trưởng và phát triển trong hệ thống Plantima. Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong vi nhân giống trên thế giới và ở Việt Nam Sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong thương mại, điều quan trọng là phải hiểu rõ các đặc điểm về sinh trưởng, quá trình nuôi cấy và chất lượng của mẫu cấy; so sánh giữa chúng với những mẫu được nuôi cấy trong hệ thống thông thường. 1.4.5.1. Thành tựu trên thế giới Hệ thống ngập chìm tạm thời TIS là một trong những phương pháp vi nhân giống đầy triển vọng trong sản xuất cây giống thương mại. + Trong sự nhân nhanh chồi và các đoạn cắt in vitro Sự ngập chìm tạm thời kích thích sự nảy chồi. Hệ thống này cho phép sự sinh trưởng liên tục của chồi mà không cần phải cấy chuyền mẫu cấy. Chồi thu được khi nuôi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao hơn và có chất lượng tốt hơn so với những chồi thu được trên môi trường bán rắn. Một chứng minh đầy đủ và thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia tăng số lượng chồi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chuối (Musa, phụ nhóm AAH). Đồng thời Alvard và cộng sự (1993) chứng minh rằng sử dụng môi trường lỏng tác động mạnh mẽ vào sự phát triển và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân Chuối. - Chồi Chuối trong môi trường nuôi cấy lỏng đơn giản hay trên giá thể bằng cellulose có sự nhân chồi bình thường hay không có gì khác biệt. - Chồi trên môi trường bán rắn có sự ngập một phần và trong môi trường lỏng có sục khí có hệ số nhân chồi từ 2,2 - 3,1. - Hệ số nhân chồi cao nhất (>5) thu được trên mẫu nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Các tác giả này đã thu được kết quả trên khi sử dụng hệ thống RITA® với thời gian ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ. Một nhóm nhà nghiên cứu Cuba đã thu được kết quả tương tự trên đối tượng cây Chuối Musa acuminata khi sử dụng hệ thống bình đôi (Teisson và cộng sự, 1999). Tương tự như vậy, Escalona và cộng sự (1999) đã sử dụng hệ thống trên để nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus, kết quả cũng cho thấy nuôi cấy ngập chìm tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với trọng lượng tươi và trọng lượng khô sau 42 ngày nuôi cấy. Hệ số nhân được gia tăng khoảng 300% so với nuôi cấy lỏng và 400% so với nuôi cấy trên môi trường rắn. Có gần 5000 cây Dứa thu được từ một hệ thống như vậy. Đối với cây Cà Phê (Coffea arabica và C. canephora), nhân giống bằng các in vitro trên môi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi. Hệ số nhân xấp xỉ 6 - 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự, 1989). Khi sử dụng hệ thống RITA® hệ số nhân tương tự có thể được đạt tới chỉ trong vòng 5 - 6 tuần (Berthouly và cộng sự, 1995). + Trong sự tạo củ bi in vitro Sự sinh trưởng và sự hình thành củ Khoai tây Solanum tuberosum L. được đẩy mạnh bởi tình trạng ngập chìm tạm thời trong hệ thống bình đôi (Akita và Takayama, 1994). Số củ bi hình thành xấp xỉ 500 - 960 củ sau 10 tuần nuôi cấy nhiều hơn những kết quả trong các công trình trước đó (chỉ khoảng 220 củ trong một lần nuôi cấy (Akita và Takayama, 1993). Trọng lượng tổng số và tính đồng nhất của củ cũng được gia tăng. Ngược lại trong điều kiện nuôi cấy ngập liên tục, không có bất cứ sự hình thành củ nào. Teisson và Alvard (1999) đã kiểm chứng lại hiệu quả của nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên sự tạo củ Khoai tây bằng cách tiến hành thí nghiệm trên hệ thống RITA® đôi dựa trên nguyên tắc hệ thống bình đôi. Ba củ bi được hình thành trên một đốt trong 10 tuần nuôi cấy. Năm mươi phần trăm củ có trọng lượng lớn hơn 0,5 g. Hệ thống này rất có hiệu quả và nhanh chóng do có từ 3 đến 4 chồi nảy lên từ một củ. + Trong sự phát sinh phôi Gia tăng sự phát sinh phôi: - Các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đã được chứng minh thành công hơn trong nuôi cấy phát sinh phôi khi được so sánh với các hệ thống thông thường sử dụng môi trường rắn hay nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác. - Tisserat và Vandercook (1985) thống kê sự sinh trưởng của phôi cây Cà rốt và cây Chà Là (Phoenix dactylifera) trong hệ thống APCS trong đó thời gian ngập chìm là 5 - 10 phút sau mỗi 2 giờ. So sánh với những cây nuôi cấy trên môi trường rắn, sự sinh trưởng gấp 1,9 lần trong trường hợp cây Cà rốt, và 4 lần đối với cây Chà Là trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Thêm vào đó chất lượng cũng như số lượng của phôi soma và cây con Cà rốt được nâng lên. Sự phát triển phôi: - Quy trình nhân và chất lượng của phôi soma trên nhiều đối tượng khác nhau đã được cải tiến bằng nuôi cấy ngập chìm tạm thời. - Đối với cây Cao Su Hevea brasiliensis sự hình thành phôi soma trên môi trường rắn cho kết quả rất thấp và số lượng cũng như chất lượng phôi soma không đáng kể (Etienne và cộng sự, 1997). Sự tạo phôi soma trong nuôi cấy ngập chìm tạm thời gấp đến 4 lần so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn với hơn 400 phôi/g trọng lượng tươi của mẫu nuôi cấy phát sinh phôi. - Nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng giúp giảm số lượng phôi bị bất thường còn phân nửa cũng như giúp gia tăng tỷ lệ phôi phát triển lên tiếp. Hệ thống này có thể giúp tỷ lệ nảy mầm của phôi lên tới trên 60%, tỷ lệ hình thành trụ trên lá mầm là 35%. Theo Teisson và cộng sự (1999) gần 150 phôi soma cây Cao Su ở giai đoạn có lá mầm đã thu được trong một hệ thống RITA® từ tuần thứ tư đến tuần thứ tám sau khi bắt đầu chuyển giai đoạn phát sinh phôi vào trong hệ thống này. - Tuy nhiên để tái sinh thành cây hoàn chỉnh, những phôi nảy mầm cần được chuyển vào trong môi trường bán rắn do khi cây phát triển thành phần ngọn và phần gốc, đòi hỏi phải đặt cây con luôn đứng thẳng hướng lên trên cùng hướng phát triển của cây. Trong hệ thống RITA® không thể đạt được yêu cầu trên vì cây luôn di chuyển mỗi khi môi trường dâng lên ngập theo chu kỳ. Sự tạo phôi đồng loạt: - Trên các cây thuộc họ cam chanh, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng đã cải thiện tính đồng bộ trong quá trình phát sinh phôi nhờ khả năng ức chế sự phát sinh phôi thứ cấp (Cabasson và cộng sự, 1997). - Hệ thống này cũng cải thiện sự đồng bộ trong suốt quá trình phát triển và nảy mầm phôi Cao Su và Cà Phê Arabica so với quá trình này trên môi trường bán rắn (Etienne và cộng sự, 1997; Etienne-Barry và cộng sự, 1999). 1.4.5.2. Thành tựu ở Việt Nam Thế giới đã ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây trồng từ lâu tuy nhiên công nghệ này mới được thực hiện tại Việt Nam trong những năm gần đây. Hệ thống này đã được tiến hành khảo sát trên các đối tượng như hoa Lan, cây thu hải đường và các giống kiểng lá... Năm 2005, Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP. HCM đã tiến hành nhân giống cây Lan Hồ Điệp lai trong nuôi cấy ngập chìm tạm thời. Đến năm 2007, Th.S. Cung Hoàng Phi Phượng và cộng sự đã hoàn thiện qui trình nhân giống Lan Phalaenopsis bằng hệ thống Plantima. Kết quả đạt được như sau: tỉ lệ nhân PLB gấp 2,27 lần sao với nhân trên môi trường thạch và gấp 1,2 lần so với môi trường lỏng lắc; tỉ lệ chồi gấp 3,37 lần khi so sánh với nuôi cấy trên môi trường đặc, 1 chồi ban đầu thu nhận được 10 chồi mới, cây con tạo thành phát triển mạnh. Cùng với những ưu điểm của hệ thống Plantima và phát huy kết quả đạt được của Trung tâm Công Nghệ Sinh Học TP.HCM đã tiến hành ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống cây kiểng lá Spathiphyllum sensation thuộc họ Araceae đã cho kết quả ban đầu rất khả quan. Sau 2 tháng nuôi cấy, các mẫu cấy sống 100% và có khả năng tái sinh chồi, chồi thu được có từ 3 - 4 lá, xanh mướt. Xét về số lượng chồi thu được hệ số nhân chồi gấp 4 lần trên môi trường thạch. Đồng thời vào năm 2008, KS. Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam đã ứng dụng thành công hệ thống Bioreactor dạng TIS trong nhân chồi và PLBs hoa Lan Dendrobium và Phalaenopsis. Kết quả thu được lượng chồi, PLBs sản xuất cao hơn 3 đến 20 lần so với nuôi cấy môi trường thạch, chồi khỏe, PLBs có màu xanh đậm. Những thành công bước đầu trong việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nuôi cấy mô góp phần phát triển nguồn cây giống nước ta lên tầm cao mới; và phục vụ tốt cho việc sản xuất theo qui mô công nghiệp trong thời gian tới. Ưu và nhược điểm của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 1.4.6.1. Ưu điểm Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System, TIS) có tác động tích cực lên tất cả các giai đoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây được nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống Bioreactor thông thường. Cây tái sinh và phôi soma thu được trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn. Từ đó cây có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm. Có thể nói hệ thống TIS đã kết hợp thành công những ưu điểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh được những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng. Chu kỳ và tần số ngập chìm là những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng đến sự phát triển của mẫu cấy cũng như toàn bộ quy trình nhân giống. Khi những chỉ số này được tối ưu hóa, sản lượng sẽ được gia tăng, quá trình kiểm soát sự phát sinh hình thái tốt hơn và còn có khả năng hạn chế tối đa hiện tượng thủy tinh thể. Ðây là ưu điểm lớn nhất của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời so với hệ thống Bioreactor thông thường. Hệ thống TIS tiết kiệm được công lao động và không gian phòng nuôi cấy và giảm được chi phí sản xuất. Những quá trình nhân nhanh phôi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo củ bi có khả năng được tối ưu hoá trên nhiều đối tượng cây trồng từ đó giảm được chi phí sản xuất một cách đáng kể.  1.4.6.2. Nhược điểm  Mật độ nuôi cấy là một yếu tố không kém phần quan trọng nhưng hiện nay vẫn chưa được khảo sát một cách sâu rộng. Thời gian ngập tối ưu phải được khảo sát và xác định chính xác cho từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyền đối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới, cuối cùng là phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai đoạn nuôi cấy. Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết để có thể tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy trong những hệ thống này.    Một ưu điểm khác của hệ thống này trong việc giảm được hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy của mẫu cấy vẫn chưa được đánh giá chính xác. Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tương đối cao do phải nhập hệ thống này từ nước ngoài như Pháp, Cuba, Đài Loan do đó nếu muốn ứng dụng rộng rãi thì những hệ thống này nhất thiết phải được nghiên cứu thiết kế ngay trong nước để giảm giá thành. Ngoài ra, những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây, có được những điều kiện như vậy thì chúng ta mới có khả năng áp dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời rộng rãi trong sản xuất cây giống.   1.5. Môi trường nuôi cấy in vitro 1.5.1. Vai trò của các thành phần trong môi trường nuôi cấy Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp là một yếu tố rất quan trọng quyết định sự thành công trong nuôi cấy mô. Không có môi trường nào là môi trường chuẩn tuyệt đối cần thiết cho sự phát triển của tất cả các tế bào và do đó sự thay đổi môi trường là cần thiết, tùy thuộc vào từng loại mô nuôi cấy khác nhau, hoặc phương pháp nuôi cấy khác nhau. Nhìn chung, môi trường nuôi cấy bao gồm các khoáng vô cơ, các chất hữu cơ như chất điều hòa sinh trưởng thực vật, vitamin, đường, nước dừa, nấm men, khoai tây... trong đó, các khoáng vô cơ là quan trọng nhất trong các thành phần của môi trường nuôi cấy. 1.5.2. Một số môi trường thường được dùng trong nuôi cấy in vitro - Môi trường của Murashige và Skoog (1962): môi trường MS. - Môi trường Lloyd và McCown (1980): môi trường WP. - Môi trường Vacin và Went (1949): môi trường VW. - Môi trường Gamborg et al. (1968): môi trường B5. - Môi trường Nitsch và Nitsch (1969): môi trường N6. - Môi trường Knudson C (1946): môi trường KNC. - Môi trường White (1963) Các thành phần hóa chất trong môi trường trên thường nhiều và được sử dụng với một lượng rất ít nên khóa khăn cho việc cân hóa chất nên cần phải pha dung dịch mẹ để sử dụng. Việc bảo quản dung dịch mẹ cũng khó khăn vì phải giữ ở nhiệt độ 4oC. 1.5.3. Thành phần các chất khoáng vô cơ 1.5.3.1. Khoáng đa lượng Nhu cầu khoáng của mô tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng trong tự nhiên. Trong nhóm này gồm 3 nguyên tố chính như: N, P, K. + Đạm (N): Giữ vai trò tạo lập protein cho cây, giúp hình thành cơ quan, thân lá rễ phát triển, quang tổng hợp mạnh. Thiếu đạm cây màu nhợt nhạt, ốm yếu cây sinh trưởng kém, cằn cỏi... Để cung cấp nguồn đạm ta dùng những chất sau: - CO(NH2)2 : Urea (46% N). - (NH4)2SO4 : Ammonium Sunfate tức SA (22% N). - KNO3 : Potassium Nitrate (14% N). - NH4NO3 : Ammonium Nitrate (34% N). - NaNO3 : Sodium Nitrate (16,4% N). - Ca(NO3)2 : Calcium Nitrate (15,5% N). + Lân (P): Giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng. Lân giúp cây ra hoa, ra rễ, kích thích ra hoa, làm hoa bền ít rụng... Các chất có thể cung cấp Lân như: Super Lân : (20% P2O5). (NH4)2HPO4 : Diamonium Hydrogen Phosphate (46% P2O5). (NH4)3HPO4. 3H2O : Triamonium Hydrogen Phosphate (15,21% P). KH2PO4 : Monopotassium Phosphate (10,35%P). + Kali (K): Tạo các bó mạch trong cây, giúp cây cứng cáp, chắc, đứng thẳng, giúp cây ra hoa... Các chất cung cấp Kali như: - KCl : Potassium Chlorua (60% K2O). - K2SO4 : Potassium Sunfate (48% K2O). - KNO3 : Potassium Nitrate (44% K2O). - KH2PO4 : Monopotassium Phosphate (40% K2O). Ngoài ra cũng cần các nguyên tố: Ca, Mg và S + Calcium (Ca): Tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc... Đối với các chất chứa Ca không nên hòa tan với các chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấp thu hiệu quả. Cây thừa Ca sẽ hấp thu đạm nhiều sẽ trở nên quá mập, tàn lá rợp xuống, dễ bị gãy. Thiếu Ca cây ít hấp thu đạm làm cho cây không phát triển rễ, lá nhỏ lại, cây ốm yếu không đứng thẳng được. Các chất cung cấp Ca như: - CaCl2 : Calcium Chlorua - Ca(NO3)2 : Calcium Nitrate + Magnesium (Mg): Thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá cây phát triển, lá xanh. Có thể dùng MgSO4 hay MgHPO4 để cung cấp Mg cho cây. Nếu dư Mg lá sẽ có màu xanh đậm nhưng đọt non lại bị khô héo. Thiếu Mg bộ rễ sẽ phát triển to, mập nhưng thân lá èo uột, không cân đối giữa rễ và thân lá. + Sulfur (S): Thành phần của tế bào chất giúp cây tăng trưởng. Thường S có chứa sẵn trong các chất có gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4... Thiếu S thì cây Lan cằn cõi, lá bị vàng như bị thiếu đạm, cây trở nên èo uột, ốm yếu. 1.5.3.2. Khoáng vi lượng Nhóm này rất cần thiết cho Lan mặc dù Lan cần rất ít (không quá 5mg/lít). Một số nguyên tố vi lượng như: Bo, Zn, Cu, Mo, Mn, Fe... + Sắt (Fe): Đóng vai trò diệp lục tố, giúp cây quang tổng hợp tốt, làm cho lá cây có màu xanh. Thiếu Fe làm lá cây có màu xanh lợt, cây không quang hợp tốt, cây ngừng phát triển, đầu rễ kém phát triển có thể dùng FeEDTA để cung cấp Fe cho cây. + Đồng (Cu): Thiếu Cu dễ làm ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều ở dưới gốc. Lá bạc tái mất màu xanh và đầu lá đốm trắng rồi khô héo. Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây. + Kẽm (Zn): Giữ vai trò sản sinh tổng hợp protein và auxin. Thiếu Zn làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu. Nguyên nhân là do tưới thúc phân lân quá nhiều để kích thích ra hoa. Có thể dùng ZnSO4 để cung cấp Zn cho cây đồng thời giảm tưới lân. + Mangan (Mn): Thiếu Mangan lá vàng nhạt, ở lá già thường có chấm vàng. Dùng MnSO4 (Mangan Sunfate) để cung cấp Mn cho cây. + Molyden (Mo): Điều hòa tăng trưởng của cây. Có thể dùng Na2MoO4 (Sodium Molybdate) để cung cấp Mo cho cây. Bảng 1.1. Thành phần các chất khoáng vô cơ trong một số môi trường nuôi cấy thông dụng (mg/l) Hóa chất White B5 N6 WP MS VW KNC NH4NO3 400 1650 500 (NH4)2SO4 134 463 500 500 Mg2SO4.7H2O 720 246 185 370 370 122 122,15 KCl 65 250 KNO3 80 2528 2830 1900 525 KH2PO4 400 170 170 250 250 K2SO4 990 NaH2PO4.H2O 19 150 Na2SO4 200 CaCl2.2H2O 150 166 96 440 Ca(NO3)2.4H2O 300 556 241,3 Ca3(PO4)2 200 Na2EDTA.2H2O 37,2 37,2 37,2 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 27,8 27,8 27,8 25,0 Fe2(SO4)3 2,5 Fe2(C4N4O6)3 23,13 H3BO3 1,5 3 1,6 6,2 6,2 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 CuSO4.5H2O 0,001 0,025 0,25 0,025 MnSO4.H2O 10 5,68 5,68 MnSO4.4H2O 7 4,4 22,3 22,3 MoO3 0,0001 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 0,25 KI 0,75 0,75 0,8 0,83 ZnSO4.7H2O 3 2 1,5 8,6 8,6 White (1963) B5 : Gamborg et al. (1968) N6 : Nitsch và Nitsch (1969) WP : Lloyd và McCown (1980) MS : Murashige và Skoog (1962) VW : Vacin và Went (1949) KNC : Knudson C (1946) 1.5.4. Carbon và nguồn năng lượng Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose. Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy. Nồng độ sucrose có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy. 1.5.5. Vitamin Các vitamin rất cần thiết cho sự phát triển và tăng trưởng của thực vật. Vitamin thường có chức năng xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Các vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô là Thiamine (vitamin B1), Acid Nicotinic (B3), Pyridoxine (B6) và Myo - inositol, B5, B12. 1.5.6. Các chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hòa sinh trưởng thực vật hay còn gọi là Phytohormone đóng vai tròn điều hòa sinh trưởng và phát triển của thực vật bao gồm tái sinh các thực vật từ những tế bào và mô tách rời. Tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy mà loại và liều lượng sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau. Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen. Trong đó 2 chất điều hòa quan trọng là auxin và cytokinin quyết định sự kích thích phân chia và biệt hóa tế bào của các mô được nuôi cấy in vitro. Nhóm auxin (gồm IAA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T...) chủ yếu được sử dụng để kích thích sự phân bào và tạo rễ. Ở liều lượng cao, auxin thường gây nên các đột biến. Nhóm cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin...) đẩy nhanh sự phân chia tế bào, sự nhân chồi và sự phát triển chồi. 1.5.7. Một số yếu tố khác trong môi trường nuôi cấy mô Lan 1.5.7.1. Các chất hấp phụ phenol Khi phát triển phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống Phalaenopsis, vấn đề thường gặp nhất là hàm lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol sẽ khuếch tán vào môi trường, làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nươi cấy, kết quả là mẫu cấy sẽ bị hóa nâu và chết (Morel, 1974; Flemee và Boesman, 1977; Fast, 1979). Nhiều phương pháp loại trừ chất tiết này và đặc biệt là các sản phẩm oxy hóa của chúng được thực hiện, chẳng hạn như dùng chất chống oxy hóa, enzyme ức chế phenol, polyvinylpyrrolidone (PVP), than hoạt tính và nhiều loại chất hấp thụ khác. Hầu hết các phương pháp này đều kèm với việc cấy chuyền mẫu sau 2 - 3 tuần sang môi trường mới. Đối với nuôi cấy mô Lan trong môi trường lỏng thường bổ sung chất PVP. Sử dụng than hoạt tính là biện pháp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thương mại. Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ xác định và môi trường nuôi cấy Phalaenopsis các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh trưởng tốt (Arditti và Ernst, 1993; Park và cộng sự, 2000). 1.5.7.2. Nước dừa và các dịch chiết khác Nước dừa là nguồn cung cấp đạm dồi dào do thành phần chứa nhiều acid amin, acid hữu cơ. Ngoài ra, nước dừa còn chứa nhiều carbohydrate như sucrose, glucose và fructose. Môi trường chứa auxin và 10 - 20% nước dừa giúp sự phân chia của các tế bào thân đã phân hóa (sự tạo mô sẹo). Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học của chất có hoạt tính trong nước dừa nhưng phải sau khi khám phá ra cytokinin vài năm, nước dừa mới được chứng minh chứa zeatin (Letham, 1974). Khi nuôi cấy Lan, nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegaty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961). Với Dendrobium, nước dừa không ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của phôi ở các giai đoạn đầu nảy mầm (Kotomori và Murashige, 1965). Một số trường hợp khác, phôi Phalaenopsis lại tăng sinh mô sẹo và chậm phát s