Khóa luận Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao

từ 1 – 28 ngày tuổi < 20 <30 Nhóm gà còn lại <30 <50 Vịt con từ 1 – 28 ngày tuổi Không có <10 Nhóm vịt còn lại <10 <20 Heo con theo mẹ từ 1 – 20 ngày tuổi <10 <30 Nhóm heo còn lại <100 <200 Bò nuôi lấy sữa <20 <50 2.3. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin Vì sự nguy hiểm có thể liên quan tới sức khỏe của con người và cộng đồng do sự nhiễm các aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc, các nhà khoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm. Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm aflatoxin có thể là đưa những biện pháp kiềm chế có lợi và có hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm số lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây ra. Song những biện pháp như vậy là rất khó thực hiện trong thực tế vì nó phụ thuộc vào các điều kiện khí hậu và các thay đổi cần thiết trong thực tiễn bảo quản và thực tiễn nông nghiệp. Các thực nghiệm với lạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng minh ảnh hưởng của thực tiễn nông nghiệp về sự nhiễm aflatoxin. Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến bộ đã cho thấy một thực tế là sự nhiễm aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là không thể tránh được. Vì những biện pháp phòng ngừa cực kỳ khó thực hiện trong thực tế, cho nên cần tìm những biện pháp kiềm chế khác để đạt được các thực phẩm và thức ăn gia không có aflatoxin có thể ăn được. Các phương pháp khử aflatoxin bao gồm phương pháp vật lí, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. 2.3.1. Phương pháp vật lí * Các qui trình phân loại Phương pháp sử dụng rộng rãi nhất là loại trừ chọn lọc các phần bị nhiễm của sản phẩm. Nói rộng ra vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộc chủ yếu vào tính chất vật lý của sản phẩm. Các quy trình phân loại dựa trên các đặc tính như màu và kích thước của hạt… đã được sử dụng một cách khá thành công đối với lạc ăn. Phương pháp này dựa trên sự định vị aflatoxin ở phần tương đối nhỏ của các hạt, với sự thiếu hụt rất dễ nhận ra ở kích thước và hình dạng của hạt. Tuy nhiên, do cái gọi là tổn thất “lột vỏ” thì những biện pháp này không thể nói là hiệu quả 100%. * Các quy trình chiết suất bằng dung môi Việc chiết suất aflatoxin bằng dung môi có một số thuận tiện: - Aflatoxin có thể bị loại trừ hoàn toàn một cách căn bản trong điều kiện thuận lợi. - Ít có khả năng tạo những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý đa dạng từ aflatoxin. - Trong nhiều trường hợp, việc chiết suất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bị mất mát chất dinh dưỡng. Nhưng việc chiết suất bằng dung môi có một số bất lợi: - Cần phải có thiết bị chiết suất dung môi đặc biệt; - Sẽ chiết suất luôn một số thành phần hòa tan cùng aflatoxin; - Giá thành của việc chiết suất cao; - Có thể mất mùi của sản phẩm xử lý. Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một nhiệm vụ khó. Các yếu tố khác như giá của dung môi và hiệu suất thu hồi chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa, độc tính của dung môi, dư lượng của chúng và cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy dễ nổ và điểm sôi của dung môi. Các aflatoxin có thể được chiết suất bằng các dung môi như cloroform/nước, aceton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà không loại trừ dầu. Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầu hỏa/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nước, và hexan –aceton - nước. Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg. 2.3.2. Phương pháp khử độc tố bằng hóa chất Nhiều hóa chất có thể khử aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên. Những hóa chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin. Các hóa chất dùng cho việc khử độc tố phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau: - Phải phá hủy hay khử aflatoxin; - Nó phải không tạo ra hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc tố hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng; - Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi chúng có thể tái nhiễm lại sản phẩm; - Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu. Tuy nhiên, nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả những tiêu chuẩn trên, và mặc dầu chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn. Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủy aflatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên. Những hóa chất này bao gồm hydrogen peroxit hay những hóa chất tương tự, hypochlorit, dimetylamin hay metylamin và amoniac. Trong số này, hydrogen peroxit , natri hydrixit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn. Trong khi đó, dimetylamin hay các amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu hay ngô. Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụng rộng rãi trong việc xử lý các thức ăn gia súc nhiễm aflatoxin ở nhiều nước. Về cơ chế, ở nhiệt độ cao, có thể trong điều kiện áp suất xảy ra sự thoái biến aflatoxin B1 bởi amoniac. Ở nước ta, Nguyễn Thùy Châu đã nghiên cứu công nghệ khử độc tố aflatoxin B1 trên ngô và khô lạc bằng hóa chất. Kết quả cho thấy NH3 nồng độ 6% hoặc Ca(OH)2 có tác dụng khử 90% độc tố aflatoxin [1]. Nhưng giá xử lý bằng hóa chất này có giá thành cao, đặc biệt việc khử độc tố bằng amoniac đã để lại mùi khó chịu cho ngô và khô lạc nên khó áp dụng rộng rãi trong thực tế ở Việt Nam. 2.3.3 Khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc. 2.3.3.1. Khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium aurantiacum Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro, Cotty Pitter đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân hủy aflatoxin. Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả ở môi trường rắn và môi trường lỏng. Khả năng loại trừ aflatoxin B1 của vi khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật, lạc, ngô, bơ lạc và sữa lạc. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng yếu tố có vai trò quan trọng việc phân giải alflatoxaflatoxinin B1 bằng chất chiết của Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan Quản lí thực phẩm và thuốc của Mĩ đề nghị như các biện pháp loại trừ aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm. 2.3.3.2. Khử nhiễm aflatoxin bằng Rhizopus delemar Zhu C.R. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin của Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin. Aflatoxin B1 được đưa và nước uống của chuột nhắt cái ở liều 126 μg trong một tuần và toàn thể liều thử là 3,4 mg trong thời gian 27 tuần. Chất chiết của Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng việc trộn dung dịch aflatoxin B1. Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi 18, 30, 38, và 52. Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được định lượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các phản ứng enzym. Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B1, tai biến ung thư gan là 71%. Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với aflatoxin B1, các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh học enzym đã giảm ở tất cả các thời gian lấy mẫu chuột để thử và không có con chuột nào xuất hiện triệu chứng ung thư gan. Kết quả thực nghiệm này cho thấy rằng Rhizopus delemar có khả năng ức chế mạnh tác dụng độc và tính gây ung thư gan của aflatoxin B1. Nấm Rhizopus delemar có thể được sử dụng như biện pháp tiện lợi và hiệu quả để kiểm soát sự nhiễm độc do aflatoxin. Từ kết quả nghiên cứu này, Rhizopus delemar đã được Cộng đồng Châu Âu khuyến cáo sử dụng như một tác nhân sinh học để khử nhiễm aflatoxin trong thức ăn gia súc nói chung và khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc nói riêng. PHẦN 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu * Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập 40 mẫu đất của các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên để phân lập vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum. * Để phân lập các chủng Rhizopus delemar có khả năng khử aflatoxin, chúng tôi đã thu thập: - 8 mẫu bánh men thuốc bắc tại các chợ của các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Bắc Ninh - 7 mẫu xoài tại các chợ của Hà Nội - 6 mẫu quýt tại các chợ của Hà Nội - 4 mẫu gạo mốc 3.1.2. Môi trường * Môi trường M1: 5 gram pepton 2 gram cao thịt 0,2 gram cao nấm men 3 gram NaCl 20 gram aga 1000 ml nước máy pH = 7,2-7,4 Đun cho tan chảy aga, thử pH = 7,2-7,4 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. * Môi trường PDA: 200g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu và đun sôi 10 phút với 4500ml nước. Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu được dịch chiết khoai tây. 1000 ml dịch chiết khoai tây 20 gram glucoza 20 gram aga Đun cho tan chảy aga, thử pH = 6 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. * Môi trường Sabouraud: 40 gram glucoza 20 gram pepton 20 gram aga 1000 ml nước máy pH = 5,5 – 5,8 Đun cho tan chảy aga, thử pH = 5,5 – 5,8 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. 3.1.3. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin * Na2SO4 khan (Trung Quốc) * NaHClO, Nhà máy hóa chất Việt Trì * Các dung môi cloroform, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc) * Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma) * Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức cho sắc ký lớp mỏng 3.1.4. Dụng cụ thí nghiệm * Buồng sắc ký lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ * Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức * Giấy lọc Whatman No1, Chemapoli, Tiệp Khắc * Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật * Phễu chiết * Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc * Bơm tiêm vi lượng Hamilton * Máy cô chân không * Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ) * Máy đánh sóng siêu âm * Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh * Máy cất quay chân không (Đức) * Tủ cấy vô trùng (Đức) * Nồi hấp tự động (Đài Loan) * Máy đánh vovtex 3.2. Phương pháp 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu đất Chọn những ruộng lúa hay ruộng rau có đất màu mỡ. Dùng dao gạt bỏ 10cm lớp đất bề mặt, lấy khoảng 20g đất cho vào túi nilon, buộc kín miệng túi. Mẫu đất phải được đánh số thứ tự, địa điểm lấy mẫu và ngày lấy mẫu. 3.2.2. Phương pháp phân lập 3.2.2.1. Phương pháp phân lập Flavobacterium aurantiacum Cân 1g đất cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10-5 thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10-4 và 10-5 vào các hộp petri đã đổ môi trường M1. Dùng que chang thủy tinh trang đều cho tới khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2 ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường M1 thạch nghiêng. 3.2.2.2.Phương pháp phân lập Rhizopus delemar - Phân lập Rhizopus delemar từ bánh men thuốc bắc: mẫu bánh men thuốc bắc được nghiền nhỏ. Cân 1g mẫu đã được nghiền nhỏ cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10-5 thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10-4 và 10-5 vào các hộp petri đã đổ môi trường PDA hoặc Sabouraud. Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tới khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2 ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc môi trường Saubauraud) thạch nghiêng. - Phân lập Rhizopus delemar từ các mẫu hoa quả: vỏ hoa quả được cắt thành những mảnh nhỏ. Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10-5 thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10-4 và 10-5 vào các hộp petri đã đổ môi trường PDA (hoặc môi trường Sabouraud). Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tới khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2 ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc môi trường Saubauraud) thạch nghiêng. 3.2.3. Phương pháp định loại Flavobacterium aurantiacum Để định loại F.aurantiacum chúng tôi dựa vào khóa phân loại của Bergey [14]. Chúng tôi tiến hành các phản ứng sinh lý như xác định khả năng di động, sắc tố tế bào, khả năng chịu muối, nhu cầu về NaCl; các phản ứng sinh hóa như khả năng thủy phân gelatin, khả năng thủy phân casein, khả năng thủy phân tinh bột, khả năng thủy phân celluloza, các khả năng lên men đường glucoza, lactoza, saccaroza, maltoza. 3.2.4. Phương pháp định loại Rhizopus delemar Để định loại các R.delemar, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng Rhizopus phân lập trên môi trường Sabouraud trong 24 giờ, sau đó tiến hành xác định các đặc điểm hình thái và cấu trúc vi học của R.delemar theo khóa phân loại của Laurone [26]. 3.2.5. Phương pháp làm tiêu bản quan sát F.aurantiacum Sử dụng phương pháp nhuộm Gram. Lấy một giọt nước cất vô trùng nhỏ lên lam kính. Dùng que cấy vòng bắt khuẩn lạc để lấy mẫu. Hòa mẫu vào giọt nước và dàn đều mẫu trên lam kính. Hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn cho khô tiêu bản sau đó nhuộm màu. Nhỏ tím gential, giữ 2 phút rồi rửa nước. Nhỏ lugol, giữ 2 phút sau đó hất đi. Tẩy màu tiêu bản bằng cồn 96o trong 30 giây sau đó rửa nhẹ qua nước. Nhỏ fushin, giữ 30 giây, rửa nước, hơ khô. Nhỏ dầu lên tiêu bản và đem quan sát dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính 100. Vi khuẩn Gram dương có màu tím. Vi khuẩn Gram âm có màu hồng. 3.2.6. Phương pháp làm tiêu quan sát nấm mốc Nhỏ một giọt cồn : nước theo tỉ kệ 2 : 1 lên lam kính, dùng que cấy mốc, lấy mốc trong ống thạch nghiêng. Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên sau đó nhỏ một xanhmetylen, đậy lamen lên sau đó quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính 40. 3.2.7. Phương pháp phân tích aflatoxin Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko [18] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC) [13] có cải tiến gồm những giai đoạn sau: 25 g mẫu được say mịn trên máy xay cà phê (50 ml bột ngô, bột lạc lỏng) chiết suất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100 ml) và dung dịch NaCl 10% (25ml). Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman No1. Lấy 50 ml dịch lọc và kết tủa bằng chì axetat 10% (50ml) để loại bỏ protein, lọc qua giấy lọc Whatman No1. 80 ml dịch lọc được chuyển vào phễu chiết để chiết suất bằng hai pha lỏng - lỏng với 40ml hexan (2 lần). Lớp nước aceton được chiết suất với 40 ml cloroform (3 lần), loại bỏ lớp nước aceton. Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100μl cloroform, giữ ở 4oC cho đến khi tiến hành định tính và định lượng aflatoxin. 25g mẫu ngô, lạc (50ml bột ngô, bột lạc lỏng 25 g mẫu ngô, lạc (50 ml bột ngô, bột lạc lỏng) Nghiền nhỏ 25ml NaCl 10% 100ml aceton Nghiền 5 phút trên máy nghiền đồng thể 50ml chì axetat 10% Lọc lấy 50ml dịch Na2SO4 khan Lọc 80ml dịch Bỏ phần dịch nổi trên Chloroform (nhắc lại 3 lần) 40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần) Lấy pha trên cho vào bình cầu Phễu chiết Lấy phần dịch trong Cô chân không lấy 3 ml cặn Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 4oC Ống nhót để bay hơi lấy 3 ml cặn Sơ đồ Quy trình chiết tách aflatoxin * Định tính aflatoxin : Dùng bơm tiêm vi lượng (mycrosyring) nhỏ lên sắc ký lớp mỏng 2μl, 6μl và 10 μl mẫu phân tích. Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép dưới 2 cm và 1,5 – 2cm từ mỗi cạnh bên. Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho đường kính ở các vết nhỏ không vượt quá 5 mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2 μl, 6 μl, 10 μl chuẩn alflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10 μl) như chuẩn trong. Hệ dung môi cho sắc ký bản mỏng một chiều là cloroform : aceton tỉ lệ 9:1. Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 4 μg alflatoxin/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3 - 0,5. Phát hiện alflatoxin bằng cách phát hiện sự phát huỳnh quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối đưới đèn cực tím sóng dài ( có bước sóng 356 nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết, cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng alflatoxin. Thử xác minh alflatoxin + Thử với axit vô cơ: phun lên bản mỏng dung dịch axit H2SO4 trong nước tỉ lệ 1: 2. Nếu như màu phát quang của các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có alflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử alflatoxin ứng với độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng điều có thể xem như có alflatoxin trong mẫu thử. + Thử với axit trifluoroaxetic: chỉ áp dụng với aflatoxin B1, G1, M1. Sau khi nhỏ các vết của các mẫu thử và chuẩn aflatoxin, nhỏ lên các vết chấm của chuẩn và mẫu thử 30 μl axit trifluoroaxetic. Để phản ứng xảy ra trong 10 phút, tránh ánh sáng, sau đó chạy sắc ký trên hệ dung môi thích hợp. Aflatoxin sau khi kết hợp với axit trifluoroaxetic tạo thành một hợp chất phân cực hơn nên có Rf thấp hơn so với aflatoxin không có axit chỉ thị. Mẫu có aflatoxin sẽ tụt ngang với Rf của chuẩn so với chuẩn không chấm axit trifluoroaxetic. Đây là phản ứng chính thức được dùng để làm phản ứng thử xác minh aflatoxin của các phòng thí nghiệm trên thế giới. * Định lượng alflatoxin: Nếu alflatoxin được phát hiện trong mẫu thử, có thể định lượng chúng như sau: Nhỏ 10μl chất chiết với đường kính của vết không quá 5 mm, ở góc dưới bên phải của bản mỏng và cách mép 1,5 cm. Ở góc dưới bên trái cách mép 1, 2, 3 cm và 1,5 cm từ mép dưới của bản mỏng nhở 2 μl,4 μl, 6 μl theo thứ tự dung dịch chuẩn alflatoxin. Thực hiện sắc ký bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton (9:1). So sánh cường độ phát quang của các chuẩn alflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử. Bằng mắt thường định lượng alflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau: V1 . V3 .V5 . m C = —————— V2 . V4 . V6 . M Trong đó: C là nồng độ alflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phân tích ng/g (ppb) V1 là thể tích hỗn hợp nước – aceton (ml) V2 là thể tích hỗn hợp nước – aceton lấy cho phân tích (ml) V3 là thể tích hỗn hợp nước – aceton và chì acetat (ml) V4 là thể tích dịch lọc sau khi làm sạch bằng chì acetat (ml) V5 là thể tích dịch chiết đã bay hơi làm sạch ở cloroform trước khi làm sắc ký bản mỏng (μl) V6 là thể tích dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (μl) m là lượng alfatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g) 3.2.6. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar 3.2.6.1. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng các chủng Flavobacterium aurantiacum Để xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc của các chủng F.aurantiacum phân lập được, chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thùy Châu, các bước tiến hành như sau: bổ sung một lượng hỗn dịch tế bào F.aurantiacum sao cho có nồng độ là 106 tế bào trên 1ml môi trường bột ngô lỏng (hoặc môi trường bột lạc lỏng) có bổ sung các chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200 ppb và tiến hành nuôi cấy ở 25oC trong 9 ngày. Ngày thứ 9 của quá trình nuôi, chúng tôi tiến hành lấy mẫu để xác định hiệu quả khử aflatoxin trên ngô (lạc) của các chủng F.aurantiacum thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin của mẫu xử lý. 3.2.6.2. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng các chủng Rhizopus delemar Để xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc của các chủng R.delemar phân lập được, chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thùy Châu, các bước tiến hành như sau: Bổ sung một lượng R.delemar với mật độ 106 bào tử/g vào 250 g ngô (lạc) có bổ sung các chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200 ppb. Tiến hành nuôi cấy chủng R.delemar trên ngô hạt (lạc hạt) ở nhiệt độ …oC trong 9 ngày. Ngày thứ 9 của quá trình nuôi, chúng tôi tiến hành lấy mẫu để xác định hiệu quả khử aflatoxin trên ngô (lạc) của các chủng R.delemar thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin của mẫu xử lý. PHẦN 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar 4.1.1. Phân lập các chủng F.aurantiacum từ mẫu đất ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam Từ 40 mẫu đất thu thập ở các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình và Hà Tây, dựa trên các đặc điểm sinh lý của F.aurantiacum trong khóa phân loại của Bergey, chúng tôi đã tuyển chọn sơ bộ được 12 chủng F.aurantiacum, kí hiệu từ F1 đến F12. Để có thể khẳng định 10 chủng này đúng là F.aurantiacum, dựa vào khóa phân loại của Bergey, chúng tôi tiếp tục tiến hành thử một số phản ứng sinh hóa đối với 12 chủng F.aurantiacum đã tuyển chọn sơ bộ ở trên. Bảng 4.1. Khả năng thủy phân của các chủng F.aurantiacum phân lập từ đất của một số tỉnh miền Bắc Việt Nam Tên chủng được thử Khả năng thủy phân Gelatin Casein Tinh bột Aga Celluloza F.aurantiacum F1 + + _ _ _ F.aurantiacum F2 + + _ _ + F.aurantiacum F3 _ + _ _ _ F.aurantiacum F4 + + _ _ _ F.aurantiacum F5 + + _ _ _ F.aurantiacum F6 + + _ _ + F.aurantiacum F7 + + + _ _ F.aurantiacum F8 + + _ _ _ F.aurantiacum F9 + + _ _ _ F.aurantiacum F10 + + _ _ _ F.aurantiacum F11 + + _ _ + F.aurantiacum F12 + + _ _ _ Chú thích: +: có khả năng thủy phân - : không có khả năng thủy phân Bảng 4.1 cho thấy, trong số 12 chủng F.aurantiacum được thử chúng tôi thấy có 7 chủng F.aurantiacum có khả năng thuỷ phân gelatin, casein, và không có khả năng thuỷ phân tinh bột, aga và celluloza. Điều này phù hợp với khoá phân loại của Bergey. Để việc định loại được chính xác hơn, chúng tôi tiếp tục thử khả năng lên men của các chủng này. Bảng 4.2. Khả năng lên men một số loại đường của một số chủng F.aurantiacum đã được phân lập sơ bộ Tên chủng được thử Khả năng lên men một số loại đường Glucoza Lactoza Saccaroza Maltoza F.aurantiacum F1 + _ + + F.aurantiacum F3 + _ + + F.aurantiacum F5 + _ + + F.aurantiacum F8 + _ + + F.aurantiacum F9 + _ + + F.aurantiacum F10 + _ + + F.aurantiacum F12 + + + + Chú thích: + : có khả có khả năng lên men - : không có khả năng lên men Trong số 7 chủng được thử khả năng lên men, chúng tôi nhận thấy có 6 chủng phù có đặc điểm phù hợp với đặc điểm của loài F.aurantiacum như đã miêu tả trong khóa phân loại của Bergey. Như vậy, trong tổng số 12 chủng được thử các phản ứng sinh hóa, có 6 chủng là có các đặc điểm sinh hóa phù hợp với các đặc điểm sinh hóa của loài F.aurantiacum được miêu tả trong khóa phân loại của Bergey. 6 chủng F.aurantiacum đã được định loại đó là các chủng F.aurantiacum F1, F.aurantiacum F3, F.aurantiacum F5, F.aurantiacum F6, F8 và F.aurantiacum F10. Hình 1: pHẢI THAY 4.1.2. Phân lập các chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản, thực phẩm 4.1.2.1. Kết quả phân lập các chủng R.delemar từ một số mẫu nông sản và thực phẩm thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Kết quả phân lập một số chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản và thực phẩm thu thập tại các chợ của các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Bắc Ninh được trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả phân lập các chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản, thực phẩm STT Loại nông sản, thực phẩm Số lượng mẫu Số chủng R.delemar phân lập được Tỉ lệ chủng R.delemar phân lập được / số mẫu (%) 1 Bánh men thuốc bắc 8 7 87,5 2 Xoài 7 4 57 3 Quýt 6 4 6 7 4 Gạo mốc 4 3 75 Tổng số 4 25 20 80 Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy trong số 25 mẫu nông sản và thực phẩm thu thập ở