Khóa luận Phân lập vi khuẩn Bacillus Subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh Aflatoxin của các chủng phân lập được

h sáng UV. Các loại aflatoxin khác là sản phẩm chuyển hóa từ 4 loại aflatoxin trên trong cơ thể động vật như aflatoxin M1, aflatoxin M2,…. 14 Giữa các loại trên thì aflatoxin B1 được sản sinh với số lượng nhiều nhất trong nông sản và cũng gây tác hại nhiều nhất, gây ra ngộ độc nhiều nhất. 2.2.3.2. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin Aflatoxin có khả năng liên kết với ADN trong nhân tế bào. Sự liên kết này gây ức chế enzym polymerase của ARN. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp ARN và ức chế polymerase t-ARN. Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế bào. Người ta cũng đã chứng minh rằng vòng , -lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thư và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp AND trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trưởng bình thường của tế bào (M.F.Nexterin và V.I.A. Vixarinova, 1971, trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001). 2.2.3.3. Những tác hại do aflatoxin gây ra Theo Dương Thanh Liêm (2002), aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể con người và động vật. Những tác hại đó như sau: - Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác nhận sự ngộ độc aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hư hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có khác nhau. Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tươi, mật sưng. Sau đó gan sưng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể. - Thận cũng bị sưng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng. - Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thương ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn. - Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thường, có thể gây tử vong cho thú. - Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường, gây rối loạn sinh sản. 15 - Làm giảm tính ngon miệng đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn. - Làm hư hại các chất dinh dưỡng trong thức ăn như glucid, protein, acidamin, vitamin….Làm thức ăn bị giảm giá trị nghiêm trọng, mất mùi tự nhiên nên thú không thích ăn. Đặc biệt aflatoxin còn có khuynh hướng gây ung thư. Làm giảm thấp sự sinh trưởng, sức sản xuất của thú. Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết cho thú. 2.2.3.4. Các phƣơng pháp phân hủy aflatoxin Phƣơng pháp vật lý học Cấu trúc mạch vòng của aflatoxin rất bền chắc. Nếu ta đem nguyên liệu nấu ở nhiệt độ thường (≤100oC) thì aflatoxin không bị phá hủy. Tuy nhiên ở nhiệt độ này thì có khả giết chết nấm sinh ra độc tố, từ đó giới hạn được mức độ nhiễm aflatoxin (theo Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, 2002). - Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu (Lee, 1969; Waltking, 1971; Elkady, 1981; Frank, 1974; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ thổi gió là 100 - 145oC ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb, từ 133 ppb còn 80 ppb và từ 80 ppb còn 25 ppb. Nếu tăng nhiệt độ thổi lên tới 165oC có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm từ 66 - 67%. - Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Rehana (1979) (trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120oC (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ước ở 120 oC trong 4 giờ giảm còn 370 ppb. Ở hàm lượng 16 aflatoxin thấp (760 ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. - Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao. Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer hữu vô cơ có bản chất aluminosilicat như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), mốt số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone) (Charmley, 1994; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài. - Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn căn nuôi. Một thí nghiệm sử dụng hỗn hợp methanol-nước để tách aflatoxin ra khỏi bắp ở tỷ lệ 5:1 đã cho kết quả rất khả quan. - Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím. Ở bước sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo (1978) nhận thấy, lượng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003. Như vậy ánh nắng mặt trời có tác dụng tốt để phá hủy aflatoxin, tuy nhiên nó không triệt để, vì ánh nắng chỉ có tác dụng bên ngoài của lớp thức ăn (Dương Thanh Liêm, Bùi Huy Như Phúc, Dương Duy Đồng, 2002). Phƣơng pháp hóa học - Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: các chất oxy hóa-khử như natrihypochlorit (NaOCl), oxy già (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozon (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin. 17 - Phương pháp sử dụng các chất kiềm: hydroxit amon (NH4OH) và hyroxit natri (NaOH) là 2 chất kiềm được sử dụng làm vô hoạt afaltoxin. Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. - Phương pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 25oC, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Phƣơng pháp sinh vật học Phương pháp vi sinh vật học dùng các loài nấm men, mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn không có độc tính để thử nghiệm về khả năng làm giảm aflatoxin. Rhizopus stolonifer phân hủy được aflatoxin G1. Rhizopus arrhizus có thể làm giảm tính gây độc của aflatoxin B1. Aspergillus parasiticus cũng có thể tác động lên aflatoxin qua hệ thống men của hệ sợi nấm. Tuy nhiên, tác dụng này còn phụ thuộc vào chủng loại nấm, nhiệt độ, độ pH và hàm lượng aflatoxin trong môi trường. Một số dạng nấm men Saccharomyces cerevisiae có tác dụng hạn chế ảnh hưởng xấu của aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi, ngoài ra còn giúp tăng trọng và giảm bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã được thử nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Thí nghiệm được tiến hành với chủng Bacillus subtilis NK-330 và NK-C-3 trên ngô hạt và lạc hạt đã nhiễm aflatoxin từ Aspergillus flavus hay Aspergillus parasiticus. Kết quả cho thấy có sự ức chế rõ rệt khả năng tổng hợp aflatoxin của chủng nấm mốc này (chỉ còn 34 ppb với chủng Bacillus subtilis NK-C-3 trên ngô nhiễm Aspergillus flavus NRRL 3357 sau 5 ngày, so với đối chứng 720 ppb) (R.Mann và cộng sự, 1997; N.kimura, 1988; trích dẫn bởi Bùi Xuân Đồng, 2004). 18 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 3.1.2. Địa điểm Phòng thực hành vi sinh, khoa Chăn Nuôi –Thú Y trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 3.2. ĐỐI TƢỢNG KHẢO SÁT - Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất. - Chủng nấm mốc Aspergillus flavus sinh aflatoxin do phòng thực hành vi sinh cấp. - Vịt nuôi. 3.3. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM - Thiết bị: kính hiển vi, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, đèn cực tím,..... - Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy tinh, ống đong, nhiệt kế, que trang, buồng đếm Neubauer, giá để ống nghiệm,...Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm phải dược sấy tiệt trùng ở 180oC/45 phút. Dụng cụ nhựa được hấp tiệt trùng bằng autoclave ở 121oC/15 phút. 19 3.4. MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY 3.4.1. Môi trƣờng tự nhiên - Môi trường thạch nước cốt dừa: dùng kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus. Nước cốt dừa đóng hộp được pha loãng với nước theo tỷ lệ 1:1. Sau đó thêm agar theo tỷ lệ thích hợp. Hấp tiệt trùng ở 121oC/20 phút. - Môi trường bắp: bắp hạt trước khi dùng phải được nghiền nhỏ như hạt tấm. Sau đó sấy tiệt trùng, xác định hàm lượng aflatoxin và đo hàm lượng ẩm. Điều chỉnh hàm lượng ẩm đến 30% bằng nước, cho vào chai nâu, mỗi chai 150 g bắp. Hấp tiệt trùng ở 121oC/20 phút trước khi tiến hành nuôi cấy. (Thành phần các môi trường được trình bày ở phần phụ lục) 3.4.2. Môi trƣờng tổng hợp - Môi trường phân lập, giữ giống và đếm số lượng vi khuuẩn: môi trường TSA (Trypticase Soya Agar). - Môi trường tăng sinh khối vi khuẩn: môi trường TSB (Trypticase Soya Broth). - Môi trường giữ giống nấm: môi trường thạch khoai tây. 3.5. NỘI DUNG - Phân lập chủng Bacillus sutilis từ đất. - Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập được. - Khảo sát tỷ lệ nuôi cấy thích hợp giữa bào tử nấm mốc sinh aflatoxin và bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis để vi khuẩn có thể ức chế sản sinh aflatoxin tốt nhất. - Thử độ an toàn của nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin sau khi xử lý với vi khuẩn Bacillus subtilis thu được trên vịt nuôi. 3.6. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU 3.6.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.6.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn Dùng muỗng gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 - 3 cm, lấy lớp dất ở dưới. 20 Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1. 3.6.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Chuẩn bị 4 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 - 4. Dùng micropipette hút 1 ml dịch mẫu từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, cứ như vậy tiếp tục làm cho đến ống cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3,10-4,10-5 đem đun cách thủy ở 700C/30 phút. Sau khi đun thì dùng micropipette hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA và trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa TSA ở 370C/24 giờ trong tủ ấm. Sau đó quan sát các khuẩn lạc hình thành trên đĩa TSA, chọn ra những khuẩn lạc nghi ngờ là của Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường ống thạch TSA nghiêng. 3.6.2. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc 3.6.2.1. Quan sát hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn nào phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis thì tiếp tục thử phản ứng sinh hóa để khẳng định. 21 3.6.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn phân lập đƣợc Chủng vi khuẩn thuần đã kiểm tra dưới kính hiển vi Hoạt tính catalase (+) Lecithinase (-) Nitrate (+) MR-VP (+) Citrate (+) Maltose (+) Vi khuẩn Bacillus subtilis Sơ đồ 3.1:Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis 3.6.3. Thí nghiệm 1: Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus và đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc 3.6.3.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm phải tiến hành kiểm tra định tính khả năng sinh độc tố aflatoxin của chủng nấm mốc Aspergillus flavus trên môi trƣờng thạch nƣớc cốt dừa. Cho vào đĩa petri khoảng 15 ml môi trường thạch nước cốt dừa và chờ đến khi thạch đông. Dùng que cấy móc lấy 1 ít sợi nấm mốc trong ống giống (môi trường thạch khoai tây), cấy 1 chấm vào giữa đĩa và giữ đĩa ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày, theo dõi màu huỳnh quang của khuẩn lạc bằng cách đem đĩa đã cấy soi dưới ánh đèn tia cực tím (UV) có bước sóng 365 nm. Màu huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc càng sáng thì khả năng sinh độc tố aflatoxin của nấm mốc Aspergillus flavus càng mạnh. 22 3.6.3.2. Thí nghiệm đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc Dùng que cấy vòng lấy 1 ít vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được được giữ trong ống môi trường TSA nghiêng vào đĩa môi trường thạch nước cốt dừa và ủ trong tủ ấm ở 370C trong 3 ngày. Mỗi đĩa từ 3 đến bốn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. Sau 3 ngày, dùng que cấy móc lấy 1 ít sợi nấm mốc Aspergillus flavus trong ống giống (đã kiểm tra khả năng sinh độc tố aflatoxin trên môi trường thạch nước cốt dừa) cấy vào giữa đĩa môi trường thạch nước cốt dừa nước cốt dừa đã cấy vi khuẩn xung quanh và xem kết quả sau 7 ngày. Sau khoảng 7 ngày theo dõi màu huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc Aspergillus flavus ở các phía có cấy vi khuẩn Bacillus subtilis và không có cấy vi khuẩn bằng cách đem đĩa soi dưới ánh đèn tia cựa tím (UV) có bước sóng 365 nm. Nếu màu huỳnh quang càng sáng ít ở phía ở phía cấy chủng vi khuẩn nào thì chủng Bacillus subtilis đó cho khả năng ức chế sản sinh aflatoxin càng mạnh. Sau thí nghiệm sơ bộ này, chọn những chủng vi khuẩn Bacillus subtilis cho khả năng ức chế sản sinh aflatoxin mạnh nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Ghi chú: - Môi trường thạch nước cốt dừa dùng trong thí nghiệm trên không chứa kháng sinh. - Chỉ tiêu theo dõi: định tính khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. 3.6.4.Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng làm giảm aflatoxin sản sinh trên môi trƣờng bắp của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc 3.6.4.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus 3.6.4.1.1. Phƣơng pháp thu hoạch bào tử nấm mốc Aspergillus flavus Cấy chủng nấm mốc đã được kiểm tra khả năng sinh độc tố lên ống môi trường thạch nghiêng khoai tây, để ở nhiệt độ phòng 4 ngày. Sau đó cho khoảng 9 ml nước muối sinh lý vô trùng vào ống môi trường thạch nghiêng khoai tây đã cấy nấm mốc, 23 dùng que cấy móc khuấy nhẹ và hút lấy huyễn dịch bào tử bằng micropipette rồi cho vào một ống nghiệm vô trùng khác. Sau đó tiến hành đếm số lượng bào tử nấm mốc trong huyễn dịch thu được bằng phương pháp dùng buồng đếm Neubauer dưới kính hiển vi có độ phóng đại x 400 lần. 3.6.4.1.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus Cố định buồng đếm Neubauer dưới kính hiển vi độ phóng đại x 400 lần, đặt lamell lên. Dùng micropipette hút 1 ít (khoảng 0,4 ml) huyễn dịch bào tử nấm mốc thu được nhỏ vào rãnh của buồng đếm. Để yên 1 - 2 phút để dịch đếm tự dàn đều khắp buồng đếm. Cộng số bào tử có được ở các ô vừa đếm và áp dụng công thức để xác định số lượng bào tử nấm mốc/ml (xem phụ lục). 3.6.4.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 3.6.4.2.1. Phƣơng pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối của vi khuẩn Bacillus subtilis từ ống giống cấy chuyền sang môi trường ống thạch nghiên TSA, để ống TSA ở 370C trong 24 h. Tiếp theo cũng dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA cấy sang môi trường ống TSB lỏng, để ống TSB ở 370C trong 24 h. Sau đó dùng micropipette hút 0,1ml canh khuẩn từ môi trường TSB cho lên môi trường đĩa TSA và trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa TSA ở 370C trong khoảng 7 ngày. Sau đó nhuộm Gram theo dõi số lượng bào tử được hình thành. Tiến hành thu hoạch bào tử vi khuẩn khi có hơn 50% tế bào Bacillus subtilis ở dạng bào tử. Cuối cùng thu huyễn dịch bào tử bằng cách cho khoảng 9 ml nước muối sinh lý vô trùng vào đĩa TSA, dùng que trang vô trùng chà nhẹ lên mặt thạch, hút lấy huyễn dịch vi khuẩn bằng micropipette và cho vào ống nghiệm vô trùng. 24 Ống giống Cấy chuyển Cấy sang TSB Vi khuẩn Ống TSA Ống TSB Bacillus subtilis 37 0C/24 giờ 37oC/24 giờ Hút 0,1ml trang lên đĩa Đĩa TSA (để ở 37oC/7ngày) Cho nuớc muối sinh lý vô trùng vào đĩa TSA Thu hoạch huyễn dịch bào tử Ống huyễn dịch bào tử Bacillus subtilis Sơ đồ 3.2: Phƣơng pháp thu hoạch huyễn dịch bào tử Bacillus subtilis 3.6.4.2.2. Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Pha loãng huyễn dịch bào tử vi khuẩn thu được theo bậc 10 liên tiếp bằng cách dùng các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối vô trùng, đánh số thứ tự trên các ống nước muối. Dùng micropipette hút 1ml huyễn dịch vi khuẩn cho vào 2 ống nghiệm 1, bơm lên bơm xuống nhiều lần và lắc trên máy vortex để trộn đều, ta được nồng độ pha loãng 10 -1, hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, trộn đều được nồng độ pha loãng 10-2 và tiếp tục cho tới ống cuối cùng. Sau đó chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp thích hợp và đun cách thủy các ống nghiệm đó ở 700C trong 30 phút để làm chết các tế bào sinh dưỡng còn sót lại và hoạt hóa bào tử vi khuẩn. Đun xong, để nguội,dùng micropipette hút 0,1 huyễn dịch bào tử vi khuẩn cho lên môi trường đĩa TSA (mỗi nồng độ 2 đĩa), trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa TSA ở 370C trong 24 h. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên đĩa. 25 Huyễn dịch Pha loãng bào tử Nồng độ Chọn 3 nồng độ vi khuẩn 10-1 đến 10-n pha loãng liên tiếp thích hợp Đun cách thủy ở 70oC/30 phút Hút 0,1ml trang lên đĩa TSA (mỗi nồng độ 2 đĩa) Để đĩa TSA ở 37oC/24 giờ Đếm số khuẩn lạc hình thành trên đĩa Sơ đồ 3.3: Phƣơng pháp xác định số lƣợng bào tử Bacillus subtilis 3.6.4.3. Bố trí thí nghiệm 3.6.4.3.1. Xử lý nguyên liệu bắp ban đầu trƣớc khi tiến hành thí nghiệm Nguyên liệu bắp được xay nhuyễn tương đối kích khoảng 2 – 3 µm. Sau đó được sấy khô bằng tủ sấy ở 110oC trong 30 phút nhằm ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc, để bảo quản nguyên liệu bắp dùng trong các thí nghiệm. Tiếp theo tiến hành gửi mẫu bắp đã sấy đi phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) nhằm xác định hàm lượng aflatoxin có trong nguyên liệu bắp ban đầu. 3.6.4.3.2. Nuôi cấy chung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis và bào tử nấm Aspergillus flavus trên môi trƣờng nguyên liệu bắp Sau khi xác định được số lượng thì tiến hành nuôi cấy chung bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn trên môi trường bắp theo tỷ lệ và số lượng phù hợp.Tỷ lệ bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn là 1/102. 26 Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm 2 Tỷ lệ bào tử nấm/bào tử vi khuẩn Số lượng bào tử 1/10 2 Thí nghiệm Đối chứng Nấm mốc (1 chủng) 104 104 Vi khuẩn (8 chủng) 106 - Ghi chú: - Mẫu đối chứng không bổ sung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis - Sau khi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn theo tỷ lệ nghiên cứu thì đặt các chai ở nhiệt độ phòng (25-300C), hàng ngày lắc đều chai để tránh hiện tượng vón cục và tạo độ thoáng giữa các hạt . - Sau 7 ngày gửi mẫu phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) - Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng của aflatoxin của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm 3.6.5. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ bào tử nấm mốc /bào tử vi khuẩn đối với sự sản sinh aflatoxin Thí nghiệm 2 cho thấy một số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được có khả năng làm giảm aflatoxin trên bắp nhưng kết quả chưa tốt lắm. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3với mục đích tìm ra tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn để vi khuẩn có thể ức chế aflatoxin tốt nhất. Dựa vào kết quả phân tích hàm luợng aflatoxin của thí nghiệm 2, chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng làm giảm aflatoxin mạnh nhất để thực hiện thí nghiệm 3. 27 Hình 3.1: Nuôi cấy bào tử vi khuẩn và bào tử nấm mốc trên môi trƣờng bắp 3.6.5.1. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử nấm mốc Aspergillus flavus Tiến hành giống như mục 3.6.4.1 ở trang 22 3.6.5.2. Phƣơng pháp thu hoạch và xác định số lƣợng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành giống như mục 3.6.4.2 ở trang 23 3.6.5.3. Bố trí thí nghiệm Trong thí nghiệm này, số lượng bào tử nấm Aspergillus flavus vẫn giữ nguyên như như ở thí nghiệm 2 là 104 , còn số lượng bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis thay đổi tăng 10 lần so với số lượng bào tử vi khuẩn sử dụng ở thí nghiệm 2. Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm 3 Tỷ lệ bào tử nấm mốc/bào tử vi khuẩn Số lượng bào tử Mẫu đối chứng 1/10 3 1/10 4 1/10 5 Nấm mốc 104 104 104 104 Vi khuẩn: chủng 8 - 107 108 109 Ghi chú: - Mẫu đối chứng không được bổ sung bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis . 28 - Sau khi cấy bào tử nấm mốc và bào tử vi khuẩn theo tỷ lệ nghiên cứu thì đặt các chai ở nhiệt độ phòng (25-300C), hàng ngày lắc đều chai để tránh hiện tượng vón cục và tạo độ thoáng giữa các hạt . - Sau thời gian 7 ngày gửi mẫu đi phân tích hàm lượng aflatoxin. - Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng aflatoxin mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng. 3.6.6. Thí nghiệm 4:Thử mức độ an toàn của ngƣyên liệu bắp đã nhiễm aflatoxin sau khi xử lý bằng vi khuẩn Bacillus subtilis (có khả năng ức chế aflatoxin) trên vịt nuôi. Tiến hành xác định liều độc tố aflatoxin quy định có trong thức ăn hỗn hợp dành cho vịt con là 0 bbp. Trong thí nghiệm tăng liều độc tố trong nguyên liệu lên 100 lần là 100 bbp cho vịt ăn ( Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam, 2002; trích dẫn bởi Lê Anh Phụng ). Sau đó, tiến hành nuôi cấy bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis (chủng 8) với nguyên liệu bắp đã nhiễm aflatoxin với hàm lượng độc tố 100bbp trơng 7 ngày và sấy khô ở 1100C/15phút. Phân lô thí nghiệm: chia làm 4 lô thí nghiệm, mỗi lô 10 con vịt. - Lô 1: cho vịt ăn nguyên liệu bắp ban đầu (đã xác định hàm lượng aflatoxin là 0bbp), được sấy khô. - Lô 2: cho vịt ăn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin với hàm lượng 100 bbp, được sấy khô. - Lô 3: cho vịt ăn nguyên liệu bắp đã nhiễm aflatoxin như lô 2 nhưng được nuôi cấy với bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis sau 7 ngày và được sấy khô. - Lô 4: cho vịt ăn nguyên liệu bắp nhiễm aflatoxin như ở lô 2 nhưng có bổ sung thêm bào tử Bacillus subtilis (với số lượng 109 CFU/ml) vào thời điểm cho vịt ăn với số lượng bào tử vi khuẩn là 109 CFU/ml cho 100g bắp. Sau đó, theo dõi kết quả trong 7 ngày. Ghi nhận số vịt chết, sống và lấy mẫu gan đi phân tích. Ghi chú: - Vịt làm thí nghiệm ở 3 ngày tuổi - Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được sử dụng trong thí nghiệm là chủng 8 29 - Số lượng bào tử vi khuẩn bổ sung trong thí nghiệm 4 là 109 CFU/ml - Chỉ tiêu theo dõi: khả năng sống, chết của vịt. Xác định bệnh tích đại thể và vi thể của gan vịt ở các lô thí nghiệm. 3.7. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MẪU Phân tích hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). 3.8. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu được xử lý bằng trắc nghiệm F kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên 1 yếu tố và so sánh các số trung bình bằng trắc nghiệm Tukey (bằng phần mềm Minitab 12.0). 30 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS SUBTILIS 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis Sau 24 giờ cấy trang mẫu đất trên môi trường đĩa TSA, quan sát và bắt giữ những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: mọc lan trên mặt thạch, khuẩn lạc có bề mặt thô, màu xám trắng, tâm đậm màu, viền răng cưa. Tiếp theo là làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lặp được và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) để khảo sát đặc điểm hình thái. Khuẩn lạc nghi ngờ Hình 4.1: Khuẩn lạc ng