Khóa luận Phát hiện và định lượng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon) bằng kỹ thuật Real - Time PCR

V và 50 mA. Sau khi điện di hoàn tất (khi thấy vệt màu xanh cách mép gel agarose khoảng 2 – 2,5 cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đẩy nhẹ gel lên bàn đọc UV. Xem các băng ADN dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad. Phân tích kết quả điện di dựa trên kích thước đoạn ADN đặc hiệu được xác định dựa trên thang ADN chuẩn (chi tiết ở mục 3.4.5.2). Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR được tóm tắt qua Sơ đồ 3.2. 35 Chạy Non Stop Nested PCR Sơ đồ 3.2 Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR Chuẩn bị hỗn hợp Non Stop Nested PCR Chạy điện di Mẫu tôm Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt Tinh sạch bằng Instagene Matrix 633bp 221bp Phân tích kết quả 36 3.4.5. Cách đọc kết quả 3.4.5.1. Real - time PCR Kết quả sau khi thực hiện Real - time PCR được xử lý trên phần mềm iQ version 3.1 của máy iCycler iQ và phần mềm excel. Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR được phân tích qua đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng kết quả chạy mẫu. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Trong suốt thời gian chạy chương trình Real - time PCR, ta có thể nhận biết sự biểu hiện nồng độ ADN của WSSV trong các mẫu thử bằng cách quan sát các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang trên màn hình vi tính. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ để biết mẫu dương tính và mẫu âm tính. Có hai cách thể hiện đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ: dạng log (log view) – đơn vị huỳnh quang ở trục Y được tính ở dạng log và ▲: các chuẩn : mẫu dương tính : mẫu âm tính : đối chứng âm Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang Baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền) Chu kỳ ngưỡng (Ct) 37 dạng biểu diễn thường (normal view) – đơn vị huỳnh quang ở trục Y được tính ở dạng số thường, không quy đổi ra log. Trong đề tài này tôi chọn cách phân tích kết quả ở dạng log (Hình 3.5). Đồ thị thể hiện các mẫu dương tính là các mẫu có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền). Các mẫu âm tính là các mẫu có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted. Đồ thị ở Hình 3.5 sẽ giúp người phân tích xác định được chu kỳ ngưỡng. Chu kỳ ngưỡng được xác định khi đường baseline subtracted cắt tất cả các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của mẫu kiểm tra trong giai đoạn tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ (pha log). Sau đó phân tích đường chuẩn và bảng kết quả để biết được hàm lượng WSSV có ban đầu trong 2 µl mẫu thử. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn Đường chuẩn được dựng nên từ 5 chuẩn ở Hình 3.6 với trục tung: chu kỳ ngưỡng - Ct (threshold cycle) và trục hoành: giá trị logarit của số lượng bản sao ban đầu (Log Starting Quantity) có đơn vị là số bản sao (copy number). Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu (X) và chu kỳ ngưỡng (Y). Thông qua chu kỳ ngưỡng được thể hiện qua Hình 3.5, giá trị log số bản sao ban đầu được xác định theo phương trình Y = a.X + b. Đồ thị này còn thể hiện các mẫu dương tính qua các unknown (mẫu cần kiểm tra) - các hiển thị tương ứng với chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu trên đường chuẩn. Theo Too H. P. (2001), số bản sao trình tự đích ban đầu càng nhiều tương ứng với số chu kỳ ngưỡng càng thấp. Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn 38 Các thông số cần phân tích thể hiện trên đường chuẩn bao gồm: hệ số tương quan (r 2) (correlation coefficient), hiệu quả phản ứng (PCR efficiency) và độ nghiêng (slope).  Hệ số tương quan (correlation coefficient) Hệ số tương quan càng cao tương ứng với các thông số thí nghiệm càng chính xác và phù hợp với giá trị mong đợi. Hệ số tương quan có giá trị giữa 0 và 1. Nếu không có sự tương quan giữa giá trị dự đoán (predicted values) và giá trị thực sự, hệ số tương quan là 0 hay rất thấp. Sự tương quan giữa giá trị dự đoán và giá trị thực sự cao thì hệ số tương quan tiến gần đến 1. Sự phù hợp hoàn hảo tương ứng với hệ số tương quan bằng 1 (Bio – Rad, 2004).  Hiệu quả phản ứng và độ nghiêng Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan chặt chẽ với hiệu quả phản ứng. Hiệu quả phản ứng sẽ cho biết các thông tin có giá trị về hóa chất phản ứng. Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan với hiệu quả phản ứng qua phương trình sau: Hiệu quả (efficiency) = [10(-1/slope)] – 1 (slope: độ nghiêng) (3.1) Độ nghiêng – 3,322 cho hiệu quả 100%. Khi đó số lượng mạch khuôn mẫu (template) tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ khi sự khuếch đại tăng theo cấp số (exponential amplification). Độ nghiêng thấp hơn – 3,322 cho thấy hiệu quả phản ứng thấp hơn 100%. Hầu hết các phản ứng đều không đạt tới 100% do các giới hạn thí nghiệm. Độ nghiêng cao hơn – 3,322 cho hiệu quả phản ứng Real - time PCR cao hơn 100%. Điều này do các giá trị được đo ở giai đoạn không có sự tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ hay do sự hiện diện của các chất ức chế trong phản ứng (Qiagen, 2004). Bảng kết quả chạy mẫu Bảng kết quả xuất ra từ máy có dạng như sau: 39 Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR sẽ được phân tích chủ yếu dựa trên: số bản sao ban đầu (SQ), giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct). Nếu có sự lặp lại các mẫu, kết quả còn được phân tích qua số bản sao trung bình (SQ Mean), giá trị chu kỳ ngưỡng trung bình (Ct Mean), độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu (SQ SD), độ lệch chuẩn của chu kỳ ngưỡng (Ct SD). Các cột còn lại ở Bảng 3.1 nhằm thể hiện vị trí đặt mẫu, loại mẫu,…giúp người phân tích biết rõ thông tin về mẫu cần kiểm tra. 3.4.5.2. Non Stop Nested PCR Kết quả sau khi thực hiện Non Stop Nested PCR được phân tích dựa trên kích thước đoạn khuếch đại đặc hiệu và thang ADN chuẩn qua quan sát các băng ADN dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad. Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của WSSV khi chạy Non Stop Nested PCR là đoạn có kích thước 633 bp và 221 bp. Dựa vào thang ADN chuẩn, xác định sự hiện diện băng điện di của đoạn 633 và 221 bp ở đối chứng dương. Sau đó so sánh băng điện di của mẫu với hai băng đặc hiệu trên để xác định mẫu dương tính hay âm tính với WSSV. Well Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A01 A03 A05 A07 A09 Bảng 3.1 Bảng kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR Well: vị trí giếng Type: loại mẫu Identifier: định tên mẫu Rep: vị trí mẫu trên 96 giếng Ct: chu kỳ ngưỡng SQ: starting quantity: số bản sao ban dầu SD: standard deviation: độ lệch chuẩn Mean: trung bình 40 3.5. Bố trí thí nghiệm 3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix Để ly trích ADN, có hai quy trình đã được thử nghiệm: - Quy trình 1: ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, và sốc nhiệt. - Quy trình 2: ly trích ADN sử dụng Instagene Matrix sau khi đã ly trích bằng SDS, NaOH, và sốc nhiệt. Mục đích Khảo sát hai quy trình ly trích nhằm tìm ra quy trình ly trích tối ưu. Tiến hành Sử dụng mẫu tôm nhiễm WSSV với mức độ nặng (đã qua xét nghiệm) được lưu trữ tại công ty Nam Khoa để tiến hành tách chiết ADN theo hai quy trình ly trích (chi tiết ở mục 3.4.2). Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10. Dùng micropipette hút 5 µl dịch tách chiết ADN cho vào 45 µl dung dịch TE 1X (Tris EDTA), tiến hành trộn mẫu trên máy vortex, sau đó hút 5 µl mẫu từ ống eppendorf vừa vortex ở trên chuyển sang ống eppendorf thứ hai có chứa sẵn 45 µl TE 1X, trộn đều. Quá trình cứ lặp lại, cuối cùng ta thu được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-6 (Hình 3.8). Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR cho tất cả các nồng độ từ 10-1 đến 10-6 của cả hai quy trình ly trích. 633bp 221bp Hình 3.7 Kết quả điện di qua Non Stop Nested PCR MK: thang ADN chuẩn 41 Dựa vào kết quả so sánh chu kỳ ngưỡng của mẫu ở từng nồng độ pha loãng theo hai quy trình ly trích để xác định mẫu ly trích theo quy trình nào sẽ có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn (mẫu có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn sẽ có chu kỳ ngưỡng thấp hơn). 3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phƣơng pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính, âm tính với WSSV Mục đích Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng WSSV bằng phương pháp Real - time PCR. Tiến hành 15 mẫu tôm (8 mẫu dương tính và 7 mẫu âm tính với WSSV) đã qua kiểm tra PCR và Semi – Nested PCR được tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được thử nghiệm lặp lại hai lần qua Real - time PCR và đồng thời một lần qua Non Stop Nested PCR. Các mẫu tôm sau khi ly trích này được chạy kèm với 5 chuẩn. Sau khi ly trích xong, dùng micropipette hút 2 µl dịch tách chiết chứa ADN của WSSV cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Đối với chuẩn, hút 2 µl mỗi chuẩn cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR (chi tiết ở mục 3.4.3 và 3.4.4). Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted được xác định là dương tính với WSSV. Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted được xác định là âm tính với 5 µl mẫu 45 µl TE 10 0 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -1 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl Hình 3.7 : Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 Hình 3.8 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 10 0 10 -1 10 -4 10 -3 10 -2 10 -5 10 -6 42 WSSV. Kết quả chạy Real - time PCR được đối chiếu với kết quả chạy Non Stop Nested PCR và so sánh với kết quả đã xét nghiệm trước đó bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Số bản sao ban đầu của WSSV được định lượng dựa trên đường chuẩn và cho kết quả ở bảng số liệu xuất kết quả sau khi chạy mẫu. 3.5.3. Thí nghiệm 3: khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR Mục đích Khảo sát tính tuyến tính và độ lặp lại về khả năng định lượng của phương pháp Real - time PCR. Tiến hành Chọn ngẫu nhiên hai mẫu nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức độ nặng từ thí nghiệm 2, tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, pha loãng dịch tách chiết ADN của hai mẫu này theo hệ số pha loãng bậc 10 (giống như tiến hành pha loãng mẫu ở thí nghiệm 1) được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-3. Thực hiện phản ứng Real - time PCR ở các nồng độ pha loãng của cả hai mẫu: ở nồng độ bắt đầu pha loãng (100) và ở mỗi nồng độ pha loãng (10-1, 10-2, 10-3) tiến hành lặp lại 3 lần. Khi thực hiện Real - time PCR, 5 chuẩn được chạy kèm để định lượng số bản sao của WSSV theo từng nồng độ pha loãng. Ở từng nồng độ pha loãng, 2 µl mẫu đã vortex được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Dựa vào các đường biễu diễn nồng độ huỳnh quang ở từng nồng độ trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, độ sai khác của các giá trị chu kỳ ngưỡng ở các nồng độ, độ lệch chu kỳ ngưỡng trung bình và độ lệch giữa các số bản sao trung bình ở các nồng độ pha loãng qua 3 lần lặp lại để xác định tính tuyến tính về khả năng định lượng của Real - time PCR. Căn cứ vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang ở 3 lần lặp lại của từng nồng độ mẫu pha loãng, log số lượng bản sao ban đầu của mẫu ở từng nồng độ pha loãng trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn, độ sai khác chu kỳ ngưỡng của 3 lần lặp lại ở cùng nồng độ pha loãng, độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu qua 3 lần lặp lại để xác định độ lặp lại về khả năng định lượng của Real - time PCR. 43 3.5.4. Thí nghiệm 4: khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR Mục đích So sánh độ nhạy giữa hai phương pháp để khẳng định tính vượt trội về độ nhạy của phương pháp Real - time PCR nhằm sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên các mẫu thu từ thực tế. Tiến hành Sử dụng mẫu tôm nhiễm WSSV nặng lưu trữ tại công ty Nam Khoa và tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được tiến hành pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10, được một dãy các nồng độ ADN bản mẫu theo chiều giảm dần từ 100 đến 10-8. Sau đó thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR ở các nồng độ 10-1 đến 10-8. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần với cả hai phương pháp trên cùng một mẫu ở tất cả các nồng độ pha loãng. 2 µl dịch tách chiết ADN WSSV ở từng nồng độ pha loãng được cho vào đồng thời từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Sản phẩm khuếch đại của hai phương pháp được phân tích trên phần mềm iQ version 3.1 và trên gel agarose 2%. Dựa vào đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ xem khả năng phát hiện WSSV của phương pháp Real - time PCR đến nồng độ pha loãng nào. Căn cứ vào hình điện di sản phẩm qua Non Stop Nested PCR để xác định khả năng phát hiện WSSV của Non Stop Nested PCR đến nồng độ pha loãng nào. Qua đó so sánh khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ mẫu pha loãng nào của hai phương pháp để xác định độ nhạy giữa Real - time PCR và Non Stop Nested PCR. Phương pháp nào có độ nhạy cao hơn sẽ có khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ pha loãng thấp hơn. 3.5.5. Thí nghiệm 5: ứng dụng phƣơng pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế Mục đích Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra sơ khởi tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm sú giống, và kiểm tra mức độ nhiễm WSSV trên tôm nuôi thương phẩm và tôm bố mẹ. 44 Tiến hành 30 mẫu tôm thu thực tế từ vùng nuôi tôm ở Bến Tre và Bạc Liêu được tách chiết ADN qua quy trình ly trích xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được chạy kèm với 5 chuẩn để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng. Thí nghiệm này được lặp lại 2 lần qua Real - time PCR. Sau khi ly trích xong, 2 µl mẫu được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Đối với chuẩn, 2 µl mỗi chuẩn được cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR. Dựa vào đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của các mẫu trên đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ và các hiển thị của mẫu trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn để xác định là mẫu dương tính hay âm tính với WSSV và số lượng bản sao ban đầu của WSSV. 3.5.6. Thí nghiệm 6: theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi tôm đã đƣợc thu mẫu kiểm tra Mục đích Theo dõi tình trạng thu hoạch của các ao nuôi có thu mẫu tôm kiểm tra để có những khuyến cáo phù hợp cho người nuôi tôm. Tiến hành Ghi nhận lại kết quả thu hoạch của các ao tôm thả nuôi tôm giống hoặc đang nuôi tôm thương phẩm, sản xuất giống bằng tôm bố mẹ được xét nghiệm bằng phương pháp Real - time PCR cho kết quả âm tính và dương tính với WSSV. Qua đó đánh giá khả năng thành công của các ao thả nuôi tôm bị nhiễm WSSV. 45 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix Đối với quy trình ly trích 2, tín hiệu huỳnh quang thu được ở chu kỳ ngưỡng lần lượt là: 16,9; 20,6; 23,7; 27,1; 30,6; 34,8 tương ứng với nồng độ mẫu pha loãng từ 10-1 đến 10-6. Quy trình ly trích 1 cho kết quả tín hiệu huỳnh quang thu được ở chu kỳ ngưỡng: 20,6; 23,8; 27,5; 31,6; 34,9; 37,8 tương ứng với nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-6. Kết quả cho thấy, số chu kỳ ngưỡng tăng dần theo chiều giảm dần của nồng độ pha loãng. Ở nồng độ 10-1 đến 10-6 của mẫu qua quy trình ly trích 2 có chu kỳ ngưỡng thấp hơn so với chu kỳ ngưỡng của mẫu qua quy trình ly trích 1 ở các nồng độ Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu ly trích theo quy trình 1 và 2 : mẫu ly trích theo quy trình 1 : mẫu ly trích theo quy trình 2 : đối chứng âm , : 10-1 , : 10-2 , : 10-3 , : 10-4 , : 10-5 , : 10-6 46 từ 10-1 đến 10-6. Điều này cho thấy chu kỳ ngưỡng của mẫu ly trích qua quy trình 2 lên sớm hơn rất nhiều so với chu kỳ ngưỡng của mẫu ly trích qua quy trình 1. Với kết quả thu được cho thấy dịch tách chiết qua quy trình ly trích 2 có ADN của WSSV tinh sạch và nhiều hơn dịch tách chiết qua quy trình ly trích 1. Từ kết quả thu nhận được qua hai quy trình ly trích trên, tôi chọn quy trình ly trích 2 cho các bố trí thí nghiệm sau. 4.2. Kết quả sử dụng phƣơng pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính, âm tính với WSSV Kết quả thử nghiệm Real - time PCR trên 12 mẫu dương tính và âm tính thể hiện qua các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trên đồ thị ở Hình 4.2. Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu tôm sú : 8 : 9 : 10 : 11 : 12 : đối chứng âm ▲: các chuẩn : 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 47 Hình 4.2 thể hiện rõ các đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu đều vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền), điều này cho thấy các mẫu tôm đều bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Các mẫu: 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm WSSV nặng thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên rất sớm từ chu kỳ 17 đến 21. Các mẫu còn lại nhiễm WSSV nhẹ đến trung bình thể hiện qua chu kỳ ngưỡng lên khá muộn từ chu kỳ 33 đến 39. Kết quả thử nghiệm Real – time PCR lần thứ 2 cho kết quả tương tự, cả 12 mẫu đều cho kết quả dương tính với WSSV. Kết quả này hoàn toàn tương thích với kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR. Kết quả kiểm tra được tóm tắt qua Bảng 4.1 như sau: Hình 4.3 Kết quả kiểm tra WSSV qua Non Stop Nested PCR của 12 mẫu tôm sú 633bp 221bp 48 Bảng 4.1 cho thấy kết quả kiểm tra mầm bệnh đốm trắng ở các mẫu 9, 10, 11, 12 bằng phương pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR có sự khác biệt với kết quả kiểm tra bằng các phương pháp PCR và Semi – Nested PCR. Hai mẫu 9, 10 đã qua kiểm tra PCR và hai mẫu 11, 12 đã qua kiểm tra Semi – Nested PCR đều cho kết quả âm tính nhưng lại cho kết quả dương tính khi tôi tiến hành kiểm tra bằng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR với mức độ nhiễm rất nhẹ (chỉ xuất hiện một băng 221 bp ở Non Stop Nested PCR và chỉ vài bản sao ở Real - time PCR). Sai lệch này có thể do độ nhạy của Real - time PCR và Non Stop Nested PCR cao hơn PCR thông thường và Semi – Nested PCR. Vì vậy tôi tiến hành kiểm tra tiếp 3 mẫu âm tính đã được xác định bằng PCR, kết quả thu được qua Hình 4.4. Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra WSSV trên 12 mẫu tôm sú Mẫu Kết quả đã qua kiểm tra PCR và Semi-Nested PCR Non Stop Nested PCR Real - time PCR 1 + (PCR) + + 2 + (PCR) + + 3 + (PCR) + + 4 + (PCR) + + 5 + (Semi-Nested PCR) + + 6 + (Semi-Nested PCR) + + 7 + (Semi-Nested PCR) + + 8 + (Semi-Nested PCR) + + 9 - (PCR) + + 10 - (PCR) + + 11 - (Semi-Nested PCR) + + 12 - (Semi-Nested PCR) + + 49 Hình 4.4 cho thấy đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của mẫu 13 nằm dưới đường baseline subtracted cho kết quả âm tính. Hai mẫu 14 và 15 có tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted ở chu kỳ ngưỡng rất muộn: 41,73 và 40,64, chứng tỏ các mẫu này nhiễm WSSV ở mức độ rất nhẹ. Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú qua Non Stop Nested PCR như sau: Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 3 mẫu tôm sú ▲: các chuẩn : đối chứng âm : mẫu 13 : mẫu 14 : mẫu 15 Hình 4.5 Kết quả Non Stop Nested PCR của 3 mẫu tôm sú MK (+) (-) 13 15 14 633 bp 221 bp 50 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú được tóm tắt ở Bảng 4.2 như sau: Mẫu 13 được kiểm tra qua Real - time PCR cho kết quả tương thích với kết quả kiểm tra của phương pháp PCR và Non Stop Nested PCR. Hai mẫu 14 và 15 còn lại kiểm tra qua Real - time PCR cho kết quả khác biệt so với kết quả kiểm tra của phương pháp PCR và ngay cả Non Stop Nested PCR. Như vậy, trong 7 mẫu đã xác định âm tính qua PCR và Semi – Nested PCR, phương pháp Real – time PCR cho kết quả 6 mẫu dương tính và 1 mẫu âm tính; kết quả kiểm tra qua Non Stop Nested PCR cho thấy có 4 trong 7 mẫu trên là dương tính và 3 mẫu âm tính. Điều này chứng tỏ phương pháp Non Stop Nested PCR mà tôi sử dụng có khả năng phát hiện những mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ mà không thể phát hiện bằng phương pháp PCR và Semi – Nested PCR mà các phòng xét nghiệm khác đang sử dụng, đồng thời phương pháp Real – time PCR có khả năng phát hiện các mẫu nhiễm WSSV mà các phương pháp khác không có khả năng phát hiện. Như vậy, phương pháp Real – time PCR có thể sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên tôm sú nuôi và thậm chí cho kết quả phát hiện mầm bệnh còn tốt hơn so với các phương pháp khác. Để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng trên 12 mẫu tôm, tôi tiến hành định lượng dựa trên 5 chuẩn, kết quả thu được qua Hình 4.6. Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 12 mẫu tôm sú Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú Mẫu Kết quả đã xét nghiệm bằng PCR Non Stop Nested PCR Real - time PCR 13 - - - 14 - - + 15 - - + 51 Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao 97,95%, cho thấy phản ứng Real - time PCR này hoạt động tốt. Hệ số tương quan thu được rất cao (r2 = 1) chứng tỏ mối tương quan tuyến tính giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ ngưỡng rất chặt. Số bản sao trung bình của WSSV trên 12 mẫu sau 2 lần lặp lại được tóm tắt ở Bảng 4.3. Bảng 4.3 cho thấy mẫu 1, 5, 6, 7, 8 nhiễm virus gây bệnh đốm trắng khá cao tương ứng với số bản sao ban đầu: 2,98.106; 2,57.105; 4,25.105; 6,95.105; 6,97.105 bản sao. Các mẫu 2, 3 nhiễm WSSV nhẹ tương ứng với số bản sao ban đầu: 2,47.101; 4,77.101 bản sao. Các mẫu 4, 9, 10, 11, 12 nhiễm virus gây bệnh đốm trắng rất nhẹ thể hiện qua số bản sao ban đầu thấp: 2; 5; 2; 6; 4 bản sao. Điều này cho thấy phương pháp Real – time PCR có thể phát hiện các mẫu nhiễm WSSV với số lượng bản sao ban đầu rất thấp (2 bản sao) cho nên có thể phát hiện được các mẫu nhiễm WSSV rất nhẹ mà phương pháp PCR và Semi – Nested PCR cho kết quả là âm tính. Kết quả kiểm tra bằng Non Stop Nested PCR cũng cho kết quả là cả 12 mẫu đều dương tính với WSSV với số bản sao ban đầu rất thấp (theo kết quả định lượng của Real – time PCR) chứng tỏ rằng phương pháp Non Stop Nested PCR mà tôi sử dụng Mẫu Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình 1 16,67 2,98.10 6 2 33,82 2,47.10 1 3 32,84 4,77.10 1 4 37,69 1,74 5 20,28 2,57.10 5 6 19,53 4,25.10 5 7 18,83 6,95.10 5 8 18,81 6,97.10 5 9 36,68 4,64 10 38,20 1,23 11 35,99 5,69 12 37,79 3,45 Bảng 4.3 Số bản sao ban đầu trung bình của 12 mẫu tôm sú sau hai lần lặp lại 52 có độ nhạy rất cao (2 bản sao), có thể dùng để kiểm tra virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú. Số bản sao ban đầu của 3 mẫu tôm được định lượng qua Real – time PCR dựa trên đồ thị biểu diễn đường chuẩn (Hình 4.7). Hiệu quả của phản ứng Real - time PCR trung bình qua 2 lần lặp lại đạt khá cao 99,4%, chứng tỏ phản ứng Real - time PCR hoạt động tốt. Hệ số tương quan (r2 = 1) giữa log số bản sao ban đầu và số chu kỳ rất chặt. Kết quả sau 2 lần lặp lại được tóm tắt ở Bảng 4.4 Hai mẫu 14 và 15 nhiễm WSSV rất nhẹ, chỉ được phát hiện qua Real – time PCR với 1 bản sao ban đầu, trong khi đó PCR và ngay cả Non Stop Nested PCR cũng không thể phát hiện được. Mẫu 13 cho kết quả âm tính với tất cả các phương pháp xét nghiệm cho thấy là mẫu không bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Từ các kết quả thử nghiệm trên cho thấy phương pháp Real - time PCR có khả năng phát hiện được mầm bệnh WSSV mà các phương pháp khác có thể phát hiện. Ngoài ra Real - time PCR còn có khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV ngay cả ở mức độ nhiễm rất nhẹ (1 bản sao) mà các phương pháp khác không có khả năng phát hiện. Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn của 3 mẫu tôm sú Mẫu Chu kỳ ngưỡng trung bình Số bản sao ban đầu trung bình 13 N/A N/A 14 41,73 1,54.10 -1 15 40,64 3,27.10 -1 Bảng 4.4 Số bản sao ban đầu trung bình của 3 mẫu tôm sú sau hai lần lặp lại 53 4.3. Kết quả khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time PCR Kết quả thử nghiệm tính định lượng của phương pháp Real - time PCR ở các nồng độ pha loãng của mẫu 1 sau các lần lặp lại thể hiện qua Hình 4.8. Hình 4.8 thể hiện rõ các đường cong tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số