Khóa luận Phân biệt các loại thịt heo, bò, cừu bằng phương pháp Multiplex PCR

cần phải có lƣợng mẫu đủ lớn để có thể nhận diện màu. 2.4.3 Protein array Protein array là phƣơng pháp sử dụng một loại hạt hình cầu (hay slide) để xác định đồng thời nhiều phản ứng trong cùng một ống nghiệm hay giếng nhỏ có chứa mẫu. Phát hiện mẫu nhờ các chất nhuộm huỳnh quang có trong hạt cầu đƣợc kích thích. Độ nhạy của tín hiệu biểu thị cho lƣợng mẫu đích. Phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm: Cho phép phát hiện cùng lúc hàng trăm chỉ tiêu trong cùng một giếng mẫu. Độ lặp lại cao. Không cần lƣợng mẫu lớn. Độ chuyên biệt cao. Tuy nhiên, phƣơng pháp hiện đại với các thiết bị tiên tiến, đắt tiền đo đó ở Việt Nam chƣa có điều kiện ứng dụng rộng rãi kỹ thuật này vào trong các nghiên cứu (Trần Nhật Phƣơng, 2004). Hơn nữa cũng nhƣ ELISA, phƣơng pháp này khó có thể áp dụng đối với thịt đã xử lý nhiệt. 2.4.4 Điện di 2 chiều Phƣơng pháp điện di 2 chiều đƣợc xây dựng từ hai kỹ thuật phân tách sản phẩm theo 2 thành phần cấu thành của bản thân sản phẩm (điểm đẳng điện, khối lƣợng phân tử). Phƣơng pháp này có hai giai đoạn phân tách: giai đoạn đầu phân tách sản phẩm dựa vào điểm đẳng điện của phân tử protein mẫu; giai đoạn hai, sản phẩm đƣợc phân tách theo khối lƣợng phân tử (Rybicki và Purves, 2003). 10 Phƣơng pháp này có tính ứng dụng cao, cho phép phát hiện cùng lúc hàng ngàn polypeptide khác nhau với độ nhạy cao. Kết quả tốt nhất trên mẫu huyết thanh và dịch chiết tế bào (Garfin, 2000). Tuy nhiên, để kỹ thuật điện di 2 chiều đạt kết quả tốt cần phải có tay nghề kỹ thuật cao. Và cũng nhƣ hai kỹ thuật ELISA và protein array, kỹ thuật này không phù hợp để xác định protein của thịt đã xử lý nhiệt. 2.4.5. Giới thiệu chung về phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) Phƣơng pháp PCR là một công cụ đã trở nên phổ biến trong sinh học phân tử, đem lại một cuộc cách mạng trong công nghệ di truyền học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kỳ quan trọng cũng nhƣ các khám phá trƣớc đây về enzym cắt giới hạn và phƣơng pháp Southern blot. Phƣơng pháp này do K. Mulis cùng cộng sự phát minh năm 1985. Đây là một phƣơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích gen và hệ gen. Đối với các phƣơng pháp trƣớc đây khó khăn lớn nhất trong phân tích gen ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp, khổng lồ. Trong khi đó kỹ thuật PCR lại giúp chúng ta có thể tạo ra một số lƣợng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong muốn. Nhờ các ƣu điểm nổi trội trong nghiên cứu sinh học phân tử mà kỹ thuật PCR nhanh chóng đƣợc áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và cho kết quả chính xác. Mặt khác, sự phân tích thành phần và trật tự nucleotid trên phân tử DNA bằng phƣơng pháp PCR còn có ý nghĩa to lớn trong công tác phân loại các loài sinh vật. Thực chất đây là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào và nguyên tắc sẽ đƣợc trình bày sau đây. Nguyên tắc Nguyên tắc của phƣơng pháp là tạo lƣợng lớn các đoạn DNA đặc thù từ phân tử DNA khuôn dựa trên sự hoạt động của DNA – polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. 11 Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotid của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân lên để thiết kế hai đoạn mồi oligonucleotid. Hai đoạn mồi ngắn xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA, là tín hiệu chỉ hƣớng đi (5’ – 3’) của enzym DNA polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotid và ở hai đầu của mồi không kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung. Có đầy đủ 4 loại nuclotid tự do (dNTP): dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Enzym chịu nhiệt Taq polymerase. Dung dịch đệm. Ion Mg 2+ . Nƣớc tinh khiết không có enzym nuclease. Các bƣớc cơ bản của một chu kỳ phản ứng PCR: Bước 1: Biến tính (denaturation). Sợi DNA khuôn mạch đôi tách thành hai sợi DNA mạch đơn dƣới tác dụng của nhiệt độ cao khoảng 94 – 950C trong vòng 30 giây – 1 phút. Bước 2: Bắt cặp (hybridization) Nhiệt độ trong giai đoạn này đƣợc hạ thấp xuống khoảng 37 – 680C tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy (Tm) của cặp mồi sử dụng để đoạn mồi bắt cặp với sợi DNA khuôn. Thời gian cho giai đoạn này kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Bước 3: Kéo dài (elongation) Nhiệt độ đƣợc tăng đến 720C giúp cho enzym polymerase hoạt động tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với mạch khuôn từ vị trí bắt cặp của đoạn mồi. Thời gian của giai đoạn kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Một chu kỳ gồm ba bƣớc trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lƣợng mẫu của lần trƣớc. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân, theo tính toán sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lƣợng mẫu ban đầu. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR DNA mẫu Phản ứng PCR tối ƣu xảy ra khi đoạn DNA khuôn mẫu không đƣợc quá dài, 12 thƣờng khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1 – 1,5 kb. Phƣơng pháp này cũng cho phép xác định DNA với một lƣợng thấp, khoảng nhỏ hơn 100 ng (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999). Tính trung thực của DNA polymerase không những phụ thuộc vào mức độ sai sót của bản thân enzym này mà còn phụ thuộc vào số bản sao ban đầu của DNA mẫu (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999). Lƣợng bản sao của DNA mẫu ban đầu quá lớn sẽ gây ra sai số cao trong quá trình sao chép. Sai số ngẫu nhiên trong vài chu kỳ đầu sẽ lan rộng đến những chu kỳ sau. Do đó, việc giảm lƣợng DNA mẫu ban đầu còn hạn chế đƣợc các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn. Mẫu DNA tinh sạch sẽ cho kết quả tốt nhất, tuy nhiên nhiều kỹ thuật PCR vẫn đạt kết quả tốt đối với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Thậm chí phƣơng pháp PCR còn cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không đƣợc bảo quản tốt, đã bị phân hủy nhƣ vết máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay ngƣời chết,... (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002). Enzym DNA polymerase Hiệu quả của phƣơng pháp phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của enzym polymerase (vì phản ứng PCR luôn phải thực hiện ở những nhiệt độ khác nhau). Phƣơng pháp PCR chuyển sang bƣớc ngoặc mới với việc phát hiện enzym taq polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn (Thermus aquaticus) phân lập từ suối nƣớc nóng nên chịu đƣợc nhiệt độ cao. Enzym này không bị biến tính ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng tạo ra các sản phẩm DNA tinh sạch. Điều này cho phép tự động hóa tất cả các bƣớc của chu trình nhân bản DNA. Từ đó máy luân nhiệt PCR ra đời và có khả năng điều khiển cả về nhiệt độ lẫn thời gian (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999). Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác cũng đã đƣợc đƣa ra thị trƣờng với nhiều chức năng hoàn thiện hơn. Tth polymerase hoạt động nhƣ một enzym phiên mã ngƣợc khi có mặt RNA khuôn và ion Mn++. Tth pol lại xúc tác phản ứng tổng hợp cDNA trên bản mẫu RNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002). 13 Tuy vậy trong phản ứng PCR, nếu DNA Taq polymerase quá dƣ thừa, chúng ta sẽ thấy hiện tƣợng tổng hợp DNA do phản ứng giả của mồi trên dây đơn. Hầu hết ở các quy trình, ngƣời ta khuyến cáo nồng độ Taq nên sử dụng là 0,5 UI/25 l để kiểm soát tính chuyên tính của phản ứng và không nên sử dụng nồng độ cao hơn 2,5 UI/25 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Mồi Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng và có hiệu quả cao nhất. Chọn mồi là một công việc rất quan trọng quyết định thành công của phƣơng pháp và công việc đó phải dựa theo một số nguyên tắc sau đây: Chọn trình tự mồi xuôi và mồi ngƣợc sao cho chúng không bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi. Mồi phải đặc hiệu đối với DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình tự khác trên gen. Trình tự nằm giữa mồi xuôi và ngƣợc không đƣợc quá lớn, khoảng dƣới 1kb là tốt nhất và phản ứng PCR sẽ không cho kết quả tốt nếu đoạn khuếch đại lớn hơn 3 kb. Độ dài mồi cần chọn khoảng 18 – 30 nucleotid. Nếu mồi dài hơn 30 nucleotid sẽ ảnh hƣởng đến sự tổng hợp ở bƣớc 3. Trong trƣờng hợp tiến hành trên những DNA đƣợc dòng hóa nhƣ cosmid thì mồi cần dùng sẽ có chuỗi mã ngắn khoảng 10 nucleotid. Nhiệt độ bắt cặp của mồi xuôi và ngƣợc không đƣợc quá cách biệt, thông thƣờng trong khoảng 4 – 50C. Thành phần nucleotid của các mồi phải cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần. Công thức tính nhiệt độ bắt cặp của mồi trong trƣờng hợp có khoảng 20 nucleotid là: Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Trong đó: A, T, C, G là thành phần các nucleotid của đoạn mồi. Tuy nhiên, việc tính toán này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta phải điều chỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu đƣợc tần suất đa hình cao 14 nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện thí nghiệm nhiều lần chúng ta mới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ bắt cặp của mồi. Dung dịch đệm Môi trƣờng đệm KCl đã và đang đƣợc áp dụng là một dung dịch đệm rất hữu hiệu cho kỹ thuật PCR. Ngoài ra còn có dung dịch điệm NaCl dùng cho việc khuếch đại những đoạn DNA giàu GC và amonium sulphate cho những sản phẩm PCR có trọng lƣợng phân tử thấp (Holm và ctv, 1991). pH của dung dịch đệm cũng đƣợc xem xét kỹ trong kỹ thuật PCR. Hầu hết các dung môi phản ứng đƣợc đệm trong môi trƣờng Tris – HCl ở pH = 8,3. Những hoạt chất ổn định enzym (enzym stabilizers) cũng đƣợc chú ý nhƣ: gelatin (0,01%), Triton X – 100 (0,1% (v/v)) trong những dung dịch đệm để tồn trữ enzym. Có trƣờng hợp ngƣời ta sử dụng cả hai làm dung dịch điệm. Ion Mg2+ Một trong những ảnh hƣởng có tính chất quyết định đến sự chuyên biệt và hiệu quả của phản ứng PCR là nồng độ Mg2+. Môi trƣờng có tính chất ion cao sẽ làm cho dung dịch đệm trở nên năng động rất nhiều. Do đó nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra những ảnh hƣởng rất lớn. Nồng độ Mg2+ cao sẽ làm cho phân tử DNA mạch đôi ổn định hơn nhƣng đồng thời ngăn cản sự biến tính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kì và do đó làm giảm sản phẩm PCR tạo ra. Ngoài ra lƣợng Mg 2+ dƣ còn làm tăng hiện tƣợng bắt cặp giả tạo ra những sản phẩm không mong muốn với số lƣợng khá lớn. Ngƣợc lại nếu nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 M), sẽ ảnh hƣởng xấu đến quá trình kéo dài vì Mg2+ đóng vai trò là co-factor của Taq polymerase. Một vài ion Mg 2+ sẽ đƣợc kẹp giữ bởi dNTP trong phản ứng. Vì vậy cần phải tỷ lệ thích hợp giữa dNTP và Mg2+ . Nucleotid Cần phải có cả bốn loại nucleotid dạng triphophat: dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Ngƣời ta khuyến cáo rằng mỗi loại deoxynucleotid đƣợc sử dụng là 200 M. 15 Phải giữ cho nồng độ của tất cả các deoxynucleotid luôn bằng nhau, để tránh sự gắn kết nhầm lẫn. Thời gian và số chu kỳ Phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn, giai đoạn đầu số lƣơng bản sao tăng theo cấp số nhân nhƣng sau đó hiệu quả khuếch đại giảm dần vì một số nguyên nhân sau: Cạn kiệt các thành phần phản ứng, nhất là sự giảm nồng độ các nucleotid. Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. Các bản sao vừa mới đƣợc tổng hợp không bắt cặp với mồi mà bắt cặp với nhau. Ngoài ra, số lƣợng chu kì còn phụ thuộc vào số lƣợng bản sao ban đầu, nếu số lƣợng ban đầu là 105 thì thực hiện 25 – 30 chu kì, còn số lƣợng mẫu là 102 – 103 thì phải thực hiện 30 – 40 chu kì (Trần Thị Xô và Nguyễn Thị Lan, 1999). Thiết bị và dụng cụ Thực chất thiết bị và dụng cụ để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng đƣợc nhu cầu thay đổi nhiệt độ nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã đƣợc cải thiện tối đa để tránh sự bốc hơi nƣớc trong quá trình phản ứng và cho phép tiến hành phản ứng PCR ngay trên mô và tế bào... Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị đều có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần đƣợc tiến hành cùng một chủng loại thiết bị. Hơn nữa ống nghiệm dùng cho các phản ứng của cùng một thí nghiệm phải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của của các ống này cũng nhƣ độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hƣởng lớn đến quá trình khuếch đại (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002). Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng PCR Ưu điểm của phản ứng PCR Thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém. 16 Không đòi hỏi mẫu phải tinh sạch cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ). Nhược điểm của phản ứng PCR Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotid của đoạn DNA cần khuếch đại, hay ít nhất cũng phải biết trình tự hai đầu của phân tử DNA. Chỉ khuếch đại những phân tử DNA có kích thƣớc nhỏ hơn 3 kb, tốt nhất là 1 kb. Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dƣơng tính giả). Ứng dụng của kỹ thuật PCR Do có khả năng khuếch đại một lƣợng DNA cực nhanh và chuyên biệt nên kỹ thuật PCR đƣợc áp dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực (Nguyễn Văn Uyển, 1995): - Sản xuất các mẫu dò. - Ứng dụng trong khuếch đại DNA, RNA. - Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền. - Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh. 2.4.6 Nguyên tắc multiplex PCR Multiplex PCR là phản ứng PCR cho phép phát hiện cùng lúc nhiều gen của một sinh vật hay nhiều sinh vật khác nhau bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau trong một phản ứng. 2.5 Các công trình nghiên cứu về phát hiện loài trong thịt chế biến bằng phƣơng pháp multiplex PCR Hơn một thập kỉ qua, sau khi ra đời phƣơng pháp PCR nói chung và multiplex PCR nói riêng đã đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện hay phân biệt DNA các sinh vật khác nhau từ nhiều nguồn mẫu. Vì vậy phƣơng pháp multiplex PCR cũng đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong việc phân biệt loài động vật trong thịt chế biến. Năm 1997, Wayne và ctv đã có công trình nghiên cứu về trình tự mtDNA dài2001 bp của 23 dòng chó. Kết quả nghiên cứu cho thấy trên mtDNA có trình tự bảo toàn cho cả 23 dòng chó. 17 Tại Hoa Kỳ, Sawyer (1997) đã tìm ra một phƣơng pháp nhanh và nhạy để xác định và ngăn chặn tình trạng nhập khẩu bò nhiễm BSE. Tác giả đã xây dựng quy trình PCR phát hiện thịt bò trong thịt và bột thịt xƣơng dựa trên đoạn gen bảo tồn của mtDNA bò (B – mtDNA). Năm 1998, Matsugana đã công bố công trình nghiên cứu phát hiện 6 loại thịt (bò, heo, gà, cừu, dê, ngựa) từ thịt chế biến. Tác giả sử dụng 7 đoạn mồi với tỉ lệ thích hợp để phát hiện DNA chuyên biệt cho từng loài. Mồi xuôi đƣợc thiết kế dựa trên trình tự DNA bảo toàn của gen mtDNA, còn mồi ngƣợc đƣợc thết kế dựa vào trình tự chuyên biệt ở mỗi loài. Các cặp mồi này cho các sản phẩm PCR có kích thƣớc khác nhau tƣơng ứng với 6 loại thịt. Các đoạn DNA của dê, gà, bò, cừu, heo, ngựa lần lƣợt có khích thƣớc: 157, 227, 274, 331, 398, 439 bp. Kết quả PCR đƣợc quan sát bằng điện di. DNA của dê, gà, bò, cừu, heo đƣợc phát hiện cả đối với DNA tách chiết từ thịt xử lý nhiệt ở 1000C hay 1200C, riêng đối với thịt ngựa thì không phát hiện đƣợc ở 1200C. Giới hạn nhỏ nhất của nồng độ DNA mà phản ứng PCR còn phát hiện đƣợc là 0,25 ng. Năm 2000, Montiel-Sosa và ctv đã thiết kế cặp mồi có tính chuyên biệt cao trên đoạn bảo tồn của gen mtDNA. Cặp mồi này đƣợc dùng để khuếch đại đoạn DNA dài 531bp của gia cầm bằng phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này tỏ ra hữu dụng đối với cả thịt tƣơi và hỗn hợp thịt chế biến bao gồm thịt phơi khô và thịt nấu chín từ bò, cừu, gà. Năm 2004, Myers và ctv cũng đã dựa vào đoạn mtDNA để thiết lập phản ứng multiplex PCR nhằm phát hiện thịt các loài bò, heo, cừu, dê, ngựa trong thức ăn chó. Giới hạn DNA để phát hiện là 1 g/kg. Kết quả cho thấy chỉ có 27 mẫu trong tổng số 31 mẫu là chứa thịt bò và heo (các mẫu thức ăn chó đƣợc ghi trên nhãn là chỉ gồm thịt bò và heo). 18 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung thực hiện (1) Tách chiết DNA từ thịt tƣơi và thịt xử lý nhiệt ở: 800C/15’, 1200C/15’, 120 0C/30’, 1300C/15’. (2) Thực hiện phản ứng single PCR (s-PCR) đối với DNA từ ba loại thịt tƣơi (heo, bò, cừu) để làm cơ sở cho phản ứng multiplex PCR (m-PCR). (3) Tối ƣu hóa quy trình m-PCR để xác định loại thịt trong hỗn hợp thịt tƣơi xay nhuyễn. (4)Thực hiện phản ứng s-PCR đối với DNA từ thịt xử lý ở nhiệt độ: 800C/15’, 120 0C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’. (5) Thực hiện phản ứng m-PCR để xác định ba loại thịt heo, bò, cừu. Thực hiện phản ứng m-PCR đối với hỗn hợp DNA heo, bò, cừu có nồng độ của DNA bò, cừu giảm dần để xác định ở nồng độ nào phản ứng m-PCR vẫn còn phát hiện đƣợc hai loài này. Thực hiện phản ứng m-PCR với hỗn hợp thịt đã xử lý ở các nhiệt độ 80 0C/15’, 1200C/15’, 1200C/30’, 1300C/15’. (6) Thực hiện phản ứng m-PCR phát hiện thịt heo, bò, cừu trong bột thịt. 3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 01-02-2007 đến ngày 30-07-2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 19 3.3 Vật liệu 3.3.1 Nguồn mẫu tách chiết DNA Mẫu cơ vân đƣợc lấy từ thịt heo, bò, cừu mua ở siêu thị Metro TP. Hồ Chí Minh. Mẫu bột xƣơng thịt sử dụng trong thức chế biến thức ăn gia súc của các hãng CE, A, VY. 3.3.2 Đoạn mồi Matsugana và ctv (1998) đã xác định đƣợc trình tự bảo toàn trên gen mtDNA, dựa vào trình tự này tác giả đã thiết kế đoạn mồi xuôi chung cho DNA thịt heo, bò, cừu. Đoạn mồi này đƣợc kí hiệu là FSIM: 5’– GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA – 3’ Tuy nhiên ở mỗi loài thú khác nhau sẽ có những trình tự trên gen mtDNA khác nhau, từ đó tác giả cũng đã thiết kế mồi xuôi cho từng loại gia súc heo, bò, cừu, đƣợc kí hiệu lần lƣợt là: RP, RB, RS: RP: 5’ – GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA – 3’. RB: 5’ – CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG – 3’. RS: 5’ – CTATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA – 3’. 3.3.3 Hóa chất 3.3.3.1 Hóa chất dùng trong tách chiết DNA Tris-HCl, NaCl, SDS, EDTA, proteinase K, sodium acetate, isoamyl alcohol, phenol, chloroform, ethanol, TE 1 X. 3.3.3.2 Hóa chất dùng trong điện di Agarose, TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH = 8,3), loading dye 6 X, ladder 100bp, 200bp, ethidium bromide. 20 3.3.3.3 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR Taq DNA polymerase: 5UI/µl (Promega), dung dịch đệm 10X (Promega), dNTP 25 mM (Promega), MgCl2 25 mM (Promega), 4 đoạn mồi (khuếch đại gen mtDNA ở heo, bò, cừu), nƣớc cất 2 lần (khử ion, hấp vô trùng, chiếu UV, pH 6,8 –7). 3.3.3.4 Thiết bị và dụng cụ Tủ sấy (Jencons - PLS), water bath (Memmert), autoclave (Tommy), máy cất nƣớc (khử ion) (Branstead), máy ly tâm (Mikro Z2K/Sigma 3K30C), tủ trữ mẫu và hóa chất (Reetech, Brandt, Sanyo), máy chụp gel (Biorad), máy luân nhiệt (Eppendorf, version 2.11.32), bộ điện di (Biorad), máy đo OD (Hewlett Packard), micropipet, đầu tip, eppendorf, kéo, chày, kẹp… 3.4 Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu Mua 500 g mỗi loại thịt bỏ vào túi nilon sạch kích thƣớc 5 x 10 cm, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thí nghiệm, trữ ở –700C. 3.4.2 Phối hợp các loại thịt để tạo hỗn hợp thịt và xử lý nhiệt Mỗi loại thịt, lấy khoảng 150 g đem nghiền nhuyễn bằng máy nghiền mẫu. Sau đó đem cân và trộn các loại thịt với tỉ lệ thịt heo, bò, cừu giảm dần (bảng 3.1). Mỗi túi mẫu có khối lƣợng 20 g. 21 Bảng 3. 1 Tỷ lệ các loại thịt trong các hỗn hợp thịt STT Đơn vị tính Thịt heo Thịt bò Thịt cừu 1 % 50 50 0 g 10 10 0 2 % 50 0 50 g 10 0 10 3 % 50 25 25 g 10 5 5 4 % 80 10 10 g 16 2 2 5 % 90 5 5 g 18 1 1 6 % 98 1 1 g 19,6 0,2 0,2 Sau đó chia mỗi hỗn hợp thành 4 phần, bỏ vào các túi nilon chịu nhiệt có dán nhãn ghi rõ về thành phần, tỉ lệ, nồng độ và thời gian xử lí nhiệt. Hấp hỗn hợp thịt bằng nồi hấp autoclave ở các nhiệt độ và thời gian: 800C/15 phút, 1200C/15 phút, 120 0C/30 phút, 1300C/15 phút. Làm nguội và trữ lạnh ở - 700C cho đến khi sử dụng. 3.4.3 Tách chiết DNA * Qui trình tách chiết Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng, tách chiết DNA theo dẫn liệu của Lƣơng Quý Phƣơng (2006). 1. Cho khoảng 0,1 g mẫu vào eppendorf 1,5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. 2. Cho vào 60 µl dung dịch đệm tách chiết (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA và 1% SDS, pH= 8) và 3 µl dung dịch protease K (20 mg/ml). Ủ hỗn hợp ở 55oC trong 1h. 22 3. Cho vào 375 µl nƣớc cất khử ion vô trùng; vortex 14000 vòng/phút trong 30 giây. Cho thêm 200 µl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); vortex 14000 vòng/phút trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC. 4. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào eppendorf 1,5 ml mới đã có sẵn 1 ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ – 20oC trong 1 giờ. 5. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10oC; lấy cặn làm ráo. 6. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10 oC, lấy cặn. 7. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC. 8. Hòa tan cặn bằng 200 µl dung dịch TE; ủ 55oC trong 2 giờ. Sản phẩm DNA sau khi tách chiết đƣợc trữ ở – 20oC hoặc sử dụng ngay. Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Hàm lƣợng DNA đƣợc ƣớc lƣợng theo công thức DNA (ng/μl) = 62,9*OD260nm – 36*OD280nm. Các mẫu DNA tách chiết có tỷ số OD260 nm/OD280 nm (tỷ số OD) trên 1,6 đƣợc sử dụng cho PCR. Sau khi đo OD, chúng tôi pha loãng mẫu đến nồng độ 100 ng/ l. Kết quả OD đƣợc xử ký bằng phần mền Statgraphics Version 7.0. 3.4.4 Thực hiện phản ứng s-PCR Để tìm quy trình PCR phù hợp cho việc xác định 3 loại thịt heo, bò, cừu trong hỗn hợp thịt, đầu tiên chúng tôi thử nghiệm phản ứng s-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998). Thành phần phản ứng đƣợc trình bày trong bảng 3.2 và bảng 3.3 23 Bảng 3. 2 Thành phần hóa chất PCR Tên hóa chất Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 1X MgCl2 1,5 mM FSIM 0,4 M reversal Tùy mỗi loại thịt (bảng 3.3) dNTP 200 µM/mỗi loại Taq 1,25 UI DNA mỗi loại 100 ng /phản ứng H2O cất vừa đủ 50 µl Bảng 3. 3 Nồng độ mồi ngƣợc đối với mỗi loại thịt trong s-PCR Tên mồi Nồng độ mồi ( M) RP 0,24 RB 0,24 RS 1,2 Và có chu trình nhiệt nhƣ bảng 3.4. Bảng 3. 4 Chu trình nhiệt của phản ứng Giai đoạn Diễn giải Nhiệt độ 1 Tiền biến tính 940C trong 4 phút 2 Lặp lại 35 chu kỳ Biến tính Bắt cặp Kéo dài 94 0 C trong 30 giây. 60 0C trong 30 giây 72 0C trong 30 giây 3 Kéo dài cuối cùng 720C trong 5 phút 24 3.4.5 Tối ƣu hóa phản ứng m-PCR 3.4.5.1 Thực hiện m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998) Đầu tiên, chúng tôi thực hiện phản ứng m-PCR theo quy trình của Matsugana và ctv (1998). Thành phần phản ứng đƣợc trình bày ở bảng 3.5. Bảng 3. 5 Thành phần hóa chất PCR Tên hóa chất Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 1X MgCl2 1,5 mM FSIM 0,4 M RP 0,24 M RB 0,24 M RS 1,2 M dNTP 200 µM/mỗi loại Taq 1,25 UI DNA tổng số (hỗn hợp heo, bò, cừu) 100 ng /phản ứng H2O cất vừa đủ 50 µl Chu trình nhiệt của phản ứng tƣơng tự bảng 3.4 Chúng tôi thực hiện lặp lại 3 lần để khẳng định quy trình. 3.4.5.2 Thí nghiệm điều chỉnh thành phần phản ứng Để tối ƣu hóa phản ứng PCR, trƣớc tiên chúng tôi thực hiện việc giảm thể tích phản ứng xuống còn 30 l và giữ nguyên nồng độ cuối nhƣ bảng 3.5. Sau đó, chúng tôi chỉnh lại nồng độ Mg2+ (lên 2 mM thay vì 1,5 mM) để tăng độ hoạt động của Taq polymerase. 3.4.5.3 Thí nghiệm điều chỉnh chu trình nhiệt Giảm nhiệt độ bắt cặp từ 600C xuống 560C và 540C đồng thời giữ nguyên thời gian của chu trình nhiệt. 25 Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống còn 540C và tăng thời gian lúc biến tính, bắt cặp và kéo dài (bảng 3.6) Bảng 3. 6 Chu trình nhiệt của phản ứng trƣớc và sau khi điều chỉnh Giai đoạn Chu trình nhiệt chƣa điều chỉnh Chu trình nhiệt đã điều chỉnh Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Biến tính 940C 30 giây 940C 1 phút Bắt cặp 600C 30 giây 540C 45 giây Kéo dài 720C 30 giây 720C 1 phút 3.4.5.4 Thí nghiệm điều chỉnh nồng độ mồi trong 1 phản ứng Giảm nồng độ mồi của loại thịt có sản phẩm PCR đậm và rõ để loại trừ việc mồi tác dụng mạnh ức chế mồi tác dụng yếu - giảm RS (bảng 3.7). Bảng 3. 7 Điều chỉnh nồng độ mồi RS (giảm) Tên mồi Nồng độ mồi gốc ( M) Điều chỉnh lần 1 ( M) Điều chỉnh lần 2 ( M) Điều chỉnh lần 3 ( M) FSIM 0,4 0,4 0,4 0,4 RP 0,24 0,24 0,24 0,24 RB 0,24 0,24 0,24 0,24 RS 1,2 0,67 0,33 0,17 Tiếp tục giảm RS xuống còn 0,17 M đồng thời tăng RP (tăng nồng độ mồi của đối tƣợng không xuất hiện rõ band sản phẩm PCR) cụ thể đƣợc trình bày ở bảng 3.8. 26 Bảng 3. 8 Điều chỉnh nồng độ mồi RP (tăng) Tên mồi Nồng độ mồi gốc ( M) Điều chỉnh lần 4 ( M) Điều chỉnh lần 5 ( M) Điều chỉnh lần 6 ( M) Điều chỉnh lần 7 ( M) FSIM 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 RP 0,24 0,33 0,5 0,67 0,83 RB 0,24 0,24 0,24 0,24 0,24 RS 1,2 0,17 0,17 0,17 0,17 Sau khi tìm ra quy trình m-PCR thích hợp để phát hiện ba loại thịt heo, bò, cừu tƣơi, chúng tôi tiếp tục lặp lại phản ứng 3 lần để khẳng định tính ổn định của quy trình này. 3.4.6 Thực hiện phản ứng m-PCR hai loài (heo, bò và heo, cừu) ở các nồng độ DNA khác nhau Sau khi tìm ra quy trình m-PCR thích hợp, trƣớc tiên chúng tôi thử nghiệm phản ứng với hai đối tƣợng heo và bò, heo và cừu để xác định ở nồng độ nào DNA c