Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật ở vườn quốc gia Cát Tiên

sinh hóa  Khảo sát hoạt tính Catalase Nguyên tắc: Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và giải phóng O2, gây hiện tượng sủi bọt khí. Thực hiện: Nhỏ vài giọt H2O2 lên khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển trên bề mặt thạch. Quan sát và ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí.  Khảo sát hoạt tính Oxydase Nguyên tắc: Cytochrome Oxydase là thành phần quan trọng trong chuỗi chuyển điện tử hô hấp, với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Hoạt tính này được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương. Thực hiện: dàn đều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD). Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương sau vài phút.  Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn Carbon Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng nguồn cung cấp carbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường. Do khi sử dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn 34 carbon của vi khuẩn được ghi nhận bằng sự đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Môi trường trung tính có màu xanh lá cây, môi trường acid có màu vàng, còn môi trường kiềm có màu xanh dương. Thực hiện: Chất cung cấp nguồn Carbon: acetate, betain, citrate, D-glucose, dimethylamine, ethanol, fructose, lactose, L-Abrabinose, L-glutamate, maltose, methylamine, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, Nutrient agar. Chất chỉ thị: bromothymol blue 0,04%. Pha môi trường khoáng MS và 2ml/l chất chỉ thị pH trong nhiều erlen khác nhau rồi hấp vô trùng, trong mỗi erlen bổ sung thêm 1% chất cung cấp nguồn Carbon bằng cách lọc vô trùng, chỉnh pH môi trường về pH =7. Bơm vào từng giếng của Microplate 1ml môi trường, đối với mỗi chất cung cấp carbon có thể sử dụng nhiều giếng khác nhau trong đó có 1 giếng đối chứng. Cấy 20µl dịch vi khuẩn vào các giếng của Microplate, trừ giếng đối chứng. Ủ ở 25-30OC trong 4-5 ngày và đọc kết quả: đặt microplate lên tờ giấy trắng. Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng (màu xanh lá cây).  Các thử nghiệm trong bộ sinh hóa IDS 14GNR IDS 14GNR là bộ kit 14 thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn Gram âm, được công ty Nam Khoa sản xuất nhằm giúp cho việc định danh các trực khuẩn Gram âm được nhanh chóng và dễ dàng hơn. Các thử nghiệm trong bộ kit IDS 14GNR bao gồm: Thử nghiệm lên men Glucose: các vi sinh vật có khả năng lên men đường Glucose sẽ tạo ra các sản phẩm có tính acid, làm thay đổi màu của chất chỉ thị bramothymol blue. Thử nghiệm khử nitrate: dựa trên sự tạo thành nitrite và cạn kiệt nitrate. Nitrite được tạo thành từ nitrate sẽ phản ứng với thuốc thử sulphanilamide và N- napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng đỏ. Ở 35 một số trường hợp phản ứng không rõ, cần kiểm chứng lại sự cạn kiệt nitrate bằng bụi kẽm kim loại. Thử nghiệm ONPG: Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự hiện diện của gen mã hóa enzyme –galactosidase trong tế bào. Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định dựa vào cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG). Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi –galactosidase sẽ phóng thích o-nitrophenol có màu vàng. Thử nghiệm urease: dựa trên khả năng tổng hợp enzyme urease, xúc tác sự thủy phân urea, giải phóng NH3 và CO2, làm tăng pH của môi trường, làm đổi màu chất chỉ thị Phenol-Red. Phản ứng (+) khi có màu đỏ cánh sen. Thử nghiệm khả năng biến dƣỡng citrate: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2, đồng thời phân giải muối ammonium, sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường, làm đổi màu của chất chỉ thị bromothymol blue. Thử nghiệm Bile Esculin: dựa trên khả năng thủy phân glucoside trong esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin phản ứng muối sắt trong môi trường tạo thành phức chất có màu đen hay màu nâu đen. Thử nghiệm khả năng sinh H2S: dựa trên khả năng khử hợp chất Sodium thiosulphate có trong môi trường để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra được phát hiện dựa vào phản ứng kết tủa màu đen FeS giữa H2S với ion Fe 2+ của chất chỉ thị Ferric ammonium citrate. Thử nghiệm khả năng sinh Indole: Tryptophan là một acid amine có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminpobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ. Thử nghiệm V-P (Voges-Proskauer): trong điều kiện có oxy và pH kiềm, 2,3-butanediol bị chuyển hóa thành acetonin, và acetonin tiếp tục bị oxy hóa thành 36 diacetyl dưới sự xúc tác của –naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Thử nghiệm khả năng biến dƣỡng Malonate: Các vi sinh có khả năng biến dưỡng manolate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự tăng trưởng của vi sinh vật trên môi trường chứa Manolate làm nguồn carbon duy nhất sẽ kéo theo việc sử dụng nguồn đạm này, làm phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường. Do vậy khả năng biến dưỡng manolate có thể được nhận thấy bằng sự chuyển màu của chất chỉ thị bromothymol blue trong môi trường. Thử nghiệm LDC (Lysine decarboxylase): Phản ứng được xúc tác bởi LDC sẽ loại bỏ CO2 ra khỏi lysine, CO2 sinh ra sẽ làm tăng pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH (bromocresol purple). Thực hiện: Tạo dịch huyền phù sinh khối vi khuẩn trong 3-5ml nước cất, hoặc nước muối sinh lý vô trùng (pha càng đục càng tốt) Bơm 200 µl dịch vi khuẩn vào các giếng của khay nhựa. Đối với ống LDC, dùng que cấy vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn, sau đó cắm vào ống môi trường, dán miệng ống lại. Đem tất cả đi ủ ở nhiệt độ 25-30oC trong 2-3 ngày, bổ sung thêm thuốc thử (nếu cần) và đọc kết quả theo bảng 3.1 37 Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR Stt Phản ứng sinh hóa Thuốc thử Dƣơng tính Âm tính 1 Lên men glucose Không Vàng Tím 2 Khử Nitrate 1 Đĩa giấy tìm nitrate Đỏ Vàng lợt 3 Galactosidase Không Vàng Không màu 4 Urease Không Đỏ cánh sen Đỏ nhạt/vàng 5 PDA 1 giọt FeCl3 Xanh lá đậm Vàng lợt 6 Citrate Không Xanh biển Xanh lá/vàng 7 Esculin Không Đen Không đen 8 Sinh H2S Không Đen Không đen 9 Sinh Indole Kovac Đỏ Không đổi màu 10 Voges-Poskauer 1 giọt KOH, 1 giọt Napthanol Đỏ Vàng nhạt 11 Sử dụng Malonate Không Xanh biển Vàng/xanh lá 12 Oxydase Không Xanh dương Không đổi màu 13 LDC Không Tím Vàng 14 MOT (di động) Không Nhòe đường cấy Không nhòe đường cấy  Khảo sát khả năng cố định đạm Dreyfus (1988) và Abdoulaye Sy (2001) đã chứng minh rằng ở một số loài Methylobacterium sp. có khả năng cố định đạm nhờ sự hiện diện của một số gen (gen nifH và gen nod) có vai trò tương tự như gen cố định đạm ở Rhizobium. Năm 2006, Raja cũng đã chứng minh được 11 chủng Methylobacterium sp. có khả năng phát triển trên môi trường khoáng MS không nitrogen, trong đó có 1 chủng chỉ có sự hiện diện của gen nifH mà không có gen nod (gen tạo nốt sần ở rễ cây). Vì thế, chúng tôi xem xét khả năng cố định đạm của các chủng phân lập được. 38 Phƣơng pháp: Cấy vi khuẩn lên các erlen chứa môi trường dịch thể NMS có bổ sung chất chỉ thị màu bromothymol blue 0,04%, nuôi cấy lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ 25-30oC. Sau 4-5 ngày ghi nhận sự đổi màu của môi trường so với đối chứng.  Khảo sát khả năng sinh tổng hợp PHB PHB (poly-beta-hydroxybutyrate) là nguồn carbon dự trữ ở vi khuẩn Methylobacterium. PHB là một polymer chịu nhiệt có khẳ năng phân hủy sinh học. Vì thế, việc định tính sự tích lũy PHB không những cần thiết cho mục tiêu phân loại mà còn đánh giá tiềm năng sử dụng thu nhận PHB chủng vi khuẩn mới phân lập được [1] Mục đích: Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB của các chủng phân lập được. Nguyên tắc: Sử dụng phẩm nhuộm chuyên biệt Nile Blue A để ghi nhận sự hiện diện các hạt PHB trong tế bào vi khuẩn phân lập được. Với thuốc thử này, các hạt PHB trong tế bào sẽ bắt màu cam sáng trên nền tế bào màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi phát huỳnh quang ở bước sóng 460nm. Vật liệu: - Sinh khối của 2 chủng vi khuẩn phân lập được. - Phẩm nhuộm Nile Blue A - Dung dịch acid acetic 8% Thực hiện: Lấy 1-2 giọt huyền phù sinh khối vi khuẩn, đặt lên tấm lam sạch, hơ qua ngọn lửa nhiều lần để cố định tế bào trên lam. Nhuộm tế bào đã cố định bằng 1 giọt phẩm nhuộm Nile Blue A trong 15 phút ở 55oC. Rửa sạch phẩm thừa bằng nước cất, sau đó rửa lại 1 lần nữa bằng acid acetic trong 1 phút. Dùng giấy thấm lau khô mẫu, cho 1 giọt nước lên lam, đậy lamen lại. Quan sát sự bắt màu cam sáng của các hạt PHB trong tế bào vi khuẩn đã được xử lý màu dưới kính hiển vi phát huỳnh quang ở bước sóng 460nm. 39 3.3.3.4 So sánh tính tƣơng đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard (Sj) Hệ số tương đồng Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ tương đồng của hai loài vi khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của chủng vi khuẩn phân lập được với các loài được công bố thì việc tính toán giá trị hệ số Sj là cần thiết. Hệ số Sj được tính theo công thức: Sj= a/(a+b) a: tổng số các đặc điểm tương đồng ở hai loài b: tổng số đặc điểm khác biệt ở hai loài Giá trị của hệ số Sj nằm trong khoảng 0-1 (0-100%). Nếu 2 loài có hệ số Sj >0,8 (80%) thì có khả năng thuộc cùng một loài. 3.3.3.5 Phân tích trình tự rDNA 16S  Tách chiết DNA Mục đích: Thu nhận DNA bộ gen của các chủng phân lập được. Thực hiện: theo quy trình tách chiết DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. [1]. - Ly tâm thu sinh khối - Bổ sung 600µl CTAB nóng, đem vortex thật kỹ, ủ ở 65oC trong 60 phút, để cho CTAB phá màng tế bào hoàn toàn. - Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút. - Thu dịch nổi, biến tính lần 1 bằng 500µl phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ. - Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút. - Thu dịch nổi, biến tính lần 2 bằng 500µl phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ. - Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút. - Thu dịch nổi, tủa bằng 1ml ethanol tuyệt đối lạnh. - Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong 5 phút. - Rửa lại tủa bằng 500µl cồn 70oC. - Phơi mẫu cho khô cồn. - Hòa tan tủa trong 20µl dung dịch TE 0,1X. - Bổ sung 2µl dung dịch RNAse (1mg/ml), ủ 37oC trong 60 phút. 40 - Bảo quản ở nhiệt độ 4oC. - Sản phẩm DNA bộ gen được đánh giá thông qua điện di qua gel agarose 1%, đo nồng độ và xác định độ tinh sạch qua tỷ số OD260nm/OD280nm.  Khuếch đại trình tự rDNA 16S bằng phản ứng PCR Để có thể định danh một cách chính xác các chủng vi khuẩn phân lập được ở mức độ loài thì gần như toàn bộ thông tin về trình tự DNA mã hóa cho phân tử rDNA 16S phải được biết thật đầy đủ. Vì thế cần tiến hành các phản ứng PCR để khuếch đại toàn bộ trình tự rDNA 16S từ khuôn là DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn thu nhận được ở trên. Các phản ứng PCR được thực hiện với các mồi khác nhau, bao gồm: Cặp mồi 2F (5’ GAT CGG CCC GCG TCT GAT TAG 3’) và 2R (5’ CCG TCA TTA TCG TCC CGG ACA 3’) đã được Nishio T, và cộng sự (1997) sử dụng trong định danh cho chi Methylobacterium. Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn phân lập được với các cặp mồi: 27F : 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1525R: 5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’ 520F: 5’-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3’ 920F: 5’-AAACTCAAATGAATTGACGG-3’ 520R: 5’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3’ 920R: 5’-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’ Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại trình tự rDNA 16S bao gồm: Buffer (10X) ........................................................................... 2,5µl Mg2+ (25mM) ........................................................................ 1,5µl dNTP (2mM) .......................................................................... 2,5µl Mồi xuôi (10pmol/µl) ............................................................. 1µl Mồi ngược (10pmol/µl) .......................................................... 1µl DNA khuôn (100ng/µl) .......................................................... 1µl Tag DNA polymerase (2U/µl) ................................................ 1µl 41 DEPC-H2O ............................................................................. vừa đủ 25µl Thực hiện các phản ứng PCR: - Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp mồi (2F, 2R), với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234 bp. - Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn phân lập được với cặp mồi (27F-1525R). - Tinh chế: sử dụng bộ kit tinh chế sản phẩm PCR của hãng Bio Basic, Canada. - PCR với các cặp mồi bên trong để kiểm chứng sự bắt cặp chuyên biệt của các cặp mồi trong. Vì kích thước sản phẩm PCR bằng cặp mồi (27F, 1525R) là 1500 Nu là rất lớn. Khó giải trình tự một cách chính xác theo phương pháp giải trình tự trực tiếp từ phản ứng PCR nên phải sử dụng các cặp mồi bên trong. Mục tiêu của các phản ứng PCR này là chứng minh cặp mồi (520F, 920R) có khả năng bắt cặp với trình tự rDNA 16S của vi khuẩn mục tiêu. - Các phản ứng PCR được thực hiện với cùng một chu trình nhiệt như sau: Hình 3.1: Chu trình nhiệt của các phản ứng PCR. - Các sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel agarose 2% ở điện thế 50V trong 40 phút. Sau đó nhuộm bằng ethidium bromide trong 45 phút, và xem kết quả dưới đèn UV. - Những sản phẩm tốt sẽ được gửi đi giải trình tự (Macrogen, Hàn Quốc) để có thể định danh chính xác đến mức độ loài.  Phân tích trình tự rDNA 16S. 4 o C 72 o C 72 o C 60 o C 90 giây 120 giây 5phút 94 o C 95 o C 90 giây 5phút 40 chu kỳ 42 Kết quả giải trình tự (phụ lục) sẽ được xử lý bằng phần mềm fast PCR để tạo ra các trình tự rDNA nguyên vẹn của mỗi chủng vi khuẩn. Trình tự rDNA 16S nguyên vẹn này sẽ được so sánh với các trình tự DNA của các chủng vi khuẩn khác trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phầm mềm BLAST. Trình tự của chủng khảo sát và các chủng chuẩn được sắp gióng cột bằng chương trình CLUSTAL X phiên bản 1.81. Cây phát sinh loài được bằng phương pháp neighbor-joining trong chương trình MEGA phiên bản 2.1 với 1000 lần lặp lại. 3.3.4 Định danh nấm men 3.3.4.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men  Hình thái của tế bào sinh dƣỡng Sau khi phân lập và làm thuần chúng ta cần kiểm tra các đặc điểm hình thái của tế bào nấm men qua các đặc điểm về hình dạng, kích thước và kiểu sinh sản. Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như: hình tròn, hình trứng, hình bầu dục, hình que… Về kích thước, nấm men là tế bào có kích thước lớn, lớn hơn tế bào vi khuẩn 5-10 lần. Tế bào nấm men thường có chiều dài 9-10µm, chiều rộng 2-7µm Cách thực hiện: Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường YM Broth ở nhiệt độ phòng, khoảng 24-48 giờ Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, chú ý các đặc điểm về hình dạng kích thước kiểu sinh sản, tế bào thường ở dạng đôi hay tạo chùm.  Hình thái của khuẩn ty giả Ở một số loài nấm men, chồi trưỡng thành không tách ra khoải tế bào mẹ mà tạo thành một chuổi tế bào gọi là khuẩn ty giả. Rất khó để phân biệt giữa khuẩn ty giả và khuẩn ty thật, để phân biệt có thể dựa vào cách quan sát tế bào cuối cùng của chúng. Khuẩn ty thật có độ khúc xạ và tế bào cuối cùng thường dài hơn tế bào cạnh nó, còn khuẩn ty giả không có độ khúc xạ, không thấy rõ vách ngăn giữa các tế bào (giả đốt) và tế bào cuối cùng thường ngắn hơn tế bào cạnh nó. 43 Sự hình thành khuẩn ty giả ở nấm men là do tác động của điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng, thiếu oxy… Cách thực hiện: (Phương pháp Dalmau). - Trước tiên cần chuẩn bị lame, lamelle, đĩa Petri có giấy lọc ở dưới và một thanh chữ U ở dưới đem hấp vô trùng. - Hút nước đã hấp vô trùng bơm lên giấy lọc để giữ cho môi trường trong đĩa petri không bị khô. - Hút môi trường PDA đã hấp khử trùng và đã làm tan, trải trên miếng lame - Dùng que cấy thẳng ria một đường lên miếng lame và đặt miếng lamelle lên chỗ vừa cấy cho thật kín. - Đem ủ ở nhiệt độ phòng, bổ sung nước cất vô trùng 3 ngày/lần đề tránh môi trường thạch bị mất nước. Kết quả: quan sát khuẩn ty giả dưới kính hiển vi.  Hình thái bào tử nang Bào tử nang của các loại nấm men rất khác nhau về số lượng bào tử trong nang, hình dạng, màu sắc, kích thước. Sự hình thành bào tử nang thường được cảm ứng bởi môi trường ức chế sự phát triển dinh dưỡng . Cách thực hiện: Cấy giống đã hoạt hóa vào môi trường Acetate agar và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 tuần. Quan sát nang bào tử dưới kính hiển vi 3.3.4.2 Xác định một số đặc tính sinh hóa của nấm men  Khả năng lên men Glucose Lên men glucose là một trong những yếu tố quan trọng để bước đầu định danh nấm men đến giống. Quá trình lên men có thể sinh khí hay không sinh khí, có thể tạo acid hay tạo ethanol. Muốn xác định khả năng lên men cần xác định các yếu tố sau: Khả năng sử dụng Glucose (màu môi trường có thay đổi) 44 Khả năng tạo ethanol (hình thành phức chất màu vàng với tinh thể iode trong điều kiện kiềm) Khả năng sinh khí (sự xuất hiện bọt khí trong ống Durham) Cách thực hiện: - Hút 2ml môi trường cơ bản vào ống nghiệm loại nhỏ có chứa ống Durham đã lấy hết khí ra đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. - Hút 1ml dung dịch đường Glucose đã lọc vô trùng trong điều kiện vô trùng. - Cấy giống và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày kiểm tra 12 tiếng/lần Kết quả: Sinh khí : (+) có khí trong ống Duharm (-) không có khí trong ống Durham Sinh ethanol: (+) hình thành tinh thể màu vàng (-) không hình thành tinh thể vàng với I2  Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon Kiểm tra đặc tính đồng hóa các nguồn cacbon là kiểm tra khả năng phát triển của nấm men trên môi trường chỉ chứa một nguồn cacbon như là nguồn năng lượng duy nhất. Thử nghiệm này có thể được thực hiện trên môi trường rắn hay lỏng. Tuy nhiên môi trường lỏng thường được sử dụng nhiều hơn. Các nguồn carbon được khảo sát bao gồm: beatin, citrate, D-glucose, fructose, lactose, L-glutamate, maltose, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, tartrate. Thực hiện: các bước thí nghiệm được thực hiện như thí nghiệm khảo sát khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của vi khuẩn Kết quả: Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng (màu xanh lá cây).  Khả năng đồng hóa Nitrat Nấm men có khả năng sử dụng các nguồn nitrogen. Khả năng sử dụng nguồn nitrate là một tiêu chuẩn quan trọng trong việc định danh một số giống. 45 Cách thực hiện: - Hút vào ống nghiệm nhỏ 1ml môi trường Bacto Yeast Cacbon base có bổ sung chất chỉ thị màu Bromothymol Blue 2ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Nguồn nitrogen KNO3 được bổ sung bằng cách lọc vô trùng. - Bơm vào từng giếng của Microplate 1ml môi trường. Cấy 20µl dịch nấm men vào các giếng của Microplate, trừ giếng đối chứng. - Ủ ở 25-30OC trong 4-5 ngày và đọc kết quả: đặt microplate lên tờ giấy trắng. Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng  Tổng hợp các đặc điễm và định danh Căn cứ trên các đặc điểm hình thái, sinh lý của các chủng nấm men phân lập được và dựa trên khóa phân loại Lodder [2]. Định danh tới mức độ giống các loài khảo sát. 46 4 Chƣơng IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập và làm thuần: Từ 25 mẫu thu nhận từ Vườn Quốc gia Cát Tiên chúng tôi đã tiến hành phân lập và làm thuần trên 2 môi trường MMS và MSo. Kết quả chúng tôi đã thu nhận được 45 chủng VSV trên môi trường MMS và 30 chủng trên môi trường MSo. 4.2 Kết quả sàng lọc các chủng có khả năng tƣơng tác với thực vật 4.2.1 Khảo sát khả năng kích thích tăng trƣỡng thực vật của các chủng VSV trong điều kiện in vitro  Khảo sát khả năng tƣơng tác thực vật của các chủng vi sinh vật biến dƣỡng methyl trên môi trƣờng MS (Murashine & Skoog, 1962)  Kết quả: Sau 14 ngày nuôi cấy, chúng tôi ghi nhận kết quả và chia các nghiệm thức làm 2 nhóm Âm tính (chồi ngủ chết) có tất cả 37 nghiệm thức. Dương tính (chối ngủ sống) nhóm dương tính gồm có 9 nghiệm thức chồi phát triển. Kết quả của 9 nghiệm thức này được ghi nhận và tiến hành thống kê so sánh với đối chứng (Bảng 4.1). Chủng vi sinh vật Độ tăng của chiều cao chồi (mm) Chiều dài rễ (mm) Độ tăng của trọng lƣợng tƣơi (mg) Trọng lƣợng khô (mg) Đc 13,73 ± 1,87 d 49,06 ± 7,49bc 486,00 ± 11,27d 78,33 ± 7,57c 6010a 8,86 ± 1,35 c 44,06 ± 6,96ab 477,66 ± 60,45c 73,33 ± 8,50bc 6012a 7,73 ± 0,96 b 53,06 ± 6,58cd 430,33 ± 22,90bc 59,33 ± 3,21a 47 Bảng 4.1: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05) 0 5 10 15 20 25 Đc 6010a 6012a 6019a 6019b 6020a 6020c 6021a 6027a Chủng vi sinh vật (m m) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 (m m) Độ tăng chiều cao cây Chiều dài rễ Biểu đồ 4.1: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MS. 6019a 18,73 ± 1,62 ef 55,85 ± 7,89d 600,66 ± 51,05d 108,00 ± 5,56e 6019b 19,26 ± 1,58 g 61,53 ± 7,83e 572,66 ± 59,41d 107,66 ± 10,10e 6020a 6,53 ± 1,12 a 51,13 ± 6,66cd 399,66 ± 15,43a 53,00 ± 4,00a 6020c 7,86 ± 1,06 bc 44,8 ± 7,32ab 377,33 ± 17,78ab 58,66 ± 2,52a 6021a 8,66 ± 1,45 bc 40,06 ± 6,64a 437,66 ± 37,07bc 63,33 ± 4,04ab 6027a 17,93 ± 1,57 f 73,60 ±6,26f 593,33 ± 10,69d 93,00 ± 5,13d 48 0 100 200 300 400 500 600 700 Đc 6010a 6012a 6019a 6019b 6020a 6020c 6021a 6027a Chủng vi sinh vật (m g) 0 20 40 60 80 100 120 (m g) Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Biểu đồ 4.2: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MS. Kết quả khảo sát (Bảng 4.1) chúng tôi ghi nhận có 9 chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl không gây chết ở chồi thuốc lá.Trong đó các chủng 6019a, 6019b, 6027a đều có kết quả theo dõi tốt so với đối chứng và các mẫu khác theo các chỉ tiêu ghi nhận. Chủng 6019a: chồi thuốc lá cho kết quả dương tính tốt nhất ở trọng lượng tươi 600,66mg, trọng lượng khô 108 mg chỉ tiêu về chiều dài rễ cũng cho kết quả cao hơn so với đối chứng (Hình 4.1C). Chủng 6027a: chồi thuốc lá có kết quả tốt nhất về chiều dài rễ so với đối chứng 73,6mm. Đặc biệt ở vùng vết cắt chồi cấy có thấy sự hình thành của mô sẹo (Hình 4.2). Đây là dấu hiệu cho thấy khả năng tiết ra các phytohormone của chủng 6027a. Riêng chỉ tiêu về trọng lượng tươi, trọng lượng khô, chiều cao cây đều cho kết quả dương tính so với đối chứng (Bảng 4.1) Các chủng còn lại tuy không gây chết trên mô thực vật nhưng các chỉ tiêu tăng trưởng đều cho kết quả thấp hơn so với đối chứng. 49 Từ kết quả thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành chọn các chủng 6019a, 6019b, 6027a để tiến hành định danh.  Khảo sát khả năng tƣơng tác thực vật của các chủng vi sinh vật trên môi trƣờng MS không nitơ (MSO) Hình 4.1: Kết quả tương tác của các chủng vi sinh vật lên chồi thuốc lá sau 2 tuần A: Đối chứng C: Chủng 6019b B: Chủng 6019a D: Chủng 6027a Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc lá khi bổ sung chủng 6027a 50 Kết quả: Sau 14 ngày nuôi cấy, chúng tôi ghi nhận và chia các nghiệm thức làm 2 nhóm: Âm tính: (chồi thuốc lá chết) có tất cả 24 nghiệm thức (tương ứng với 24 chủn