Khóa luận Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo Giberelin

g bảo quản khô ráo nấm tồn tại tới 3 năm. Ngoài ra nấm còn tồn tại trong đất, tuy thời gian không lâu. Một thí nghiệm ở Thái Lan (Kanjanosoon, 1965) cho thấy đất sau khi lây nhiễm nấm cho số cây bệnh là 93%, sau đó tỉ lệ bệnh giảm dần, tới 90 ngày chỉ còn 0,7% và sẽ không có cây bệnh nếu để sau 6 tháng. Đại bào tử hay khuẩn ty vách dày của nấm cũng sống được 4 tháng trong đất (S.H.Ou, 1985). Trên hạt và thân lúa nhiễm, nấm có thể sống 4 – 10 tháng ở nhiệt độ phòng, nếu trữ lạnh ở 7 C nấm có thể sống hơn 3 năm. 8 2.2 Đại cƣơng về nấm Gibberella fujikuroi (giai đoạn vô tính là Fusarium moniliforme) 2.2.1 Phân loại học Ngành: Ascomycota Ngành phụ: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes Lớp phụ: Hypocreomycetidae Bộ: Hypocreales Họ: Nectriaceae Giống: Gibberella Loài: Gibberella fujikuroi complex 2.2.2 Sơ lƣợc về Gibberella fujikuroi Năm 1931, Wollenweber đặt tên cho giai đoạn vô tính của nấm gây bệnh lúa von là Fusarium moniliforme (Sheldon) và giai đoạn hữu tính là Gibberella fujikuroi (Saw.) Wr. (B. Tudzynski, 1999) Theo Stefan Malonek và ctv (2005), phức hệ loài Gibberella fujikuroi bao gồm nhiều loài nấm gây bệnh quan trọng trên nhiều cây trồng khác nhau như ngô, lúa, lúa mạch, mía, thông, xoài, dứa, lúa miến… Giai đoạn vô tính trong phức hệ này thuộc giống Fusarium nhóm Liseola. Phức hệ loài này được chia thành ít nhất 9 loài hữu tính (sexually fertile biological species) (được biết như những quần thể giao phối, MP-A đến MP-I) và có 32 loài vô tính. Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu nhằm xác định loài trong phức hệ này như dựa vào hình thái, khả năng giao phối (mating experiment), phân tích cây phát sinh loài dựa trên trình tự DNA từ những loci không liên kết như tiểu đơn vị nhỏ của ti thể (mtSSU) rDNA, nuclear 28S rDNA, -tubulin, calmodulin, EF-1 , và histon H3 gen. Những kĩ thuật phân tử khác như RAPDs, mitochondrial RFLPs và CHEF-gel karyotypes cũng được dùng để phân biệt những thành viên trong phức hệ loài Gibberella fujikuroi. Ngoài ra những thành viên trong quần thể giao phối có nhiều kí chủ khác nhau và khác nhau về khả năng tạo ra các hợp chất thứ cấp như fumonisins, axít 9 Sơ đồ 2.1 Con đƣờng sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi. fusaric, fusaproliferin, moniliformin, fusarins và giberelin. Những dòng của những quần thể giao phối khác nhau sẽ tạo ra những chất thứ cấp khác nhau. Vì vậy những loài của MP-A, -C, -D và -G tạo ra fumonisins, MP-A, -C và F tạo ra moniliformin, beauvericin và fusaprolifern được MP-D và E tạo ra. Ngược lại, chỉ có loài F.fujikuroi (MP-C) có khả năng sản xuất giberelins (Stefan Malonek và ctv., 2005). 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi Theo Hiroshi Kawaide (2006), quá trình nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp giberelin có thể chia thành 3 bước như sau: Bước 1: ent-kaurene được tổng hợp từ isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate thông qua geranylgeranyl diphosphate (GGDP). Bước 2: chuyển ent-kaurene thành GA12-7-aldehyde dưới sự xúc tác của các enzyme cytochrome P450 monoxygenases. Bước 3: qua nhiều bước GA12-7-aldehyde sẽ tổng hợp thành GA3. (Nguồn www.aseanbiodiversity.info) 10 2.3 Giới thiệu về gen tef (translation elongation factor 1- ) Theo A.R.Pokalsky và ctv (1989), gen tef là gen mã hóa cho protein EF-1 . EF-1 là một chuỗi polypeptide có vai trò quan trọng trong sự kéo dài chuỗi polypeptide ở sinh vật nhân thật (eukaryotes). EF-1 xúc tác việc gắn nhóm aminoacyl tRNAs vào vị trí A của ribosome, phản ứng này đòi hỏi GTP. EF-1 có trọng lượng phân tử là 45.000 – 55.000. Nó cũng có chức năng tương đồng với EF-Tu (prokaryotic elongation factor), cả hai yếu tố này đều hình thành phức hợp aminoacyl tRNAs và GTP. Gen mã hóa EF-1 của nhiều loài đã được tạo dòng và được đọc trình tự. Đó là của các loài nấm men, tôm Artemia sanila, nấm Mucor racemosus và người. Tất cả những gen này mã hóa các protein có độ tương đồng cao so với những protein khác. Điều hòa sự biểu hiện EF-1 là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu do nó là một protein đa dạng và có vai trò quan trọng trong việc điều khiển sinh tổng hợp protein. Khi hoạt tính EF-1 tăng thì mô phát triển do có nhiều protein được tổng hợp. Tuy nhiên hoạt tính EF-1 được điều khiển ở mức mRNA hay protein vẫn chưa được biết rõ (A.R.Pokalsky và ctv., 1989). Dựa vào vùng gen tef có thể phân biệt được giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn vì chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhóm loài (Lại Hà Tố Hoa, 2006). (David M.Geiser và ctv., 2004) Sơ đồ 2.2 Bảng đồ vùng gen tef ở Fusarium trong FUSARIUM-ID. 11 2.4 Tổng quát về giberelins 2.4.1 Đại cƣơng về các chất giberelins Giberelins (GAs) là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin. Năm 1950 trong lúc nghiên cứu bệnh “foolish seedling” hay “bakanae disease” các nhà khoa học Nhật Bản thấy rằng bệnh gây ra bởi một chất hóa học do nấm tiết ra. Chất này được gọi là giberelin. Năm 1930, những nhà khoa học Nhật đã thành công trong việc thu tinh thể của hai hợp chất có hoạt tính tăng trưởng tiết ra từ nấm, chúng là giberelin A và B, nhưng do sự giới hạn về giao tiếp và chiến tranh thế thứ hai nên mãi đến giữa năm 1950 cấu trúc của chất này mới được xác định và được đặt là axít giberelic: (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Sau đó, năm 1956 ở Anh, J MacMillan lần đầu tiên đã tách thành công được giberelin từ hạt đậu Phaseolus vulgaris. Từ đó đến nay, người ta đã tách được những giberelin khác nhau trên nhiều loài cây. Ví dụ: Ở cây lúa chứa 14 loại giberelins, hạt ngô chứa 12 giberelins và lúa mì chứa 5 giberelins (Đào Văn Hoằng, 2005). Đặc điểm cấu trúc của tất cả giberelins có điểm chung là chúng được chuyển hóa từ ent-kaurene: Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic. Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 12 Sau khi axít giberelic đã được tìm hiểu khá rõ, các nhà thực vật học bắt đầu khảo nghiệm nó trên nhiều loài cây khác nhau. Có những phản ứng kì lạ được thấy ở sự tăng trưởng của những cây lùn và thực vật hoa thị (rosette plants), đặc biệt ở cây đậu Hà Lan lùn (Pisum sativum), cây ngô lùn (Zea mays) và nhiều cây hoa thị. Ngược lại, ở những cây đã có đặc tính di truyền cao thì sẽ không có đáp ứng cao hơn nữa khi dùng giberelins. Gần đây những thí nghiệm trên cây đậu Hà Lan lùn và cây ngô lùn chứng tỏ sự tăng trưởng tự nhiên của cây được điều hòa bởi giberelins. (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Không lâu sau khi phát hiện hiệu quả kích thích tăng trưởng của axít giberelic, những hợp chất giống giberelin được tách từ nhiều loài cây khác nhau. Hợp chất này có hoạt tính sinh học giống giberelin nhưng cấu trúc hóa học thì chưa được xác định. Khi ngày càng nhiều GAs từ nấm và thực vật được xác định, chúng được đánh số thứ tự là giberelin Ax (hay GAx) với x là thứ tự phát hiện ra chúng. Tất cả GAs dựa trên cấu trúc của ent-gibbrellane skeleton nhưng đối với từng chất lại có những thay đổi tinh vi làm cho hoạt tính của từng chất trở nên khác nhau. Axít giberelic (GA3) được sản sinh từ nấm Gibberella fujikuroi là giberelin được xác định cấu trúc đầu tiên và là giberelin quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất. Hiện nay có khoảng 136 loại giberelins được tách và xác định cấu trúc từ thực vật, nấm và vi khuẩn ( Mặc dù có nhiều Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 13 loại GAs trong cây nhưng chỉ có một vài GAs có hoạt tính như một hormon, tất cả những loại khác ở dạng tiền chất hay dạng bất hoạt. 2.4.2 Chức năng và vai trò sinh hóa (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Mặc dù GAs được phát hiện đầu tiên là nguyên nhân gây ra bệnh lúa von nhưng những GAs nội sinh cũng ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển của cây. Ngoài sự kéo dài của thân, GAs còn kích thích quá trình nảy mầm của hạt bao gồm phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt. Trong quá trình sinh sản của thực vật, giberelin có thể ảnh hưởng đến sự chuyển từ giai đoạn còn non sang giai đoạn trưởng thành cũng như bắt đầu ra hoa, xác định phái tính của hoa. 2.4.2.1 Giberelins kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị Giberelin được dùng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở nhiều loài cây. Tuy nhiên kích thích mạnh nhất được tìm thấy ở những cây lùn và cây hoa thị (rosette plant) cũng như những cây họ hòa thảo. GA3 ngoại sinh gây ra sự kéo dài thân ở những cây lùn bên cạnh đó chúng làm thân cây ốm yếu, giảm kích thước lá và lá có màu xanh nhạt. Dùng giberelin giúp thân cây hoa thị phát triển trong những ngày ngắn và sự phát triển thân bình thường được điều hòa bởi giberelin nội sinh. Ngoài ra nhiều cây hoa thị ngày dài đòi hỏi điều kiện lạnh cho sự phát triển của than, ra hoa và đòi hỏi này được khắc phục bởi việc dùng giberelin. GA cũng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở những cây hòa thảo (lúa nước là một ví dụ dễ thấy). Mặc dù GAs có tác động mạnh đến sự tăng trưởng của thân nhưng nó ít ảnh hưởng trực tiếp lên sự phát triển của rễ. Gần đây, người ta chưa biết rõ ảnh hưởng của Hình 2.7 GA3 kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 14 giberelin lên sự tăng trưởng của rễ một cách gián tiếp hay trực tiếp. 2.4.2.2 Giberelins điều hòa sự chuyển hóa cây con sang giai đoạn trƣởng thành Các nhà nghiên cứu thấy rằng nhiều cây lâu năm không ra hoa cho đến khi chúng đạt đến giai đoạn trưởng thành. Giai đoạn non và trưởng thành thường khác nhau về hình dạng lá như cây Thường Xuân ở Anh (Hedera helix), do đó việc dùng GAs cả hai hướng này phụ thuộc vào loài. GA3 có thể gây chuyển hóa từ giai đọan trưởng thành sang giai đoạn còn non ở cây Thường Xuân và việc dùng những GAs không phân cực như GA4 + GA7 có thể làm cho nhiều cây Tùng Bách non chuyển sang giai đoạn sinh sản. 2.4.2.3 Giberelins ảnh hƣởng đến giai đoạn bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính Giberelins có thể thay thế nhu cầu dài ngày hay khí hậu lạnh để ra hoa ở nhiều cây, đặc biệt cây hoa thị do vậy giberelin được dùng để kích thích ra hoa ở một vài cây. Ở cây có hoa lưỡng tính thì sự xác định giới tính hoa được điều hòa bởi giberelin. Tuy nhiên, nó cũng bị ảnh hưởng bởi những nhân tố môi trường như quang chu kì, dinh dưỡng và các nhân tố này có thể được trung hòa bởi giberelin. 2.4.2.4 Giberelins đẩy mạnh “fruit set” Dùng GAs có thể gây ra “fruit set” (quả bắt đầu tăng trưởng sau khi thụ phấn) và sự tăng trưởng của một vài quả mà auxin không có tác dụng. Ví dụ: giberelin kích thích “fruit set” ở cây táo (Malus sylvestris). 2.4.2.5 Giberelins thúc đẩy sự nảy mầm của hạt GAs cần cho một hay nhiều bước trong quá trình nảy mầm của hạt. Giberelin đánh thức quá trình ngủ nghỉ của hạt để bắt đầu nảy mầm. Khi hạt được ngâm vào nước giberelin được giải phóng, đánh thức và kích thích hạt nảy mầm. Ngoài ra giberelin còn kích thích sự tạo nhiều hydrolases, đặc biệt -amylase, kích thích tổng hợp chất truyền tín hiệu RNA cho các men, qua đó nó tác động lên men di truyền. Như vậy tác dụng sinh học của giberelin rất đa dạng tùy thuộc vào từng loại giberelin cũng như loài cây. 15 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thƣơng mại (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 2.4.3.1 Trong trồng trọt Sử dụng GAs chủ yếu để làm tăng chiều dài cuống của nho không hạt. Giberelin kích thích cuống phát triển dài hơn vì vậy làm cho quả phát triển lớn hơn và đẩy mạnh sự kéo dài của quả. Hỗn hợp benzyladenine (cytokinin) và GA4 + GA7 làm cho quả táo phát triển dài ra và được dùng để cải thiện hình dáng của quả táo loại ngon trong một vài điều kiện. Mặc dù việc xử lý này không làm tăng năng suất hay mùi vị, nó cũng được mong đợi để thương mại. Ở cây có múi, GAs làm chậm sự già yếu. 2.4.3.2 Sản xuất bia Một trong những ứng dụng quan trọng là dùng để tăng sản lượng mạch nha từ lúa mạch dùng làm rượu bia. GAs được sử dụng để làm nẩy mầm hạt lúa mạch gia tăng tạo ra enzym thủy giải những chất dự trữ trong hạt thành acid amin và đường để thành mạch nha. 2.4.3.3 Tăng sản lƣợng mía Mía (Saccharum officinarum) là một trong số ít cây dự trữ đường thay vì tinh bột (cây dự trữ đường quan trọng khác là củ cải đường). Có nguồn gốc từ New Hình 2.8 Ảnh hƣởng của GA3 đến giống nho không hạt của Thompson. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Có xử lý GA3 Không xử lý GA3 16 Guinea, mía có thể cao từ 4 – 6 m. Đường được dự trữ ở trung tâm không bào của tế bào mô đốt. Phun giberelin có thể tăng sản lượng mía lên 20 tấn trên mẫu và sản lượng đường 2 tấn trên mẫu. Kết quả này là do kích thích sự kéo dài của đốt trong suốt mùa đông. 2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật Phun GA4 + GA7 làm giảm mạnh thời gian tạo hạt. Ngoài ra đẩy mạnh hoa đực ở cây họ bầu bí và kích thích kéo dài thân cây củ cải đường (Beta vulgaris) và bắp cải (Brassica oleracea). Do tác dụng đa dạng của giberelin, người ta có thể căn cứ vào mục đích của từng trường hợp để sử dụng cho hiệu quả. Bản thân các chất giberelin không gây dị ứng cho da khi tiếp xúc, không nằm trong danh mục các chất gây ung thư hay chất độc do các tổ chức thế giới qui định. Vì vậy chúng được khuyến cáo sử dụng trong nông nghiệp. Ngày nay trên thế giới có rất nhiều chế phẩm thương mại của giberelin đang sử dụng như Activol, Berelex, Giberelin, Gibrel, Pro-gibb, Pro-gibb plus, regulex. Ở Việt Nam các giberelin cũng đã được sử dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng cây trồng: lúa, các loại rau quả, kích thích mủ cao su (Đào Văn Hoằng, 2005). 2.5 Sắc ký lớp mỏng 2.5.1Tổng quát về sắc ký lớp mỏng Sắc lý lớp mỏng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng, trong đó pha động là chất lỏng được cho đi qua một chất hấp thu trơ (ví dụ silicagel hay oxít nhôm), chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một lớp phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. Theo Nguyễn Xuân Dũng và ctv (1985) quá trình thực hiện sắc ký gồm các bước sau: Chuẩn bị bản mỏng Bản mỏng có thể là tấm kính, tấm nhôm hay tấm plastic có tráng một chất hấp thu trơ (silicagel hoặc oxít nhôm). Thông thường bản có kích thước 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, 20 x 20 cm. Đôi khi dùng vật kính cỡ 2,5 x 7,5 cm để phân tích nhanh. 17 Theo tiêu chuẩn Stahl bản có kích thước 10 x 20 cm và 20 x 20 cm. Bề dày của kính từ 2 – 4 mm. Nếu đế bản kim loại thì mỏng hơn nhiều. Dùng kính tốt nhất vì có thể rửa dễ dàng, sử dụng lại và đặc biệt có thể dùng các thuốc hiện ăn mòn mạnh hoặc tác dụng phá hủy mạnh. Nếu cần hiện sắc ký đồ ở nhiệt độ lớn hơn 150oC cần dùng để làm bằng loại thủy tinh bosilic. Đưa mẫu lên bản sắc ký Trước khi chấm mẫu lên bản phải vạch sẵn đường “mức xuất phát‟ cách đáy bản 1 cm và đường “mức tiền tuyến dung môi” cách đầu trên của bản 0,5 cm. Với bản bán sẵn, dùng viết chì vót nhọn vạch nhẹ; với bản tự tráng trong phòng thí nghiệm rất dễ tróc nên vạch cẩn thận và nhẹ nhàng bằng đầu nhọn của vi quản. Lượng chất và hỗn hợp chất đưa lên bản có ý nghĩa quan trọng đối với kết quả tách sắc ký, đặc biệt ảnh hưởng tới giá trị Rf. Lượng chất lớn làm cho vệt sắc ký lớn và thường kéo dài, các vệt của các chất có giá trị Rf gần nhau bị chồng chập. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạt của thuốc thử không cho phép. Nếu mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp còn nếu mẫu là chất rắn hòa tan mẫu bằng loại dung môi phù hợp (ví dụ như ete, cloroform, nước) để mẫu phải tan hoàn toàn. Dung môi dùng hòa tan mẫu để chấm lên bản là loại dung môi càng dễ bay hơi; càng ít phân cực càng tốt. Nếu dung môi dùng để hòa tan mẫu được hấp thu mạnh lên lớp mỏng thì khi dung môi giải ly đi ngang qua vết chấm tại mức xuất phát, dung môi giải ly sẽ gây nên những vết bất thường dẫn đến các vết tách được sẽ bị biến dạng nghiêm trọng. Nhúng nhẹ phần đầu nhọn vi quản vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản. Chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên bản mỏng, tại một điểm, ở mức xuất phát (đối với các dung dịch nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trước khi đưa lên bản hoặc có thể làm giàu trực tiếp lên bản bằng cách chấm nhiều lần ở đúng một vị trí, chờ chấm trước khô mới chấm chấm sau). Nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm vào bề mặt của lớp mỏng, tránh không làm thủng lỗ trên bề mặt này. Chạm vào và lấy vi quản ra thật nhanh để dung 18 dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm tròn nhỏ. Thổi hoặc dùng máy sấy tóc để sấy nhẹ giúp dung môi bay hơi mau, không lan thành vết to. Nếu cần chấm nhiều dung dịch khác nhau lên cùng một tấm bản, các vết cách đáy bản 1 cm; vết này cách vết kia 1 cm; các vết nên cách bờ cạnh của bản 1 – 1,5 cm (để tránh hiệu ứng bờ). Vi quản được sử dụng trở lại sau khi rửa bằng aceton. Sau khi chấm xong nên dùng máy sấy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm rồi mới nhúng bản vào dung dịch ly giải. Khai triển sắc ký đồ là quá trình tách các cấu tử trên lớp mỏng. Trước khi đặt bản vào trong bình, bình cần được bảo hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách khi ta rót dung môi vào bình cần để một tờ giấy lọc áp sát thành bình và sát đáy bình được tẩm dung môi. Kích thước của bình và thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể. Nếu bình không được bão hòa dung môi thì khi dung môi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm do dung môi đi ở bên cạnh nhanh hơn ở giữa bản. Sau khi mẫu đã được chấm lên bản ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai có kích thước phù hợp (bản phải thẳng đứng hoặc hơi nghiêng một góc nhỏ hơn 15 độ so với đường thẳng đứng), dung môi trong bình phải ngập bản 0,5 cm, tối đa 0,7 cm, nghĩa là cách điểm xuất phát 0,8 – 1 cm. Một hệ dung môi dung ly phù hợp là hệ sau khi giải ly sẽ cho vết chính có giá trị Rf từ 0,3 đến 0,7. Tùy theo hướng chuyển động, cách chuyển động, thành phần dung môi có thể có các cách khai triển sắc ký đồ sau: + Khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển lên. + Khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển xuống. + Khai triển hai chiều. Hiện sắc đồ: đối với những chất được sắc ký không màu hoặc màu rất nhạt, thì sau khai triển ta phải hiện sắc đồ bằng phương pháp hóa học hoặc quang học, phóng xạ đối với các đồng vị phóng xạ. 19 Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC Dụng cụ chuẩn bị TLC Chấm mẫu lên bảnTLC Chuẩn bị quá trình ly giải Quá trình ly giải Phát hiện vết trên đèn UV Phun thuốc thử thích hợp lên bản, rồi sấy 120o/5’ Hình 2.9 Sơ đồ các bƣớc thực hiện TLC. 20 2.5.2 Ƣu điểm của sắc ký lớp mỏng Cần ít mẫu. Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích. Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích sẽ có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi hấp thu rộng và lài nên khó phân biệt được đó là một mũi để chỉ sự hiện diện của một chất hay chỉ là tạp bẩn. Sau quá trình giải ly dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bản mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hay hóa học để phát hiện sự hiện diện chất nên không phải nghĩ đến vấn đề hậu sắc ký như ở HPLC. 2.5.3 Một số ứng dụng thông thƣờng của TLC Xác định thành phần các chất trong hỗn hợp. Xác định tính đồng nhất của hai chất. Theo dõi quá trình phản ứng. Xác định hiệu quả của một qui trình tinh sạch của một chất. Xác định điều kiện thích hợp cho sự phân phân tách của sắc ký cột. Theo dõi quá trình sắc ký cột. 2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài nấm Kỹ thuật PCR là kỹ thuật sử dụng những cặp mồi “oligonucleotide” để khuếch đại một đoạn DNA đặc biệt nào đó trong một qui trình có tính chất tự động hóa. Có rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu khoa học cũng như trong thương mại. Trong đó kỹ thuật PCR đặc biệt có ý nghĩa quan trọng đối với các nhà Bảo vệ Thực vật vì kỹ thuật này giúp họ định danh đúng tên loài sinh vật gây bệnh một cách chính xác mà điều này khó thực hiện được nếu dựa vào hình thái và khả năng tạo độc tố của nấm. Bên cạnh đó phản ứng PCR thì nhanh và nhạy hơn các kỹ thuật vi sinh khác. Phản ứng vẫn tiến hành tốt với một lượng mẫu rất ít và không cần đến sự có mặt của vi sinh vật. Điều đó được 21 Kamel A. Abd-Elsalam và ctv (2003) chứng minh khi thực hiện phản ứng PCR bằng cặp mồi ITS-Fu-f và ITS-Fu-r và phản ứng này vẫn nhạy khi nồng độ DNA của F. oxysporum trong khoảng 10 ng – 100 fg. Ví dụ: Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng gen tef của các loài nấm thuộc giống Fusarium bằng cặp mồi ef1-ef2 để tạo nền tảng cho việc định danh đúng các loài thuộc giống này đặc biệt là các loài thuộc phức hệ Gibberella fujikuroi, phức hệ F.solani, F.oxysporum và những loài tạo trichothecene loại A và B (David M. Geiser và ctv., 2004). 22 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến 08/2007. 3.1.2 Địa điểm thực hiện Phân lập và tách đơn bào tử tại phòng bệnh cây, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Nhân sinh khối nấm Fusarium moniliforme tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Ly trích DNA tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Tiến hành PCR tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. Tiến Hành Sắc Ký Lớp Mỏng tại Phòng Hóa Lý – Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 23 3.2 Vật liệu nghiên cứu Bảng 3.1 Các dòng nấm Fusarium moniliforme đƣợc thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long trong tháng 02/2007 và tháng 05/2007. STT Kí hiệu các dòng nấm F.moniliforme Giống Lúa Địa điểm lấy mẫu 1 FM1 Jasmine 85 Thốt Nốt – Cần Thơ 2 FM2 Jasmine 85 Ô Môn – Cần Thơ 3 FM3 OM 2517 Cờ Đỏ - Cần Thơ 4 FM4 OM 2518 Ô Môn – Cần Thơ 5 FM5 OM 2518 Châu Thành – An Giang 6 FM6 Jasmine 85 Châu Phú – An Giang 7 FM7 OM 2517 Chợ Mới – An Giang 8 FM8 OM 2514 Thoại Sơn – An Giang 9 FM9 OM 2517 Càng Long – Trà Vinh 10 FM10 Jasmine 85 Châu Thành – Trà Vinh 11 FM11 OM 504 dòng 2 Tiểu Cần – Trà Vinh 12 FM12 OM 4698 Càng Long – Trà Vinh 13 FM13 Jasmine 85 Mỹ An – Đồng Tháp 14 FM14 OM 2518 Tháp Mười – Đồng Tháp 15 FM15 OM 4655 Châu Thành – Đồng Tháp 16 FM16 OM 2517 Mỹ An – Đồng Tháp 17 FM17 OM 4698 Châu Thành – Kiên Giang 18 FM18 Jasmine 85 An Biên – Kiên Giang 19 FM19 OM 1490 Tân Hiệp – Kiên Giang 20 FM20 OM 2517 Châu Thành – Kiên Giang 24 3.3 Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, que cấy các loại, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, nồi hấp, tủ sấy, máy lắc, bông gòn không thấm, bút lông, giấy thấm, máy khuấy từ, cá từ. Môi trường agar nước (Water agar), PDA (Potato dextrose agar), môi trường nhân sinh khối. Nước cất. *Cách pha môi trường nhân sinh khối Thành phần môi trường nhân sinh khối chứa trong một lít nước gồm: Glucose 20g KH2PO4 0,5g K2HPO4 0,5g MgSO4 0,5g Yeast extract 5g CaCl2 1 ít Cho hỗn hợp trên vào trong becher 1 lít khuấy cho tan hết bằng máy khuấy từ. Rót vào mỗi bình tam giác 100 ml. Đậy bình bằng nút bông và giấy bạc. Rồi đem hấp ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. *Cách pha môi trường agar nước (WA – water agar) Cho 20 g agar vào 1 lít nước cất đun sôi khuấy đều rồi đem hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 15 phút sau đó cho vào đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 15 ml. *Cách pha môi trường PDA Môi trường PDA là môi trường giàu cacbo hydrate chứa: Dextrose 20g Agar 15g Khoai tây 200g Nước 1 lít 25 Khoai tây bào vỏ, rửa sạch, thái nhỏ nấu khoảng 1 giờ. Lọc lấy nước trong. Cho vừa đủ lượng agar, nước và đường khuấy đều trong lúc nấu. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. 3.3.1.2 Phƣơng pháp phân lập nấm Nấm được phân lập từ mẫu lúa bệnh theo các bước sau: Mẫu đưa về phòng thí nghiệm khử trùng bằng cồn 70oC. Cắt mẫu bệnh thành những đoạn nhỏ có kích thước 3 – 5 mm sau đó ủ trên môi trường agar nước để hạn chế nhiễm khuẩn. Ủ 2 – 3 ngày lấy sợi nấm mọc trên mẫu bệnh sang môi trường WA. Ủ 2 ngày dùng dao cấy cắt miếng thạch có sợi nấm sang PDA. Thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm Fusarium moniliforme sau 5 – 7 ngày ủ. Tiến hành tách đơn bào tử của nấm. 3.3.1.3 Phƣơng pháp cắt đơn bào