Khóa luận Phát hiện Virus bệnh dịch tả heo dựa trên đoạn gen NS5B

au nhưng có một vài thay đổi tồn tại giữa những dòng phân lập. Những phản ứng chéo huyết thanh với virus BVD và BD có thể xảy ra và gây trở ngại trong chẩn đoán huyết thanh. 7 Bộ gen virus có chuỗi đơn RNA dài 12,3 kb. Bộ gen đã được biết trình tự gen hoàn toàn, chứa một khung đọc mở nằm ở bên sườn của 5’-UTR và 3’-UTR mã hoá một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid. Polyprotein này được cắt bởi protease được mã hoá bởi virus và tế bào vật chủ để tạo nên protein trưởng thành của virus gồm 4 protein cấu trúc (C, Erns, E1 và E2), p7 và 7 protein không cấu trúc (N pro, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B). Trình tự của sản phẩm gen dọc theo khung đọc mở là: Hình 2. 1: Cấu trúc bộ gen Pestivirus (Brett D. L., 2007) Một polyprotein lớn được dịch mã từ RNA của virus sẽ được xử lý thành những protein virus riêng biệt. Protein đầu tiên mã hoá là Npro một protein không cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí Npro/C. Peptidase ký chủ phân cắt những vị trí C/E rns , E1/E2, E2/p7 và p7/NS2 với sự phân cắt không hoàn toàn ở vị trí E2/p7. NS2-3 được phân cắt bởi autoprotease NS2. Sự phân cắt của polyprotein hình thành NS4A, NS4B, NS5A và NS5B được thuỷ phân bởi enzyme protease serine NS3-4A.  Npro là autoprotease không cấu trúc có hoạt tính thuỷ phân protein. Npro không cần thiết đối với sự sao chép virus. Npro cũng hoạt động như một chất đối NH2-(N pro -C-E rns -E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH 8 kháng của sự hoạt hoá IRF-3 và sự sản xuất ra IFN, ức chế sự phiên mã IRF-3 ở những tế bào nhiễm virus DTH. Những đột biến bỏ đi Npro của virus DTH đã được đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống.  Protein cấu trúc C (mã hoá protein p14): là protein của nucleocapsid. Đầu cuối C (C- terminus) của protein C ở virus DTH đã được xác định và được định vị ở phần kỵ nước của chuỗi peptide tín hiệu bên trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di chuyển của Erns vào trong khoang mạng lưới nội chất. E rns (mã hoá protein gp44/48), E1(gp33), E2(gp55): là các protein vỏ. E2 và E rns có tính kháng nguyên mạnh nhất. Erns có tác dụng hỗ trợ thải virus qua một màng đặc biệt, được tiết ra từ tế bào nhiễm, đặc điểm nổi bật của Erns là hoạt tính ribonuclease với tính chuyên biệt đối với gốc uridine. Những kháng thể ức chế hoạt tính ribonuclease có khuynh hướng trung hoà tính nhiễm virus, sự đột biến ở Erns phá huỷ hoạt tính ribonuclease gây nên gia tăng số lượng virus. Erns tái tổ hợp là một độc chất đối với tế bào bạch huyết trong ống nghiệm, có thể kết hợp với sự giảm bạch cầu ở nhiễm tự nhiên. Mặc dù độc tính tế bào là một đặc điểm nổi bật của những enzyme ribonuclease hoà tan khác nhưng người ta chưa rõ là hoạt tính ribonuclease của Erns có liên quan đến độc tính của nó hay không. Vùng đầu cuối C (C-terminal) của Erns có thể khởi động sự di chuyển của nó qua màng tế bào, có thể coi như là mục tiêu hoặc chức năng trong tế bào. Tuy nhiên, Erns tái tổ hợp cũng có thể nối một cách vững chắc với bề mặt tế bào qua sự tương tác với glycosaminoglycan và ức chế sự lây nhiễm. E1 và E2 là những protein màng không thể thiếu. E2 của virus DTH tái tổ hợp có thể kết hợp với các tế bào và ngăn chặn sự lây nhiễm của virus DTH và BVD. Mặc dù vai trò quan trọng của những glycoprotein ở virus là lắp rắp và tiếp nhận nhưng những kháng thể đối với Erns hoặc E2 có thể trung hoà tính lây nhiễm của virus và cả hai kháng nguyên này có thể tạo ra tính sinh miễn dịch bảo vệ. 9  Protein p7 theo sau những protein cấu trúc, gồm một vùng đảm đương nhiệm vụ trung tâm đối với việc tách đầu cuối kỵ nước và cần cho sự sản sinh của virus lây nhiễm nhưng không đòi hỏi trong quá trình sao chép RNA. P7 của pestivirus được phân cắt một cách không hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt. E2- p7 không phân cắt không cần thiết đối với sự sao chép trong nuôi cấy tế bào và cả hai E2-p7 và p7 giúp tế bào kết hợp với nhau. Tuy nhiên, chưa biết rõ p7 là một protein cấu trúc hay không cấu trúc mặc dù nó không được phát hiện trong virus tinh sạch. Pestivirus có p7 thì có thể hình thành những kênh ion tham gia trong sự lắp ráp và tiếp nhận của virus.  Protein không cấu trúc Protein NS2 là một enzyme thuỷ phân protein chứa cysteine đã được nhận diện. Sự phân cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao chép RNA của pestivirus và hiệu quả phân cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bào và có thể xác định tính gây bệnh tế bào. Vùng NS2-3 tham gia lắp ráp virus. NS3 chứa một vùng protease serine ở đầu cuối N và một helicase RNA ở đầu cuối C. Protease serine NS3 đòi hỏi NS4A như là một yếu tố hỗ trợ. Protease serine NS3-4A phân cắt giữa leucine và những amino acid không phân cực nhỏ. Hoạt tính protease serine ảnh hưởng đến sự sao chép RNA virus,đóng vai trò thiết yếu trong khả năng tồn tại của virus. NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tính protease serine NS3. NS4A và NS4B không đóng vai trò thiết yếu trong sự sao chép RNA của virus. NS5A và NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phân cắt hoàn toàn cũng không khác gì NS5A-5B không phân cắt. Chức năng của NS5A chưa được biết rõ. NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA dependent RNA polymerase). 10 2.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH DTH TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM (1) Phân lập virus (2) Đánh dấu miễn dịch phát hiện virus trong nuôi cấy tế bào (3) Phương pháp hoá mô (4) ELISA phát hiện kháng nguyên hoặc ELISA phát hiện kháng thể (5) Phản ứng trung hoà (6) Phương pháp reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) RT-PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh và nhạy hơn so với phương pháp ELISA và phân lập virus, thích hợp trong chuẩn đoán bệnh sớm, tránh được sự nhiễm khuẩn từ môi trường bên ngoài 2.4.1. PCR (Polymerase chain reaction) Khái niệm: PCR là một tiến trình lặp đi lặp lại bao gồm 3 công đoạn: biến tính mẫu bởi nhiệt, bắt cặp những mồi nucleotide với trình tự đích mạch đơn, kéo dài mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Biến tính: mẫu DNA mạch đôi biến tính ở nhiệt độ được xác định bởi thành phần G+C. Thành phần G+C càng cao thì nhiệt độ đòi hỏi tách mạch càng cao. Những phân tử DNA càng dài thì thời gian cần ở nhiệt biến tính để tách hai mạch một cách hoàn toàn càng lớn. Nếu nhiệt độ biến tính quá thấp hoặc nếu thời gian quá ngắn thì chỉ có những vùng giàu AT sẽ bị biến tính. Khi nhiệt độ bị giảm trễ hơn trong chu trình PCR, DNA mẫu sẽ tái bắt cặp thành một tình trạng nguyên gốc. Trong những phản ứng PCR xúc tác bởi Taq DNA polymerase, sự biến tính được tiến hành ở 94 - 950C, là nhiệt độ cao nhất mà enzyme có thể chịu được khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn mà không chịu được tác hại quá mức. Trong chu kỳ đầu của PCR, sự biến tính thỉnh thoảng được tiến hành khoảng 5 phút để gia tăng khả năng những phân tử DNA mẫu được biến tính đầy đủ. Tuy nhiên, thời gian biến tính khoảng 45 giây ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thông thường có thành phần G+C là 55% hoặc thấp hơn. 11 Mẫu DNA giàu G+C (> 55%) thì nhiệt độ biến tính càng cao. DNA polymerase phân lập từ Archaea thì chịu nhiệt hơn Taq do đó nó thích hợp khuếch đại DNA giàu G+C. Bắt cặp mồi với DNA mẫu: nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, mồi oligonucleotide bắt cặp ít với mẫu, như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp việc bắt cặp của mồi không đặc hiệu có thể xảy ra, kết quả là tạo ra những đoạn DNA không mong muốn. Sự bắt cặp được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy 3 - 50C. Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp, nên tiến hành một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide. Kéo dài mồi: việc kéo dài mồi được tiến hành ở hoặc gần nhiệt độ thích hợp đối với sự tổng hợp DNA xúc tác bởi polymerase chịu nhiệt, trong trường hợp Taq polymerase nhiệt độ thích hợp là 72 - 780C. Số chu kì: phụ thuộc vào lượng DNA đưa vào phản ứng, hiệu quả của việc kéo dài mồi và sự khuếch đại. Thông thường sau 30 chu kì tạo được khoảng 105 bản sao. 2.4.2. RT-PCR Khái niệm: là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại RNA thành cDNA. Nhạy và đa năng, RT-PCR được sử dụng để hồi phục và nhân đầu cuối 5’và 3’ của mRNA và hình thành thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA. Thêm vào đó, RT-PCR dễ dàng xác định đột biến và những đa hình trong những trình tự được sao lại và đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế. Bước đầu tiên là chuyển RNA thành cDNA. Một mồi oligodeoxynucleotide được lai với RNA và sau đó kéo dài bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNA- dependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA. Kết thúc tiến trình tạo cDNA là chuyển qua tiến trình PCR để nhân lên một lượng lớn cDNA. 12 Hình 2. 2: Phản ứng RT-PCR . Khuôn RNA Sự gắn primer vào RNA để tổng hợp cDNA (primer có thể là ngẫu nhiên, oligo-dT hay mồi chuyên biệt cho gene). cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer nhờ enzyme reverse trascriptase. Sợi cDNA được tạo thành. Khuôn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H. cDNA được sử dụng để thực hiện PCR. Sự gắn của primer với cDNA. Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ Taq polymerase. cDNA sợi đôi được hình thành. Ba bước biến tính, bắt cặp, kéo dài được lặp lại nhiều lần. 13 2.4.3. Các thành phần quan trọng trong phản ứng  Dung dịch đệm (buffer) Có tác dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Thành phần dung dịch đệm gồm KCl, MgCl2, Tris-HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng).  MgCl2 Tạo thành một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vào enzyme, kích thích hoạt tính của enzyme polymerase, tăng Tm (nhiệt độ nóng chảy) của DNA và tăng sự tác động hổ trợ của mồi và DNA mẫu. Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 0,5 – 5 mM với mức tối ưu là 1 – 2 mM, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998).  Mồi (primer) Mồi là một trong những thành phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng. Trình tự mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi và đặc trưng cho trình tự đoạn gen được khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên đoạn gen. Chiều dài mồi không được quá lớn thường trong khoảng 17- 25 nu, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự Nhân, 2001). Chiều dài mồi càng lớn sự tách các DNA mẫu để bắt cặp với mồi càng nhỏ. Chiều dài và thành phần G-C của mồi đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ Tm của mồi. Tm ( 0C) = [(số G + C) * 4 + (số A + T) * 2] Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng. Nồng độ mồi quá cao hình thành nên cấu trúc dimer (mồi gắn mồi).  Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP. Sự mất cân bằng trong thành phần dNTPs làm tăng các lỗi sao chép của 14 enzyme polymerase vì vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả các dNTP đều bằng nhau. Nồng độ dNTPs thường dùng trong khoảng 20 – 200 µM, dung dịch dNTPs gốc phải giữ trung tính pH7,0.  Taq polymerase Là một enzyme polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus. Taq polymerase không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính trong phản ứng, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C. Nồng độ Taq sử dụng được khuyến cáo trong khoảng 1 - 2,5 đơn vị trên 100µl dung dịch phản ứng. Nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt, nồng độ Taq quá thấp không đủ lượng enzyme xúc tác để tạo ra sản phẩm theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999).  Số chu kỳ trong phản ứng Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vào lượng bản sao mẫu ban đầu. DNA mẫu là 105 tương ứng với 25 - 30 chu kỳ, 102 - 103 tương ứng với 35 - 40 chu kỳ. Không nên vượt quá 40 chu kỳ vì hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do: Sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng. Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng. Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Phan Cự Nhân, 2001).  Mẫu Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg – 1 µg trên 25 µl dung dịch phản ứng. Nồng độ mẫu quá ít dẫn đến phản ứng không đặc hiệu, nồng độ quá cao tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn.  RNAsin Được dùng để ức chế enzyme phân huỷ RNA, giữ cho mẫu không bị mất trong quá trình thực hiện phản ứng. 15  Enzyme reverse transcriptase Trong phản ứng RT-PCR thành phần không thể thiếu là enzyme phiên mã ngược, MMLV hoạt động như là một enzyme polymerase giúp tổng hợp sợi cDNA từ RNA và với hoạt tính của enzyme RNAse H có độ nhạy cao giúp phân cắt sợi RNA trong mạch đôi RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng PCR. 2.5. SƠ LƢỢC CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 2.5.1. Trong nƣớc Từ năm 1996-1998, Nguyễn Thị Phương Duyên và ctv khảo sát hội chứng sốt, táo bón, bỏ ăn đến chết và kháng nguyên virus DTH bằng miễn dịch huỳnh quang và ELISA ở đàn heo sinh sản và heo con tỉnh Khánh Hoà và Quảng Ngãi cho thấy virus DTH chiếm tỷ lệ không nhỏ trong các tác nhân gây hội chứng này. Từ năm 2002-2003, Akemi Kamakawa và ctv tiến hành khảo sát bệnh DTH giữa các đàn heo và các trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen 5’NTR. Nguyễn Thế Vinh và ctv, năm 2004 nghiên cứu phân tích di truyền virus DTH phân lập ở Việt Nam bằng cách phân tích đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH và so sánh chúng với một số chủng đã được giới thiệu trên thế giới. Kết quả đưa ra là các chủng virus DTH thuộc nhóm 2 đang là tác nhân chính gây bệnh DTH ở Việt Nam. Hồ Thu Hương và ctv, năm 2004 so sánh 4 phương pháp chẩn đoán virus DTH (phân lập virus, phản ứng huỳnh quang kháng thể, phản ứng ELISA và RT- PCR) từ mẫu được bảo quản ở các điều kiện khác nhau. Theo các tác giả, việc lựa chọn phương pháp chẩn đoán phải dựa vào chất lượng mẫu. Bùi Nghĩa Vượng và ctv, năm 2004 chẩn đoán bệnh DTH bằng phương pháp RT-PCR với mẫu máu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng có thể phát hiện được virus DTH từ các mẫu giấy thấm máu khô giữ ở 370C trong 10 tháng. 16 2.5.2. Trên thế giới Với sự thiệt hại kinh tế nghiêm trọng mà bệnh DTH gây ra ở các quốc gia có dịch bệnh thì DTH là một đối tượng ngày càng có nhiều nghiên cứu về dịch tễ lâm sàng, các phương pháp chẩn đoán, sự lây nhiễm và phân bố của các chủng virus DTH và đồng thời nghiên cứu vaccin trong phòng trị bệnh. Barbara và ctv, năm 1993 sử dụng kỹ thuật RT-PCR vào việc phát hiện và biệt hoá virus DTH từ các pestivirus khác. Nghiên cứu dấu hiệu lâm sàng và dịch tễ của bệnh DTH của các tác giả như Artois và ctv (2002), Moennig và ctv (2003). Nhiều tác giả nước ngoài dùng kỹ thuật RT-PCR để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh dựa trên đoạn gen E2 của bộ gen virus (Wirs B., 1993; Harding, 1994; Rugg li,1996; Knepp, 2003; Risatt I, 2002, 2004; Pereda, 2005). Paton và ctv (2000) phân tích các chủng virus DTH dựa vào đoạn gen E2, NS5B và 3’NTR ở nhiều nơi trên thế giới, kể cả vài nước châu Á kết quả cho thấy mối quan hệ gần giữa các chủng gây bệnh ở một số nước. 17 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian Đề tài được tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2007 đến ngày 01 tháng 08 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm Mẫu bệnh phẩm là lách của heo bệnh và các dữ liệu liên quan đến bệnh được gởi từ tỉnh Tiền Giang. Tiến hành thử nghiệm quy trình phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá sinh trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Chọn quy trình ly trích RNA thích hợp từ mẫu lách  Chọn quy trình RT-PCR có hiệu quả nhất trong việc phát hiện gen NS5B  So sánh kết quả RT-PCR với kết quả OD của ELISA  Khảo sát mối liên hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tích. 3.3. VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu Mẫu dùng trong ly trích RNA (lách đã được xét nghiệm ELISA dương tính với kháng nguyên E2 được gởi từ Chi cục Thú y Tiền Giang, các mẫu dương tính khi tỉ số OD từ 0,3 trở lên) và phản ứng RT-PCR phát hiện gen NS5B. 18 3.3.2. Hóa chất Hoá chất dùng trong ly trích RNA tổng số  Dung dịch D là dung dịch ly giải tế bào: 2 M guanidium thiocyanate 25 mM sodium citrate 0,5% sarkosyl (w/v)  100 mM -mercaptoethanol, pH7  2 M sodium acetate, pH4  Phenol  Chloroform  Isopropanol  Ethanol 75% Hoá chất dùng trong điện di gel biến tính  Dung dịch đệm: 10X MOPS electrophoresis buffer (500 ml), thành phần:  0,2 M MOPS (pH7)  20 mM sodium acetate  10 mM EDTA  Dung dịch nạp mẫu: 10X formaldehyde gel-loading buffer (10 ml), thành phần:  50% glycerol  10mM EDTA  0,25% (w/v) bromophenol blue  0,25% (w/v) xylene cyanol Hoá chất và dụng cụ trong điện di gel TBE  Dung dịch đệm TBE 50X  Tris 242 g/l  Boric acid 57.1 ml/l  EDTA 0.5M pH 8.0 100 ml/l 19  Agarose (Biorad)  Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 10X (20% Ficoll 400; 0,1 M disodium EDTA, pH 8; 1% sodium dodecyl sulfate; 0,25% bromphenol blue; 0,25% cylene cyanol)  Dung dịch ethidium bromide (dung dịch stock 1000X 0,5 mg/ml: 50 mg ethidium bromide, 100 ml H2O. Dung dịch sử dụng 0,5 µg/ml pha loãng 1:1000 cho gel hoặc dung dịch nhuộm – bảo quản tránh ánh sáng).  Thang DNA chuẩn  Bộ dụng cụ điện di nằm  Bộ nguồn điện một chiều  Lược gel  Khuôn đổ gel  Micropipette các loại. Hoá chất dùng trong phản ứng RT-PCR  Rnase-free water  Buffer PCR  MgCl2  dNTPs  Mồi xuôi  Mồi ngược  Taq polymerase  Rnasin  MMLV reverse trancriptase  Triton X–100 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM  Thí nghiệm 1: Kết tủa RNA ly trích ở các nồng độ LiCl khác nhau LiCl là một tác nhân khử nước mạnh, với đặc tính hoà tan RNA thấp hơn DNA do đó muối LiCl nồng độ cao được sử dụng để kết tủa RNA (Sambrook và 20 Russell, 2001). Để khảo sát hiệu quả kết tủa của muối LiCl với RNA, trong quá trình ly trích mẫu chúng tôi thực hiện thu tủa RNA với các nồng độ muối LiCl khác nhau. Từ đó chọn nồng độ muối LiCl thích hợp nhất trong thu tủa RNA, đưa ra quy trình tách chiết RNA thích hợp. Thí nghiệm này được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Gồm 4 nghiệm thức (LiCl 1,0 M; LiCl 1,5 M; LiCl 2,0 M; LiCl 2,5 M), mỗi nghiệm thức được lặp lại trên 5 mẫu. Chỉ tiêu khảo sát là tỉ số OD, hàm lượng RNA thu được và sản phẩm RT- PCR thu được từ các mẫu. So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức, chọn ra nghiệm thức thích hợp nhất.  Thí nghiệm 2: Thử nghiệm hàm lƣợng Taq khác nhau trong phản ứng RT-PCR Hàm lượng Taq được khuyến cáo trong khoảng 1 – 2,5 UI trên 100 µl dung dịch phản ứng. Nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không chuyên biệt (Bùi Chí Bửu, 1999). Vì vậy, bước đầu chúng tôi thực hiện thí nghiệm thay đổi lượng nhỏ nồng độ Taq trong phản ứng. Thí nghiệm được thực hiện trên 5 mẫu khác nhau, mỗi mẫu được chạy phản ứng RT-PCR với 2 nồng độ Taq khác nhau là 2,0 UI và 2,5 UI. Chỉ tiêu khảo sát thí nghiệm này là tỉ lệ mẫu thực hiện phản ứng thành công và băng sản phẩm RT-PCR được điện di trên gel 2%.  Khảo sát 3: So sánh kết quả OD của ELISA với kết quả RT-PCR Nhằm khảo sát có hay không sự phụ thuộc kết quả RT-PCR với tỉ số OD của ELISA Với 23 mẫu bệnh phẩm có kết quả OD của ELISA phát hiện kháng nguyên E2 được gởi từ Chi cục Thú y Tiền Giang so sánh với kết quả RT-PCR chúng tôi thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trường Đại học Nông Lâm. 21  Khảo sát 4: Khảo sát mối liên hệ giữa đặc điểm bệnh tích của những heo chẩn đoán dƣơng tính với bệnh DTH bằng phƣơng pháp RT-PCR Bệnh DTH với các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích không đều nhau và có nhiều biến đổi không điển hình. Vì vậy, chúng tôi xem xét những mẫu dương tính trong phương pháp chẩn đoán RT-PCR có những đặc điểm bệnh tích như thế nào. Khảo sát được thực hiện dựa trên kết quả RT-PCR khuếch đại gen NS5B ở 23 mẫu lách với những đặc điểm bệnh tích nghi ngờ bệnh DTH (lịch sử mẫu được gởi từ Chi cục Thú Y Tiền Giang). 3.5. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.5.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm Lấy mẫu khi heo có một số bệnh tích nghi ngờ của DTH như sau: Da xuất huyết Gan xuất huyết, hoại tử Lách xuất huyết, nhồi huyết hoặc hoại tử ở rìa lách Thận xuất huyết, xung huyết Phổi xuất huyết, tụ huyết, hoại tử hoặc phổi hoá gan (màu sắc giống gan, thả vào nước bị chìm) Tim xuất huyết Dạ dày xuất huyết Ruột xuất huyết hình cúc áo Mẫu bệnh phẩm là lách đã được xét nghiệm ELISA phát hiện kháng nguyên E2 dương tính. Lấy khoảng 100 g mẫu cho vào túi nilông vô trùng được bảo quản trong bình đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở nhiệt độ -700C tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cho đến khi xét nghiệm. 22 3.5.2. Ly trích RNA tổng số  Mẫu có thể đƣợc xử lý theo 2 cách:  Mẫu bệnh phẩm lách được nghiền trong dịch PBS để thu huyền dịch tế bào (tỉ lệ mẫu so với dịch PBS là 20%) Các bước tiến hành: Bước 1: Cắt một phần lách cho vào cối, dùng kéo cắt nhỏ, cho một lượng dịch PBS tương ứng vào, dùng chày nghiền nhuyễn cho đến khi không còn cặn. Bước 2: Thu dịch nghiền vào eppendorf lớn, giải đông 3 lần. Bước 3: Ly tâm 5000 vòng/10 phút ở 40C Bước 4: Thu dịch tế bào, bỏ cặn. Dịch tế bào thu được bảo quản ở -700C cho đến khi tiến hành ly trích mẫu.  Mẫu bệnh phẩm nghiền trong nitơ lỏng -1960C để thu mẫu ở dạng bột nhuyễn. Các bước tiến hành: Bước 1: Cối chày được làm lạnh với nitơ lỏng -1960C, cắt một lượng mẫu cho vào cối chày, đổ vào một lượng nhỏ nitơ, dùng chày nghiền nhuyễn. Bước 2: Khi mẫu đã ở dạng bột nhuyễn, thu mẫu với lượng khoảng 30 mg cho vào mỗi eppendorf. Mẫu được bảo quản ở -700C cho đến khi sử dụng.  Tiến hành ly trích RNA tổng số Nguyên tắc ly trích RNA từ mẫu dịch tế bào dựa theo quy trình của Chomezynski và Sacchi (1987): Dịch tế bào được đồng nhất chung với dung dịch D và -mercaptoethanol nhằm phá vỡ màng tế bào phóng thích ra các thành phần nội bào (DNA, RNA, protein…). Đồng thời guanidium thiocyanate có trong dung dịch D làm biến tính protein mạnh và ức chế hoạt động của Rnase. Phenol, chloroform cho vào tiếp sau đó nhằm kết tủa protein và pH4,0 của phenol có tác dụng kéo DNA vào pha phenol. Ly tâm tốc độ cao nhằm thu được dịch trong bên trên chứa RNA, nhiệt độ lạnh hạn chế sự phân huỷ RNA. 23 Dịch trong thu được ủ với ethanol bổ sung LiCl nhằm kết tủa đặc hiệu RNA. LiCl là một tác nhân khử nước mạnh, với đặc tính hoà tan RNA thấp hơn DNA do đó được dùng để kết tủa RNA với nồng độ cao LiCl (Sambrook và Russell, 2001). Tủa RNA được rửa với ethanol 75% từ 2-3 lần nhằm loại bỏ LiCl, giảm nồng độ ethanol ban đầu. Tủa RNA sau khi được làm khô thì hoà tan trong nước đã được khử với DEPC và bảo quản ở -700C nhằm tránh sự phân huỷ của Rnase. Các bước tiến hành ly trích:  Hút khoảng 350 µl dịch tế bào vào ống eppendorf.  Cho vào 500 µl dung dịch D và 3,6 µl -mercaptoethanol.  Đồng nhất mẫu, vortex trong 10 giây.  Sau đó cho thêm 50 µl sodium acetate 2 M, pH 4,0; 500 µl phenol bão hoà pH4,0; 100 µl chloroform.  Dùng micropipet trộn đều để đồng nhất mẫu, vortex 10 giây.  Làm lạnh trên đá khoảng 15 phút.  Li tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C.  Hút khoảng 400 µl dịch nổi, thêm 400 µl ethanol + LiCl và giữ ở -200C trong 1 giờ.  Li tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút, bỏ dịch nổi, thu tủa.  Rửa tủa bằng ethanol 75%, votex nhẹ, li tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút, thu tủa (rửa 2 lần).  Hút bỏ dịch nổi, tủa làm khô tự nhiên trong không khí khoảng 45 phút. Hoà tan với 30 µl nước đã khử DEPC. Định lƣợng RNA bằng quang phổ kế Đo độ tinh sạch và hàm lượng RNA sau khi ly trích bằng quang phổ kế (model HP 8453) ở bước sóng 230 nm, 260 nm và 280 nm Cách tiến hành: Curvet được rửa sạch 2 lần với nước đã khử DEPC. Hút 995 µl nước đã khử DEPC cho vào curvet, sau đó thêm 5µl mẫu → trộn đều → độ pha loãng 200 lần. Cuối cùng là đặt curvet vào máy để đo OD. 24 Độ tinh sạch của RNA được tính bằng tỉ số OD260nm /OD280nm và tỉ số OD260nm /OD230nm . Tỉ số OD260nm/OD280nm đạt 1,8-2,0 thì xem như RNA ly trích tương đối sạch. Tỉ số này sẽ thấp hơn khi nhiễm protein hay phenol. Tỉ số OD260nm/OD230nm đạt 1,5-2,0 coi như RNA ít tạp nhiễm, tỉ số này thấp hơn khi bị nhiễm guanidium thicyocyanate trong những bước kết tủa. Hàm lượng RNA được tính theo công thức: Hàm lƣợng RNA (ng/µl) = WL1 (OD260nm)* 40 ng/µl* Độ pha loãng Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ 40 ng/µl cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998) RNA ly trích có thể dùng để thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR. Kiểm tra RNA bằng điện di biến tính: Xem kết quả có xuất hiện 2 band chuẩn 18S, 28S. Nếu kết quả có xuất hiện 2 band 18S và 28S thì quá trình ly trích RN