Khóa luận Phân lập Virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định Virus bằng kỹ thuật RT-PCR

RNA có vỏ bọc, gây cả thiệt hại về sinh sản trong đàn lợn giống và về các triệu chứng hô hấp trong đàn heo thịt. Heo nái biểu hiện kém ăn, thở khó và có thể kèm theo sốt ngắn. Sảy thai, đặc biệt là cuối thời kỳ chửa, tăng số lƣợng con chết khi đẻ, heo vẹo chân, heo yếu và xảy ra tử vong ở heo con. Ở heo nuôi thịt, mức độ bệnh hô hấp tăng lên, thƣờng kết hợp với các bệnh khác (Thanh Thuận, 2001). Ở ổ dịch cấp tính, ƣớc tính giảm sản lƣợng 5-20%, giảm từ 1-3.8 heo con/nái/năm, thiệt hại từ 100-155$/nái/năm (dẫn liệu của Hoàng Văn Năm, 2001). Thể mãn tính làm cho heo thịt chậm lớn, tăng chi phí thuốc để điều trị các bệnh kế phát. 2.3.1. Lịch sử bệnh Năm 1987, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí trên heo” (Mystery Swine Disease - MSD). 11 Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu. Mùa đông năm 1990- 1991, lần lƣợt các quốc gia Châu Âu nhƣ Hà Lan, Bỉ, Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau: “Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên heo” ( Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD). Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập đƣợc căn bệnh ở Viện thú y trung ƣơng Lelytad – Hà Lan đã phân lập đƣợc căn bệnh và đặt tên cho loại virus này là “Lelystad”. Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập đƣợc virus gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ. Cũng trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006) Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dƣơng tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dƣơng tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở các nƣớc khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dƣơng tính rất cao, nhƣ ở Anh là 6-75%, Mỹ là 36%,… (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y) 2.3.2. Căn bệnh học 2.3.2.1. Phân loại Virus PRRS thuộc: Bộ Nidovirales. Họ Arteriviridae. Giống Arterivirus. 12 Hình 2.1. Virus PRRS (Nguồn: http//www. agraroldal.hu) 2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dƣơng, có đƣờng kính 40-70 nm, có vỏ bọc, kích thƣớc genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). Bộ gene của virus PRRS gồm có 8 khung độc mở (ORFs) mã hoá cho các thành phần khác nhau của virus. Tuy nhiên chỉ có 3 khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORFs 7,6 và 5 quy định tổng hợp các protein tƣơng ứng: nucleocapsid (N) 15-kDa, matrix (M) 19-kDa và glycoproteins envelope (protein GP5) 25-kDa. Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90-95% lƣợng protein cấu trúc của virus. Protein N là một protein nhỏ (15 kDa) và có tính kiềm cao, điều này có thể giúp nó tƣơng tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA. Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20- 40% lƣợng protein của phân tử virus. Hiện nay protein N đƣợc dùng nhƣ là một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo. Protein M có trọng lƣợng phân tử khoảng 18 kDa. Mặc dù chức năng của nó đƣợc biết rất ít nhƣng nó đƣợc xem nhƣ có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và cs, 2001). 13 Protein GP5 có trọng lƣợng phân tử khoảng 25 kDA, là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cs, 2003). Về mặt di truyền, khi phân tích gene của các dòng virus PRRS gây bệnh khác nhau, ngƣời ta xác định đƣợc 2 dòng virus riêng biệt: dòng Châu Âu (Lelystad) và dòng Châu Mỹ (VR-2332). Hai dòng virus này không những khác biệt về đặc tính gây bệnh mà khác nhau về mức độ nhất định về kiểu gene. Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS, ngƣời ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần nhƣ không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus này, tuy nhiên, sự khác biệt giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tƣơng đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là 70-81%. Trong khi đó, khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Châu Mỹ và chỉ tƣơng đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59%. Sự tƣơng đồng về trình tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ và Châu Âu tƣơng ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen (Trần Đức Minh). Sự khác biệt về kiểu gene đƣơng nhiên sẽ liên quan đến sự khác biệt về kiểu hình và nhƣ vậy có thể dựa vào đặc điểm gene để chẩn đoán dòng virus và ngƣợc lại. Nhƣ vậy, trên cơ sở về kiểu gene, dịch tễ học phân tử cho phép xác định chính xác bản đồ dịch tễ của một căn bệnh, quá trình xuất hiện, phát triển của virus PRRS (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định đƣợc khả năng sản xuất và sử dụng virus nhƣợc độc để làm văcxin. Ngƣời ta đã ghi nhận nhiều trƣờng hợp hội chứng PRRS trở nên trầm trọng hơn sau khi đàn heo đƣợc tiêm vắcxin virus PRRS nhƣợc độc vì cấu trúc gene của virus nhƣợc độc thay thế glycine bằng arginine ở vị trí 151 của ORFs 5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh bộ gene của chúng so 14 với bộ gene của virus nguyên thuỷ ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, và nhƣ thế độc lực của chúng cũng đƣợc phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy Virus rất thích hợp với đại thực bào đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi. Bình thƣờng đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với virus PRRS, virus có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) (phòng Dịch tễ-Cục Thú y). Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đƣờng nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor. Ngƣời ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus(Delputte và cs, 2001; Nathalie và cs, 2003) và trên MARC-145 là vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). Theo Jeong-Ki Kim và cs, 2005 thì kháng thể kháng vimentin ngăn cản sự gây nhiễm của virus trên tế bào MARC-145. Khi chuyển vimentin tái tổ hợp vào 2 dòng tế bào BHK-21 và CRFK (Crandall Rees feline kidney), không nhạy cảm với virus PRRS, thì 2 dòng tế bào này trở nên nhạy cảm với PRRSV, điều đó chứng tỏ sự tấn công và gây nhiễm của virus liên quan tới vimentin, 1 loại intermediate-filament protein (Jeong- Ki Kim và cs, 2005). Bằng kính hiển vi điện tử, ngƣời ta phát hiện những tiểu phần của virus hiện diện trong những khoang nhỏ. Kháng nguyên virus có thể phát hiện ngay 6 giờ sau gây nhiễm (Dea, 2000; Pol, 1997). Virus PRRS đƣợc lắp ráp khi nucleocapsid xuất hiện trong khoang của lƣới nội chất không hạt hay vùng Golgi hoặc cả hai. Robison và cs (1997) đã tìm thấy trong tế bào gây nhiễm MARC-145 protein M định vị tại bộ Golgi và protein N thì định vị quanh nhân và hạch nhân. Lớp vỏ bọc ngoài (envelope) chủ yếu đƣợc hình thành trong khoang của lƣới nội chất và cũng là nguyên nhân làm cho bào quan này phình to ra (Dea và cs, 1995; Mardassi và cs, 1994; Pol, 1997). Sau khi hình thành, virion đƣợc tập hợp lại và di chuyển ra màng bào tƣơng để giải phóng virus (Meulenberg, 2000). Theo Pol và Wagenaar, 1992; 15 Pol, 1997, sau khi nuôi cấy 9-12 giờ, các tế bào bị xâm nhiễm sẽ vỡ ra và giải phóng các hạt virus hoàn chỉnh (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006). Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm PRRSV (Nguồn: ) Virus PRRS mã hoá các sản phẩm gen mà chúng có thể gây ra apoptosis, một kiểu chết phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong sự cân bằng nội tại và loại bỏ những tế bào tổn thƣơng và già cỗi. Tuy nhiên cơ chế của hiện tƣợng này chƣa đƣợc biết rõ. Ngƣời ta xác định đƣợc protein GP5 của virus là tác nhân gây ra apoptosis (Meulenberg, 2000). Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồm nhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắc thể bị đứt ra từng mảnh (Suarez, 2000). Virus đạt đỉnh cao lúc 24- 48 giờ và có thể duy trì tới 60- 70 giờ sau nuôi cấy (Meng và cs, 1996). Theo Kim và cs (1993), trong quá trình nhân lên của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MA- 104 (MARC-145), hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48- 72 giờ nuôi cấy. Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào nhƣng vẫn có một số chủng virus PRRS thì không (Christianson và Joo, 1994; Yoon và cs, 1992). Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cùng là tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Benfield và cs (1992) cũng mô tả bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra nhƣ: các tế bào co tròn, trở nên thoái hoá (nhân kết đặc lại) và tách khỏi tế bào một lớp sau 2- 4 ngày nuôi cấy. Toàn bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày. Kết quả cũng tƣơng tự trên dòng tế bào PAM khi gây nhiễm virus PRRS (Pol và 16 Wagenaar, 1992; Wensvoort, 1992; Pol, 1997) (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006). Các dòng PRRSV của Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các dòng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM. Nhiều phòng thí nghiệm ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ chỉ sử dụng MARC-145 vì khó khăn khi phải nuôi cấy PAM (Han-Kook Chung và cs, 2002). Một nghiên cứu khác của Bloemraad (1994) cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào. Tuy nhiên, kết quả này có thể thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (Yoon, 2003). 2.3.2.4. Sức đề kháng Virus PRRS tồn tại đƣợc trong thời gian dài hơn 4 tháng ở -700C đến -200C nhƣng khoảng 90% khả năng gây nhiễm của virus bị mất trong vòng 1 tuần ở 40C. khả năng hồi phục của virus đã đƣợc báo cáo kéo dài đến 20 phút ở 560C, 24 giờ ở 37 0C và 6 ngày ở 210C. Virus bền vững ở pH từ 6,5 -7,5 nhƣng chết nhanh khi pH 7,65 (Benfield và cs, 1999). Nhƣ vậy, virus PRRS không bền với nhiệt độ và pH. Ngoài ra, virus dễ bị diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Các chất tẩy uế có tác dụng làm giảm khả năng lây nhiễm của virus và các chất tan dầu mỡ nhƣ chloroform và eter đặc biệt hữu hiệu trong việc phá vỡ cấu trúc vỏ ngoài của virus và làm ngừng sự tái sản (Trần Đức Minh). 2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS 2.3.3.1. Loài mắc bệnh Loài heo, cả heo nhà lẫn heo rừng đƣợc cho là loài mắc bệnh duy nhất. Tuy nhiên, vịt trời bài thải virus qua phân khi gây nhiễm thực nghiệm với virus PRRS bằng nƣớc uống, chứng tỏ vịt trời cũng mẫn cảm với virus PRRS (Ausvetplan, 2004). 2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan - Trực tiếp: do tiếp xúc trực tiếp giữa thú bệnh và thú khỏe từ mũi- mũi, qua giao phối, thú mẹ truyền virus cho thú con qua tử cung. Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn giữa thai kỳ trở đi. Lợn trƣởng thành có thể bài thải virus trong vòng 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai có thể bài thải virus trong1-2 tháng. 17 - Gián tiếp: qua chất bài tiết nhƣ dịch mũi, phân hoặc qua những giọt khí dung. Theo Hoàng Văn Năm (2001), ngoài việc vận chuyển heo bệnh vào đàn cảm nhiễm và lây lan qua không khí thì ít có bằng chứng nói về cách truyền lây khác. Tuy nhiên, ngƣời ta còn thấy việc lây lan trong đàn giống còn theo con đƣờng truyền tinh dịch. Ở những nọc nhiễm bệnh, tinh dịch trong thời kỳ virus huyết có thể gây bệnh cho đàn chƣa có miễn dịch với mức độ biểu hiện tuỳ thuộc vào kích cỡ đàn, mật độ nuôi và tình trạng vệ sinh. Nhƣ vậy, heo nọc là đối tƣợng truyền lây virus quan trọng trong đàn. 2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập Virus xâm nhập qua đƣờng hô hấp, gieo tinh, tiêu hoá (Ausvetplan, 2004), chất chứa mầm bệnh. Virus có nhiều ở chất tiết dịch mũi, tinh dịch và phân của heo bệnh. Sau cảm nhiễm, heo bệnh có thể chứa virus trong huyết thanh đến 210 ngày, trong tinh dịch 92 ngày, trong dịch mũi 21 ngày và trong dịch hầu họng đến 157 ngày. Trong đó, tinh dịch và dịch mũi là hai nguồn lây nhiễm đáng quan tâm (dẫn liệu Trần Thị Bích Huyền, 2005). 2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus nhân lên trong đại thực bào ở tiểu phế nang và trong tế bào nội mô của hệ thống lƣới võng nội. Tế bào biểu mô đƣờng hô hấp trên cũng là nơi thích hợp cho sự nhân lên của virus PRRS. Quá trình virus nhân lên và phá hủy đại thực bào gây ra bệnh tích ở thành mạch, làm thủy thũng tế bào nội mô của tĩnh mạch, giảm hàm lƣợng protein huyết tƣơng đến các mô và tạo các cục huyết khối gây nhiều hậu quả bệnh lý khác nhau. Những biểu hiện khác nhau của bệnh tuỳ thuộc vào khả năng nhân lên hay phá hủy tiểu phế nang, tế bào nội mô và tế bào lympho (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Tác động phá huỷ đại thực bào phế nang, đặc biệt trên heo con, làm giảm khả năng đề kháng của vật chủ chống lại vi khuẩn kế phát hoặc xâm nhập của các virus khác. Hầu hết sự nhiễm kế phát đƣợc quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đƣờng hô 18 hấp. Rõ ràng là nếu những tế bào bảo vệ đầu tiên nhƣ PAM bị phá huỷ thì nó sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng của vật chủ chống lại vi khuẩn và virus gây bệnh (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Theo Trần Thanh Phong (1996), do gây suy giảm miễn dịch, bệnh PRRS mở đƣờng cho những vi sinh vật cơ hội nhƣ: Pasteurella multosida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, A. pleuropneumoniae, Chlamydia psittaci, Leptospira interrogans, virus giả dại, virus cúm, Enterovirus, Parvovirus… Trên nái mang thai, virus ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào bạch cầu, tế bào đơn nhân trong dòng máu để đến cơ quan sinh sản. Cảm nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào của quá trình mang thai nhƣng biểu hiện lâm sàng phụ thuộc vào lớn vào giai đoạn nhiễm trùng của bào thai và độc lực của chủng virus gây bệnh. Nhiễm trùng ở giai đoạn đầu và giai đoạn giữa của kỳ mang thai không có hay chỉ có tác động nhẹ so với cảm nhiễm ở giai đoạn sau. Cảm nhiễm xảy ra trong thời kỳ phôi thƣờng có mức độ biểu hiện bệnh rất thấp vì tế bào phôi chƣa biệt hoá, không thích hợp cho sự nhân lên của virus. Mặt khác, lúc này trứng thụ tinh chƣa gắn chặt chẽ với nội mạc tử cung nên sự truyền virus từ mẹ sang phôi bị hạn chế. Trong khi ở giai đoạn sau của kỳ có mang, nhau thai và mạch máu nuôi thai rất phát triển, nhau thai trở thành bộ phận trao đổi chất cần thiết, đồng thời là cầu nối truyền virus và kháng thể chống virus từ mẹ sang thai. Virus có thể qua nhau ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào khác của thú mẹ. Nhiễm trùng giai đoạn này tạo ra nhiều vết bong tróc nhỏ trên tế bào biểu mô nhau thai và bệnh tích hoại tử động mạch cuống rốn, từ đó làm cho bào thai bị thiếu dƣỡng chất, thiếu O2, gây sảy thai kỳ cuối, heo con sinh ra yếu ớt, dị tật và tăng tỷ lệ thai chết tƣơi khi sanh (Prieto và cs, 2000; dẫn liệu của Hoàng Văn Năm, 2001). Nhiễm bệnh dai dẳng cũng là một đặc trƣng của Arterivirus, sự tồn tại dai dẳng gây ra nhiễm bệnh âm ỉ, virus hiện diện ở mức độ thấp trong cơ thể thú và giảm dần theo thời gian (Trần Đức Minh). Theo R.Allende và cs (2000) vào ngày 150 sau gây nhiễm thực nghiệm không phân lập đƣợc virus bằng nuôi cấy tế bào và không phát hiện đƣợc RNA của virus bằng phƣơng pháp RT-PCR. 19 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS (Nguồn:Rosssow, 1998) Virus PRRS Lây lan trực tiếp qua đƣờng tiêu hoá, gieo tinh và hô hấp Nhân lên trong màng nhày phổi hoặc đại thực bào Virus tấn công vào hạch lâm ba Vào máu gây virus huyết Phân bố đến các hệ thống của cơ thể và tới các tế bào đơn nhân hoặc đại thực bào Biểu hiện lâm sàng Nái : Sảy thai Phối không đậu Heo sơ sinh Khó thở, dấu hiệu thần kinh và tỷ lệ chết cao Heo sau cai sữa Gia tăng tỷ lệ chết, có biểu hiện hô hấp Heo thịt Sốt, ăn ít Nọc Ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh 20 2.3.4. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng bệnh thể hiện rất khác nhau, theo ƣớc tính, cứ 3 đàn đầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện bệnh, một đàn có biểu hiện ở mức độ vừa và một đàn ở mức độ nặng. Lý do cho việc này vẫn chƣa có lời giải, tuy nhiên với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh cũng giảm nhẹ hơn, và cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau. Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dƣơng tính nhƣng không có biểu hiện lâm sàng (phòng Dịch tễ, Cục Thú y). Theo Trần Đức Minh thì mức độ lâm sàng thay đổi tuỳ chủng virus, sự biến động khả năng gây bệnh của virus, hàm lƣợng virus tăng trong máu và các mô, khả năng của các chủng có độc lực cao để tái sản hữu hiệu hơn trong cơ thể ký chủ. Bệnh tích  Bệnh tích đại thể: - Da có thể xuất huyết, thâm tím do chảy máu trong mô. - Phổi tụ huyết, viêm phổi thuỳ trƣớc với những ổ viêm đốm màu xám, có nhiều dịch ở phổi và màng bao tim. - Có những ổ hoại tử trên nhau thai của nái bệnh.  Bệnh tích vi thể: - Viêm phổi hoại tử. - Có sự thoái hoá các đại thực bào ở tiểu phế nang. Hình 2.4. Triệu chứng tai xanh Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS (Nguồn: và 2.3.5. Chẩn đoán 2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng 21 Theo Benfiled (1999), khi trong đàn heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên các hạng heo, sinh sản bất ổn và năng suất đàn giảm hơn bình thƣờng thì có thể nghi ngờ bệnh do virus PRRS. Mặt khác, theo Taylor (1995) và dẫn liệu của Hoàng Văn Năm (2001) có cơ sở nghi ngờ bệnh khi: Tỷ lệ chết lúc sinh >20% Tỷ lệ sảy thai >8% Tỷ lệ heo con chết trƣớc khi cai sữa >26% Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vƣợt quá 25%. Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phƣơng pháp chẩn đoán phi lâm sàng khác (dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng 2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 2.3.5.2.1.1. Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay) Đây là phản ứng đầu tiên đƣợc sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS đƣợc gọi là kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp. Kỹ thuật này có thể thực hiện trên các dòng tế bào PAM, CL2621, MARC-145. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ đƣợc gây nhiễm với PRRSV và đƣợc ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó tế bào đƣợc gây nhiễm sẽ đƣợc cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 370C và đƣợc cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 30-50% tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen trong 30 phút. Không có sự thay đổi màu của tế bào khi kết quả là âm tính. IPMA đƣợc sử dụng nhiều ở châu âu. Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, ngƣời ta thƣờng sử dụng IPMA vì xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày và có thể phát hiện kháng thể đến 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là không thể xác định trực tiếp hàm lƣợng kháng thể bảo vệ. 2.3.5.2.1.2. Phản ứng IFA (Indirect Immunhofloresence Assay) 22 Giống nhƣ trong kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA (kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào. Quá trình thực hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate). Việc đọc kết quả cần phải có kính hiển vi huỳnh quang. sự hiện diện của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus. Phản ứng có độ đặc hiệu cao 99,5% và cho phép phát hiện kháng thể kháng virus đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhƣợc điểm của IFA và IPMA là không thể làm tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn. 2.3.5.2.1.3. Phản ứng SN (Serum Neutralizing) Đây là phản ứng trung hòa virus, phản ứng này có độ đặc hiệu cao nhất, đƣợc sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus. Nhƣợc điểm của phản ứng này là đắc tiền, khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm). Tuy nhiên đây là phản ứng rất tốt để xác định miễn dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007 và dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 2.3.5.2.1.4. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phƣơng pháp này là dễ cho kết quả dƣơng tính giả. Tỷ số S/P (sample/position)≥0,4 thì kết quả đƣợc ghi nhận là dƣơng tính. Các phản ứng IFA, SN, ELISA đƣợc sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nƣớc Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên Phƣơng pháp FA (florescent antibody staining-kháng thể huỳnh quang) và IHC (immunohistochemistry staining-hoá mô miễn dịch) có thể đƣợc sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu mô. 23  Phƣơng pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh. Phƣơng pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. để đảm bảo kết quả chẩn đoán, mẫu cần đƣợc lấy và làm lạnh nhanh.  Phƣơng pháp IHC cũng đƣợc thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phƣơng pháp này có thể thực hiện với các mẫu mô đã đƣợc cố định bằng formol. Điều này là khá quan trọng vì rất thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm. IHC có độ nhạy cao hơn so với FA nhƣng mất nhiều thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phƣơng pháp nuôi cấy tế bào vì thế nó đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều dạng khác nhau của PCR đƣợc sử dụng, hầu hết chúng đƣợc sử dụng để phát hiện các vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus. Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 dòng virus thì Han-Kook Chung và cs (2002) đã sử dụng phƣơng pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR) . Fun in wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thƣơng phẩm và trong tinh dịch con đực. Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chƣa đủ làm cơ sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác định tình trạng nhiễm của đàn và kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ kỹ thuật cao. Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch RNA phải đƣợc thực hiện một cách nghiêm ngặt. Do đó kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau. 2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào Trong phân lập virus, cũng nhƣ các phƣơng pháp chẩn đoán khác, khâu đầu tiên và quan trọng nhất đó là cách lấy mẫu và bảo quản mẫu. Mẫu xét nghiệm có thể là huyết thanh, dịch tràn ổ bụng, dịch phế nang, dịch mẫu mô (hạch, phổi, lách). 24 Trong số đó thì dịch phế nang và huyết thanh đƣợc đánh giá là mẫu tốt nhất cho việc phân lập virus khi dịch bùng phát. PRRSV tồn tại trong huyết thanh lâu hơn trong mô, nhƣng đối với thú già thì lại có nhiều PRRSV trong mô hơn trong máu. Đối với các trƣờng hợp sảy thai ở thời kỳ cuối hay sinh sớm thì nên lấy mẫu ở những heo con sinh ra yếu, trƣớc khi cho bú hơn là thai khô, thai chết lƣu. Việc phân lập virus đối với những thú nhiễm bệnh mãn tính thì hạch amiđan, dịch rữa khí quản là những mẫu có khả năng nuôi cấy tốt hơn so với mẫu huyết thanh và phổi. Một điểm quan trọng khác cần chú ý là nhiệt độ bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển và phân lập virus. Các mẫu bệnh phẩm cần phải đƣợc bảo quản ở 40C hay thấp hơn trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm và thời gian giữ mẫu ở nhiệt độ này tốt nhất là không quá 48 giờ. Những mẫu bệnh phẩm lƣu giữ trong một thời gian dài bắt buộc phải đƣợc bảo quản ở -700C, không đƣợc đông và rã đông mẫu nhiều lần. Việc phân lập virus gặp nhiều khó khăn vì virus chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (Porcine