Khóa luận Phát hiện loài Fusarium SPP gây bệnh thối xương rồng (Cactaceae) bằng phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)

Diaspis echinocacti Bouche) thuộc bộ cánh đều họ rệp sáp hình thuẫn. Chúng dùng miệng chích hút để hút nhựa cây xƣơng rồng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây. Mỗi năm phát sinh 2 – 3 lứa, tháng 5 – 7 và tháng 10 năm sau đều có rệp gây hại. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002). 2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và khả năng gây bệnh của nấm Fusarium 2.3.1. Sự phân loại Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Sordariomycetes 13 Bộ (Order) Hypocreales Họ (genus) Fusarium (Nguồn:http:// en.wikipedia.org/wiki/Fusarium). Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. a. Nấm có dạng hình lƣỡi liềm. b. Vách ngăn. (Nguồn: Moulds/Illustrations/Fusarium_drawing.jpg) Nấm Fusarium thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu tính là gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes). Có tế bào sinh bào tử trần. Fusarium đặc trƣng bởi hệ sợi nấm ngăn vách màu trắng hoặc có một số màu khác nhƣng thƣờng có màu trắng. Nấm Fusarium có cành bào tử phân sinh, giá trần bào tử đơn độc hoặc tụ họp trong các đệm giá (Sporodochia) hoặc thành đệm cho giá nhầy (Pionnetes) đơn hoặc phân nhánh, các tế bào sinh bào tử trần là các thể bình đơn độc hoặc thành cụm trên đỉnh giá bào tử trần, đỉnh các nhánh của giá hoặc trực tiếp trên thân giá, trên các sợi nấm không phân hóa hình thái. Bào tử trần thƣờng ẩm ƣớt tụ họp thành khối cầu ở đỉnh thể bình hoặc hình chuối. Nấm có 2 dạng bào tử: bào tử trần lớn (Macroconidia) và bào tử trần nhỏ (Microconidia). Bào tử trần lớn có một đến nhiều vách ngăn, hình lƣỡi liềm có hoặc không có gót ở ngăn gốc. Bào tử trần nhỏ không có hoặc có 1 – 2 vách ngăn, hình elip, hình trứng, hình trụ, hình gần cầu, thƣờng không màu hoặc màu trắng nhạt. a b 14 2.3.2. Sự phân bố Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm bệnh phân bố rất rộng trên khắp thế giới, nấm Fusarium gây thiệt hại trên các loại cây trồng và gây ảnh hƣởng rất lớn đến kinh tế, đặc biệt ở vùng Châu Phi, Châu Mỹ và các nƣớc nhƣ: Australia, Panama, Hawaii, Philippines, Taiwan và các nƣớc Đông Nam Á. Bệnh do nấm Fusarium đƣợc phát hiện vào năm 1809 do nhà bác học Link, H.F. Sau đó vào năm 1821 đƣợc nhà bác học Fries, E. bổ sung thêm. 2.3.3. Phạm vi kí chủ Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm Fusarium có rất nhiều dòng khác nhau nên khả năng ký chủ rất rộng trên nhiều loại cây trồng nhƣ: cây ăn trái, cây rau màu và một số cây hoa cảnh, có thể sống trong các điều kiện khác nhau và có thể tồn tại trong đất một thời gian dài, trong các xác bã thực vật dƣới nhiều dạng khác nhau, bào tử nấm có thể tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài sau đó gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và lây lan. Nấm gây hại nặng trên một số cây trồng đặc biệt là trên cây ăn trái nhƣ: chuối, xoài, nhãn, nho, ổi, cam quýt, đu đủ, bơ…. Ngoài ra, có một số dòng nấm Fusarium gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ: gây ung thƣ họng ở ngƣời và ung thƣ bán cầu đại não trên ngựa và chuột (Thiel, P.G và ctv, 1991). 2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium Theo Bugnicourt F. (1939), nấm Fusarium có phổ kí chủ rất rộng trong các điều kiện khác nhau và có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 5ºC– 400C. 2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. và biện pháp phòng trừ 2.4.1. Khả năng gây hại Lester W. Burgess và ctv, (1988), đại học Sydney (Australila) xác định 13 nhóm, 20 loài gây hại trên một số cây trồng sau: 15 Loài F. latertium: đƣợc phân lập trên cây dâu bị bệnh khô đen nhánh, trên cây Celosia bị bệnh thối thân. Một vài phân lập đƣợc ghi nhận chúng hiện diện trên cây cà phê ở Papua, New Guinea. Loài F. decemcellulare: loài này thƣờng hiện diện ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Chúng đƣợc phân lập từ những cây bị bệnh loét, khô cành. Từ các cây ca cao bị bƣớu ở Nam Mỹ. Loài F. moniliforme: loài này thƣờng xuất hiện ở vùng khí hậu ấm. Chúng thƣờng đƣợc phân lập từ những cây có triệu chứng bệnh thối thân, thối bắp, thối rễ cây Sorghum (Burgess, 1986), thối ngọn ở cây mía, gây hƣ hỏng hạt lúa. Loài này có khả năng nhiễm vào hạt giống của một vài cây kí chủ nhƣ: ngô, lúa…. Chúng có khả năng tạo ra độc tố moniliformin (Vesonder và Hesseltine, 1981). Loài F. solani: là loài có khả năng sống trong đất, phân bố trên phạm vi toàn thế giới, xuất hiện ở các vùng mƣa nhiều và đất thoát nƣớc kém. Là loài phổ biến nhất ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Chúng gây thối rễ, cổ rễ của nhiều loại cây trồng: đậu, cà chua. Gây thối củ, gây bệnh loét, chết khô của nhiều loại cây trồng ( Nelson, 1981). Loài F. oxysporum: loài này phổ biến trong đất canh tác ở vùng ôn đới và nhiệt đới. Loài này gồm nhiều dòng khác nhau và gây bệnh nghiêm trọng: gây héo mạch dẫn (Beckman, 1987), gây thối rạp cây con ( Nelson, 1981), gây thối rễ và cổ rễ (Jarvis và Shoemmaker, 1978). Loài này có hơn 100 dòng khác nhau và bệnh héo là một vấn đề quan trọng. Loài F. sambucinum: loài này thƣờng đƣợc phân lập từ rễ cây thông và nhiều cây khác bị bệnh rễ. Loài F. semitectum: loài này rất phổ biến trong đất nông nghiệp, ở các vùng nhiệt đới và ôn đới. Chúng đƣợc phân lập từ các bộ phận dƣới đất: thân, rễ, củ và các bộ phận trên mặt đất. Theo Booth (1973), phân lập và nghiên cứu loài Fusarium. Một số loài đƣợc trích dẫn dƣới đây: 16 Loài F. solani: loài này đƣợc phân lập từ các cây bị vết thƣơng hoặc từ các cây bị nhiễm các loài nấm Phythium, Phytophthora, Rhizoctolani và các loài Fusarium khác. Loài này cũng gây hƣ hại nhiều loại thực phẩm. Loài F. solani f. sp. batatas: gây hại trên cây khoai lang. Loài F. solani f. sp. cucuritae: gây hại trên cây mía. Loài F. solani f. sp. phaceoli: gây hại trên cây đậu hà lan. Loài F. decemcecllulare: loài này đƣợc phân lập trên nhiều loại cây trồng ở nhiều nƣớc khác nhau: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Indonesia… Loài F. semitectum: loài này rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Đƣợc phân lập trên cây cà chua, ngô, chuối, đậu phộng… Loài F. moniliforme: loài này gây thối cây con, gây mốc hạt gạo, gây thối rễ cây bông vải, gây thối các cơ quan cây ngô, thối ngọn mía, xâm nhập vào hoa, quả cây chuối. Loài này có hơn 110 dòng khác nhau và có tính độc khác nhau. Một số dòng có tính độc đƣợc phân lập từ cây ngô ở Mỹ, khả năng gây bệnh phụ thuộc vào chu kỳ sống của nấm và điều kiện ngoại cảnh. Chúng có khả năng tạo ra gibberellia kích thích sự phát triển cây trồng. 2.4.2. Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp 2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh Theo Bùi Xuân Đồng (1986), khi trồng phải xem xét điều kiện sinh thái đất đai mà chọn các giống thích hợp cho từng điều kiện của vùng và cần xem xét thƣờng xuyên về những thay đổi tính chống chịu của giống. 2.4.2.2. Biện pháp canh tác Theo Bùi Xuân Đồng (1986), biện pháp này rất quan trọng để phòng trừ nấm Fusarium. Trƣớc khi trồng phải làm đất kỹ, xử lý đất, bón phân hợp lý, luôn vệ sinh vƣờn sạch, thoáng mát. Nếu phát hiện bệnh phải thu gom các bộ phận bị bệnh đi tiêu hủy tránh sự lây lan trong vƣờn, chăm sóc kỹ cho từng giai đoạn sinh trƣởng của cây. Cần ngăn chặn di chuyển những cây bị bệnh từ vùng này sang vùng khác 17 tránh đƣợc mầm bệnh ban đầu. Khi cây bị bệnh có thể đào bỏ, xử lý đất bằng vôi hay một số loại thuốc trừ nấm khác. 2.4.2.3. Biện pháp hóa học Theo Bùi Xuân Đồng (1986), trên một số cây trồng có thể sử dụng một số thuốc hóa học trừ nấm khi cây bị nhiễm bệnh nhƣ: Metazeb, Benomyl, Rovral, Ridomil, Copper và một số thuốc khác, liều dùng nhƣ khuyến cáo. Sử dụng thuốc trên bằng cách phun hoặc tƣới vào gốc cây bị bệnh một vài lần cách nhau 7 – 10 ngày. 2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium Hình 2.2. Bản đồ vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM- ID Theo David M. Geiser và cộng sự (2004), gen tef giải mã một số protein thiết yếu cho bộ máy dịch mã, có tính hữu ích cao trong nghiên cứu sự phát sinh loài vì nó mang thông tin cao ở mức độ loài của Fusarium. Gen này lần đầu tiên đƣợc sử dụng nhƣ một marker trong nghiên cứu phát sinh loài để suy ra mối tƣơng quan và mức độ di truyền giữa các loài (Cho và ctv, 1995; Mitchell và ctv, 1997). Primer lần đầu tiên đƣợc phát triển trên nấm để khám phá và kiểm tra chuỗi thế hệ của các dòng Fusarium oxysporum (O` Donnell và ctv., 1998). Primer ef1 và ef2 đƣợc thiết kế dựa trên một phần vị trí exons giữa Trichoderma reesei và Histoplasma capsulatum. Các primer này có thể khuếch đại vùng 700 bp của gen tef flanking với 3 intron mà tổng số hơn nữa chiều dài của đơn vị siêu sao chép trong tất cả các loài đã biết (hình 2.2). Gen này xuất hiện phù hợp với số lƣợng copy đơn trên nấm Fusariium, và nó thể hiện mức độ cao của các trình tự đa hình giữa các loài có quan hệ mật thiết, ngay cả trong so sánh các phần của gen giải mã protein nhƣ là 18 calmodulin, beta-tubulin và histon H3. Vì các lý do đó, tef đã trở thành marker chọn lọc nhƣ là công cụ xác định single - locus trên nấm Fusarium. Ngoài nấm Fusarium thì trên các loại nấm khác chẳng hạn nhƣ nấm Trichoderma cũng có vùng tef. Trên nấm này vùng tef cho kết quả chính xác hơn là dựa vào vùng rDNA-ITS vì các loài vẫn có sự tƣơng đồng về trình tự trong vùng rDNA-ITS. Tef hữu ích trong việc xác định vùng gen chuyên biệt nhƣ vùng gen mã hoá actin, calmodulin, endochitinase, nó còn cho phép phân biệt đƣợc giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Trong phòng thí nghiệm, vùng tef đƣợc quan tâm và khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc khoảng 600 bp (Gary J. Semuels). (trích dẫn bởi Lại Hà Tố Hoa, 2006). Một nhóm nghiên cứu gồm Bogale, Mesfin và ctv (2007), đã sử dụng trình tự gen tef để thiết kế primer chuyên biệt cho các loài Fusarium redolens và trong kỹ thuật PCR- RFLP để phân biệt giữa 3 loài Fusarium oxysporum cùng một tổ tiên chung. Gần đây hình thái học và các kỹ thuật chẩn đoán phân tử về nấm Fusarium redolens và 3 dòng Fusarium oxysporum phát sinh loài từ một tổ tiên chung còn mơ hồ. Do đó trình tự gen tef từ những loài này và các loài có mối quan hệ mật thiết với chúng đƣợc sử dụng để thiết kế primer chuyên biệt cho loài F. redolens, và để xác định vị trí giới hạn phân biệt giữa 3 loài F. oxysporum có chung một tổ tiên. 2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đƣợc mô tả bởi Kary Mullis và các cộng sự (1985). 2.6.1. Khái niệm Đây là phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA cần đƣợc khuếch đại. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt. 19 Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của bộ gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho từng loại vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật. Primer là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002). 2.6.2. Nguyên tắc Sự khuếch đại đƣợc thực hiện nhờ chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: (giai đoạn biến tính: tách sợi đơn DNA, denaturation) Ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn và nhiệt độ cần thiết để biến tính hoàn toàn DNA thƣờng là 94 – 950C trong 30 – 60 giây. Giai đoạn 2: (giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn, anealation) Khi nhiệt độ hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung với primer. Nhiệt độ cho giai đoạn này là 50 – 640C. Giai đoạn 3: (giai đoạn tổng hợp, kéo dài, elongation) Nhiệt độ tăng lên 720C, ở nhiệt độ này Taq DNA polymerase hoạt động tối ƣu. Trong khoảng 30 giây cho đến vài phút tùy theo kích thƣớc cần khuếch đại. Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình tự của mạch khuôn, độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn đã bắt cặp với 2 DNA khuôn mạch đơn, các nucleotid lần lƣợt đƣợc gắn vào mỗi đầu DNA khuôn sợi đơn, gắn kế tiếp các nucleotid của primer và chiều bổ sung là 5’ ở trên cả 2 DNA sợi đơn. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 giai đoạn nhƣ trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều chu kỳ và làm gia tăng số lƣợng DNA theo cấp số nhân. Sự khuếch đại này đƣợc tính nhƣ sau: Tổng số DNA khuếch đại= m x 2n . 20 Trong đó: n là số chu kỳ thực hiện. m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra. Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm. Trong số 3 giai đoạn trên, giai đoạn 2 quan trọng nhất bởi vì trong giai đoạn này sự lai DNA – DNA giữa primer và khuôn xảy ra. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá thấp thì việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá cao thì không lai đƣợc DNA. Vì thế để thiết lập nhiệt độ cho phản ứng PCR ngƣời ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer nhƣ sau: Tm= 4 x (G+X) + 2(A+T) 0 C. 2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR  DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu đƣợc trực tiếp từ dịch trích tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật nhỏ khoảng 1 g. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả.  Enzyme DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao: Taq polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus (vi khuẩn suối nƣớc nóng). Taq polymerase quá cao sẽ thấy hiện tƣợng tổng hợp DNA do phản ứng giả của primer trên dây đơn, đây là những kết quả không chuyên tính sẽ làm sai lệch kết quả, còn nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp sẽ không có đủ số lƣợng enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.  Primer và nhiệt độ lai Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: 21  Trình tự primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuôi” và primer “ngƣợc”, không có những cấu trúc “primer dimer” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer.  Nhiệt độ nóng chảy Tm của primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng tránh lặp đi lặp lại nhiều lần.  Các primer phải đặt trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Các thành phần khác trong phản ứng PCR Bốn loại nucleotide (dNTP) thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ là 200 nM/mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sản phẩm khuếch đại dƣơng tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. Nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra các ảnh hƣởng rất khác nhau trong phản ứng PCR.  Số lƣợng chu kỳ phản ứng Số chu kỳ trong phản ứng thông thƣờng không đƣợc vƣợt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ làm ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lƣợng mẫu ban đầu.  Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR Máy PCR cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh, thật chính xác, tránh tối đa sự bốc hơi nƣớc trong quá trình thực hiện phản ứng PCR. Eppendorf dùng cho phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt. 22 2.6.4. Ứng dụng của PCR Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nƣớc, phát hiện pháp y, điều tra tội phạm. Ứng dụng PCR để sản xuất những mẫu dò dùng trong phƣơng pháp lai phân tử, xác định các trình tự acid nucleic, tạo các đột biến điểm định hƣớng. Hơn thế nữa PCR còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhƣ:  Trong nghiên cứu genome học Nhân bản vô tính với PCR. Recombinant PCR. Kỹ thuật footprinting DnaseI. Multiplex PCR. HLA DNA (các kháng nguyên bạch cầu ngƣời) 2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing Kỹ thuật DNA sequencing là công trình đƣợc công bố bởi Maxam và Gilbert (1977). Tuy nhiên hơn 20 năm qua kỹ thuật này đƣợc cải tiến rất nhiều. Đặc biệt với sự trợ giúp của computer, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của phƣơng pháp PCR và kỹ thuật điện di, kỹ thuật DNA sequencing trở thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho phân tích genome. Khái niệm: Kỹ thuật DNA sequencing là kỹ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotid hình thành nên phân tử DNA (Alphey, 1997). 2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. 2.8.1. Trên thế giới Tuy hiện nay các kỹ thuật công nghệ sinh học rất phát triển nhƣng dƣờng nhƣ việc ứng dụng các kỹ thuật này để định danh hay chẩn đoán bệnh do nấm Fusarium spp. gây hại trên xƣơng rồng rất ít. Và theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện 23 nấm Fusarium spp. gây bệnh trên xƣơng rồng. Chỉ có chẩn đoán và phát hiện nấm Fusarium spp. bằng biện pháp sinh học phân tử trong một số lĩnh vực nhƣ là: Ralph A. Wang, Yi-Hong và cộng sự, (2002) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện genotype kháng Fusarium gây bệnh héo trên cây trồng. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát hiện genotype của cây họ bầu bí kháng hay mẫn cảm với sự nhiễm Fusarium. Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng phƣơng pháp PCR để khuếch đại DNA mẫu, sử dụng cặp mồi AM hoặc FM. Sản phẩm PCR từ các cặp mồi khác nhau về kích cở, phụ thuộc vào DNA mẫu thu đƣợc từ cây mẫn cảm hay kháng nấm Fusarium, nghiên cứu đã xác định nhanh và chính xác kiểu gen của cây trồng. Hirano, Yasushi và ctv (2006), đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phân biệt Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici và radicis-lycopersici và loài F. oxysporum f. sp. lycopersici gây bệnh trên cây cà chua. Bằng cách so sánh một phần trình tự của gen mã hóa enzyme endopolygalacturonase (pg1) và enzyme exopolygalacturonase (pgx4) phân lập từ F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) và radicis-lycopersici (FORL) ở Nhật Bản và thiết kế các primer chuyên biệt (uni, sp13, sp23, and sprl) trên các nucleotide khác nhau của các loài gây bệnh. PCR với primer uni khuếch đại đoạn gen dài 670 - 672 bp từ FOL và FORL. Với primer sp13, chỉ thu đƣợc từ loài FOL 1 và 3. Với primer sp23, đoạn gen 518 bp thu đƣợc từ loài FOL 2 và 3 đƣợc khuếch đại. Primer sprl cho sản phẩm khuếch đại dài 947 bp, từ loài FORL , nhƣng không cho sản phẩm ở loài FOL. Yli - Mattila T., Paavenen S. và ctv (1996), đã sử dụng phƣơng pháp Isozyme và RAPD-PCR trong phân tích sự đa hình các dòng Fusarium avenceum ở Phần Lan. Kỹ thuật izozyme và RAPD - PCR đƣợc so sánh trong nghiên cứu đa hình giữa 33 dòng Fusarium avenaceum sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide và điện di trên gel agarose. Kỹ thuật isozyme đã phát hiện đƣợc 5 sự đa hình và độ tƣơng đồng là 70%, còn phƣơng pháp RAPD - PCR cho phép phân tích tất cả các dòng của F. avenaceum. Kết quả phenotype từ phân tích 24 RAPD - PCR đƣợc chia thành 5 nhóm chính bằng phân tích trung bình cộng và độ tƣơng đồng là 55%. Chiocchetti Annalisa và ctv, (1999) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. basilici trên cây húng. Bằng cách sử dụng 69 trình tự DNA đƣợc khuếch đại, tạo ra từ sự phân lập các dòng Fusarium oxysporum f. sp. basilici khác nhau, F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp dot blot. Một trình tự dài 1038 bp đƣợc lai DNA từ tất cả các dòng F. oxysporum f. sp. basilici nhƣng không thu đƣợc đoạn DNA từ các dòng F. oxysporum phân lập từ các cây húng không mang bệnh hoặc các dạng đặc biệt khác điển hình của F. oxysporum, hoặc từ sự phân lập các loài F. redolens, F. tabacinum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, S. minor, và Pythium ultimum thu đƣợc từ các cây húng bị bệnh. Trình tự này đƣợc tạo dòng và đọc trình tự, 3 cặp mồi chuyên biệt của F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc thiết kế, lần lƣợt cho sản phẩm khuếch đại là 943, 382, và 330 bp. Kỹ thuật nested PCR cho phép phát hiện F. oxysporum f. sp. basilici từ hạt bị bệnh và hạt bị nhiễm bẩn do tự nhiên hoặc nhân tạo. R N Crowhurst và cộng sự (1991), đã phân biệt sự khác nhau giữa nấm Fusarium solani f. sp. cucurbitae loài 1 và 2 bằng kỹ thuật RAPD. Phƣơng pháp này sử dụng để đánh giá sự đa dạng về genome giữa 21 dòng F. solani f. sp. cucurbitae loài 1 và loài 2. 7 sản phẩm đa hình nhờ RAPD đã sử dụng probe trong lai Southern genomic DNA trong đó 6 của 7 probe trong lai phân tử đƣợc sao chép trong giải trình tự đơn và 5 của 7 probe biểu hiện một sự lai chuyên biệt. Một nhóm nghiên cứu ngƣời Pháp (2000), đã sử dụng probe rDNA oligonucleotide và phƣơng pháp PCR để phát hiện nấm Fusarium oxysporum. Kỹ thuật PCR và lai phân tử đƣợc phát triển để phát hiện Fusarium oxysporum. Các dữ liệu trên trình tự từ rRNA 28S, 2 primer (PFO2 và PFO3) và probe 20 – mer đƣợc thiết kế. Những oligonucleotide này đƣợc kiểm tra trên 16 dòng F. oxysporum và 80 dòng của 23 loài Fusarium khác hoặc của 8 loài từ giống nấm khác. Phƣơng pháp PCR để khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt từ các dòng F. oxysporum sử dụng các primer PFO2 và PFO3. Khi ở dƣới điều kiện cho phép, không thu đƣợc sản phẩm 25 PCR từ các primer này trên 80 dòng nấm khác. Probe oligonucleotide HFO1 đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp phóng xạ tự ghi và đánh giá sự khác biệt trong các thử nghiệm lai dot blot với rRNA khuếch đại bởi PCR. Dƣới điều kiện khách quan, lai probe với DNA từ các dòng F. oxysporum cho kết quả tốt. John Paul Jone và Pat Crill (1974), nghiên cứu tính kháng bệnh héo do Fusarium gây ra trên cây cà chua nhận thấy rằng giống M.A.160 và một số dòng khác mang gen I có khả năng kháng loài F. oxysporum f. sp. lycopersici. Một số dòng khác không mang gen này sẽ bị nhiễm bệnh. Nhóm nghiên cứu của Matias Pasquali, Alberto Acquadro và ctv (2004), đã nghiên cứu đề tài: Sự phát triển primer để tiến hành PCR phát hiện một loài Fusarium oxysporum mới gây bệnh trên cây cúc Pari. Cặp primer Mg5/Mg6 có thể xác định một cách chuyên biệt 9 dòng Fusarium oxysporum đƣợc kiểm tra từ A.frutescens, khi DNA genome của nấm đƣợc sử dụng nhƣ mẫu để kiểm tra. Ngoài ra, cặp primer Mg5/Mg6 cho phép phát hiện thành công các mô gốc và rễ mang bệnh từ cây không mang triệu chứng bệnh bên ngoài. Một nhóm nghiên cứu gồm Zhenggang Zhang và cộng sự (2005), đã sử dụng phƣơng pháp phân tử để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. niveum và Mycosphaerella melonis nhiễm trong mẫu thực vật và đất. Với việc phát triển 2 loại PCR chuyên biệt để phát hiện nhanh và chính xác nấm gây bệnh Fusarium oxysporum f. sp. niveum và Mycosphaerella melonis trên mẫu thực vật và mẫu đất. 2 cặp primer chuyên biệt, Fn-1/Fn-2 và Mn-1/Mn-2 đƣợc tổng hợp. Primer Fn-1/Fn- 2 single PCR khuếch đại chỉ cho band khoảng 320 bp từ F. oxysporum f. sp.niveum, và primer Mn-1/Mn-2 cho sản phẩm PCR khoảng 420 bp từ M. melonis. 2.8.2. Tại Việt Nam Theo chúng tôi tìm hiểu thì tại Việt Nam hiện nay chƣa thấy có tài liệu nào nói về việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện nấm Fusarium spp. gây hại trên xƣơng rồng. 26 2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam Bảng 2.1. Một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996) STT Tên bệnh Phân loại 1 Héo vàng cây khoai lang Fusarium batatas 2 Mốc hồng ngô F.moniliform f.sp. maydis 3 Lở gốc đậu tƣơng F.oxysporum f.sp. glysines 4 Héo vàng cây dƣa chuột F.solani f.sp.cucumerium 5 Héo vàng cây gừng F.oxysporum f.sp.zinggeberi 6 Vết xám trên cỏ lồng vực Fusarium sp. 7 Héo vàng cây hoa loa kèn F.oxysporum f.sp.lini 8 Vết xám trên cành chanh F.semitectum Berk 9 Thối củ chuối F.oxysporum f.sp.cubense 10 Héo vàng cây đinh lăng F.oxysporum f.sp.medicagins 11 Thối nhũn cây xƣơng rồng Fusarium oxysporum 27 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu thí nghiệm 3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu  Thời gian: Đề tài đƣợc tiến hành từ 20/03/2007 đến 3